Detección del potencial de membrana de las mitocondrias CLIC4 HN4 inducida por la caída de la célula Apoptosis In Vitro

Resumen

Aquí presentamos un protocolo detallado para la aplicación de la rodamina 123 para identificar el potencial de la membrana mitocondrial (MMP) y estudiar CLIC4 caída inducida HN4 celular apoptosis in vitro. Bajo microscopio de fluorescencia común y el microscopio de la fluorescencia láser confocal, se registró el cambio en tiempo real de la MMP.

Resumen

Agotamiento del potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) se considera el evento más temprano en la cascada apoptótica. Incluso se produce por delante de apoptotic nuclear características, incluyendo la condensación de la cromatina y la rotura de ADN. Una vez que los colapsos MMP, apoptosis celular iniciará irreversible. Una serie de colorantes catiónicos lipofílicos puede pasar a través de la membrana celular y agregado dentro de la matriz de la mitocondria y servir como marcador de fluorescencia para evaluar cambio MMP. Como uno de los seis miembros de Cl^– familia canal intracelular (CLIC), CLIC4 participa en el proceso de apoptosis de la célula principalmente a través de la vía mitocondrial. Aquí describimos un protocolo detallado para medir MMP mediante monitoreo de la fluctuación de la fluorescencia de rodamina 123 (Rh123), a través del cual estudiamos apoptosis inducida por CLIC4 caída. Discutimos las ventajas y limitaciones de la aplicación de láser confocal de barrido y microscopio de fluorescencia normal en detalle y también Comparar con otros métodos.

Introducción

Rh123 es un colorante catiónico de la fluorescencia, que sirve como un indicador de potencial transmembrana. Rh123 es capaz de penetrar la membrana celular y entrar en la matriz mitocondrial dependiendo de la diferencia de potencial dentro y fuera de la membrana¹. Apoptosis lleva a daño de la integridad de la membrana mitocondrial. El poro de transición de permeabilidad de mitocondria (MPTP) abrirá y conducir al colapso de la MMP, que a su vez resulta en la liberación de Rh123 hacia el exterior de la mitocondria. Por último, se detectarán más fuerte señal de fluorescencia verde bajo microscopio de fluorescencia. Está bien documentado que el ago....

Protocolo

1. cultura y transfección de la célula

1. Cultivo de células
   Nota: HN4, una línea celular HNSCC, fue derivado de pacientes con HNSCC¹⁴.
   1. Células en cultivo HN4 en de Dulbecco modifican Eagle suplementado (DMEM, glucosa de 4.5 g/L) con 10% suero fetal bovino y antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina). Incube las células a 37 ° C con 5% CO₂.
2. Transfección de la célula
   1. Un día antes de la transfección, la placa de 5 x 10⁵ células en 2 mL/pozo del medio de cultivo sin antibióticos en placas de 6 pocillos.
   2. Dilu....

Resultados

En el presente estudio, se aplicó Rh123 para detectar la MMP. Inicialmente, las células HN4 fueron cultivadas para la fluorescencia siguiente experimentos de tinción. Pinzas se usaron para colocar cubreobjetos circulares en la parte inferior de las placas de 6 pocillos (figura 1A). El cubreobjetos se cubrieron con polylysine durante 5 minutos y luego se retira el polylysine mediante pipeta (figura 1B

Discusión

Está bien documentado que Cl⁻ canales son esenciales para mantener la hemostasia del ambiente interno y desempeñan un papel importante en la proliferación celular y apoptosis^15,16. Por lo tanto, entender la relación entre la intervención orientada a canales de iones y de la apoptosis es de gran necesidad e importancia para encontrar un mejor enfoque terapéutico para diversos tipos de cáncer¹⁷. Las mitocondrias mantienen el estad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HNSCC	ATCC	CRL-3241
Polylysine	Thermo Fisher Scientific	P4981
Specific siRNA for human CLIC4	Biomics	NM_013943	(números de accesiones, NM_013943; correspondientes a la secuencia de ADNc 5-GCTGAAGGAGGAGGAGGACAAAGA-3) y siRNA revuelto (5 ACGCGUAACGGGGGAAUUU-3) de Biomics Company
Reactivo de transfección Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	L3000-015
Opti-MEM I Medio Sérico Reducido, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure grede	Thermo Fisher Scientific	R22420
Dulbecco' medio Eagle modificado (DMEM, 4,5 g/L de glucosa)	Gibco	11965-084
Suero fetal bovino, calificado, Australia Origen	Gibco	10099141
Solución de tripsina-EDTA	Beyotime	C0201
Antibiótico-Antimicótico, 100X	Gibco	15240062
Microscopía confocal de barrido láser	Leica Microsystems GmbH	LEICA. Microscopio invertido SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300	Nikon	N/A
Metaflour, V7.5.0.0	Universal Imaging Corporation	N/A Conjunto
aplicaciones Leica, v2.6.0.7266	Leica Microsystems GmbH	N/A
Microsoft Office Excel 2007	Microsoft	N/A
Sigma Plot 12.5	Systat Software	N/A
Cámara de celda Attofluor	Thermo Fisher Scientific	A7816

Se diseñaron y obtuvieron células de