Artículo de método

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

DOI:

10.3791/56319

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23 de octubre de 2017

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1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

En este artículo

Resumen

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Se describe un método fácil, rápido y relativamente barato para la generación de gene-disrupted Streptococcus mutans cepas; Esta técnica puede ser adaptada para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

Resumen

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Métodos típicos para la aclaración de la función de un gen en particular implican Analisis comparativo fenotípicas de la cepa de tipo salvaje y una cepa en la que el gen de interés se ha visto alterado. Una construcción de DNA gen-interrupción que contiene un gen marcador de resistencia antibiótica adecuada es útil para la generación de cepas alterado por la gen en la bacteria. Sin embargo, métodos de construcción convencionales, que requieren medidas clonaje de genes, implican protocolos complejo y desperdiciador de tiempo. Aquí, se describe un método relativamente fácil, rápido y rentable para la interrupción de genes específicos en Streptococcus mutans . El método utiliza una fusión de paso 2 reacción en cadena polimerasa (PCR) para generar el concepto de interrupción y electroporación para transformación genética. Este método no requiere de una reacción enzimática, que no sea de la polimerización en cadena y además ofrece una mayor flexibilidad en cuanto al diseño de la construcción de la interrupción. Empleo de la electroporación facilita la preparación de células competentes y mejora la eficiencia de transformación. El presente método puede adaptarse para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

Introducción

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Análisis de la función génica implica típicamente una comparación fenotípica entre una cepa de tipo salvaje y una cepa en la que un determinado gen de interés se ha visto alterado. Esta técnica de interrupción génica se ha utilizado para el análisis de la función del gene en una amplia gama de especies, desde bacterias hasta mamíferos. Un constructo gene-interrupción es necesario para la generación de la cepa gen interrumpido; Esta construcción de ácido desoxirribonucleico (ADN) consiste en el gen marcador de resistencia a los antibióticos sobre el upstream y downstream flanqueando las regiones del gen blanco y se incorpora en el genoma por recombinación homóloga. La cepa gen interrumpido puede ser aislada usando medios selectivos que contienen el antibiótico. El método convencional utilizado para la construcción de la cepa gen interrumpido requiere medidas complejas, como la amplificación del gen por reacción en cadena de polimerasa (PCR), la ligadura del gen en un plásmido adecuado, digestión con restricción de destino enzimas y religación para insertar el gen marcador de resistencia a antibióticos. Este proceso es lento, tomando varios días a varias semanas, dependiendo el éxito de cada paso. Además, el diseño de construcciones de la interrupción depende de los sitios de la enzima de la restricción del gene blanco. Para resolver estos problemas, se han reportado DNA Polimerización en cadena-basado que empalma métodos1,2 para el diseño de mutantes gene-disrupted de Dictyostelium discoideum3 y Synechocystis SP. PCC68034 . En el presente estudio, se desarrolló un método para generar una cepa estreptocócica gen interrumpido de una manera relativamente rápida, fácil y de bajo costo, utilizando un método modificado basado en PCR (señalado paso 2 fusión PCR) para la construcción de la interrupción construcción y electroporación para transformación genética.

La fusión de 2-step que PCR requiere de ADN genómico, el gen marcador de resistencia a los antibióticos como una plantilla PCR y cuatro pares de apropiadamente diseñado cartillas del oligonucleótido. En el primer paso (1st de PCR), una región que flanqueaba aguas arriba de 1 kb del gene del destino, una región que flanqueaba aguas abajo de 1 kb del objetivo gen y el gen marcador de resistencia a antibióticos se amplifican por PCR. Las regiones 5' de la cartilla reversa y la cartilla hacia adelante, para la amplificación de la aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones, respectivamente, incluyen 15 bases complementarios a los extremos del gen marcador. Las 5' regiones de avance y retroceso primers para la amplificación del gen marcador igualmente incluyen 15 bases complementarias a la parte inferior de la región que flanqueaba por aguas arriba de la gene de la blanco y el extremo superior de la región que flanqueaba corriente abajo del gen blanco, respectivamente. Por lo tanto, los tres fragmentos amplificados contienen regiones de 30-pares superpuestos en el sitio de fusión. En el segundo paso (2nd PCR), PCR se realiza con las cartillas PCR anidadas utilizando los tres fragmentos amplificados por la 1st PCR como plantillas. Las regiones complementarias de las plantillas están además vinculadas entre sí a través de la 2nd PCR. Por último, la construcción para la recombinación homóloga es introducida a la cepa de tipo salvaje por electroporación. Interrupción génica exitosa puede ser verificada por PCR usando las cartillas específicas. Aunque el concepto de interrupción se amplifica utilizando la DNA polimerasa de alta fidelidad, reacciones enzimáticas adicionales, tales como la ligadura de la DNA o digestión de DNA, no son necesarias para generar la construcción. Además, una región eliminada o conservada en el genoma puede ser elegida fexiblemente según primer diseño.

En el presente trabajo, canceladura de la región entera de la codificación del gene gtfC , que codifica la glucosiltransferasa de Streptococcus mutans, se realizó para demostrar el método de interrupción del gene rápido, fácil en una especie estreptocócica. Además, un gtfB-alteración de la tensión se generó de la misma manera. Glucosiltransferasas codificados por gtfB y gtfC contribuyen a cariogénicas biofilm dental desarrollo5,6. Las capacidades de formación de biofilm del tipo tensión (S. mutans WT), gtfC-interrumpió cepa (S. mutans ΔgtfC) y gtfB-tensión interrumpida (S. mutans ΔgtfB) se evaluaron análisis fenotípico comparativo. Este protocolo extiende la aplicación de un método de dos etapas para la interrupción del gene de una especie adicional y puede ser modificado para los estudios de función del gen en una amplia gama de taxa.

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Protocolo

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1. primer diseño

  1. preparar iniciadores para polimerización en cadena de la fusión de 2 pasos y verificación de la interrupción del gene.
    Nota: La tabla 1 muestra las secuencias de la cartilla utilizadas en el presente Protocolo. la figura 1 muestra una ilustración esquemática del método PCR de fusión de 2 pasos para generar Δ de S. mutans gtfC.
    1. Cartillas de diseño para el reemplazo de la región de destino en el genoma con la resistencia a la espectinomicina gene (spc r) 7. Este protocolo sustituye a la región entera de la codificación del gene gtfC spc r.
    2. Son 15 bases complementarios a los extremos superiores e inferiores de spc r en el 5 ' regiones para arriba-atrás y abajo hacia delante cartillas, respectivamente. Asimismo, incluyen 15 bases complementarias para el extremo inferior de las regiones que flanquean arriba de gtfC y el extremo superior de las regiones que flanquean aguas abajo de la gtfC en el 5 ' regiones de spc r-hacia adelante y spc r -reversa cartillas, respectivamente ( figura 1A).
      Nota: Las secuencias de arriba-atrás, abajo-adelante, spc r - adelante y spc r - invierta cartillas se determinan automáticamente dependiendo del sitio de incorporación de la construcción de interrupción.
    3. Diseño de los cebadores para arriba-hacia adelante y hacia abajo-atrás para abarcar > kb 1 aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones del gen gtfC, respectivamente. Ajustar la temperatura de fusión (T m) de arriba hacia delante y abajo-inversa cartillas de acuerdo con la temperatura de fusión de los primers para arriba-atrás y abajo hacia delante, respectivamente ( figura 1A).
      Nota: Refiérase a la siguiente fórmula para determinar T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, donde * N representa el número de nucleótidos de la cartilla con la identidad especificada (A, T, C o G).
    4. Diseño de iniciadores anidados (N_up adelante y N_up-reversa) para la 2 nd PCR ( figura 1B).
      Nota: Aunque el par exterior cartilla (arriba-adelante y atrás abajo) puede usarse como iniciadores para la 2 nd PCR, cebadores anidados (N_up adelante y N_up-reversa) fueron diseñados en el presente Protocolo. Cebadores anidados son con frecuencia necesarios para 2 nd PCR, como se indica en los Resultados de representante.
    5. Cartillas de diseño específicas para spc r. Las imprimaciones se utilizan para Colonia PCR para detectar interrupción gtfC.
      6. Interrupción
    6. cartillas de diseño para la verificación de gtfC.
      Nota: Los productos PCR amplificados con estos iniciadores unen la frontera entre gtfC o spc r y aguas arriba o aguas abajo que flanquean regiones de gtfC. Los conjuntos de primer ' gtfC arriba-adelante y gtfC arriba-atrás ' y ' gtfC abajo-adelante y gtfC down-marcha ' específicos para gtfC, y ' gtfC arriba-adelante y spc r 2 -inversa ' y ' spc r 2-avance y gtfC down-marcha ' específicos para spc r.

2. La extracción de ADN genómico de S. mutans

s
  1. stock de racha mutan S. UA159 sobre una placa de agar cerebro corazón infusión (BHI). Incube la placa durante la noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  2. Recoger una colonia solo usando un palillo esterilizado e inocular en 5 mL de caldo BHI. Incubar la cultura durante la noche a 37 ° C en condiciones anaerobias S. mutan.
  3. Centrifugar el cultivo celular bacteriana durante 15 min a 2.000 x g. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  4. Centrifugar 15 min a 2.000 x g. Resuspender el precipitado de células en 200 μL de PBS.
  5. Extraer la DNA de genomic de la suspensión mediante un kit de extracción DNA genómico grano-paliza-base según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
    1. Transferencia de la suspensión a una muestra de 2,0 mL del tubo que contiene perlas de vidrio (incluidos en el kit). Añadir 750 μl de solución de lisis (incluido en el kit) a la suspensión celular.
    2. La tapa firmemente y colocar los tubos simétricamente en el soporte del tubo del aparato de interrupción del talón-golpes. Proceso a la velocidad máxima durante 5 minutos. Centrifugar el grano golpeado las muestras durante 1 min a 10.000 x g. transferir el sobrenadante al filtro de centrifugado (incluido en el kit) en un tubo de la colección de 2,0 mL y centrifugar durante 1 min a 7.000 g × .
      3. Buffer de
    3. 1.200 añadir μl de DNA obligatorio (incluido en el kit) para el filtrado. Transferir 800 μl de la mezcla a la columna de spin (incluida en el kit) a un tubo de la colección de 2.0 mL y centrifugue durante 1 min a 10.000 x g.
    4. Descartar el flujo a través, añadir 200 μL de tampón de prelavado (incluido en el kit) a la columna de vuelta para lavar la matriz de la columna y centrifugue durante 1 min a 10.000 x g. descarte el flujo a través, Añadir 500 μl de tampón de lavado (incluido en el kit) a la vuelta columna a la matriz columna de lavado y centrifugue durante 1 min a 10.000 x g.
    5. Colocar la columna de spin a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL y añadir 100 μl de tampón de elución (incluido en el kit) a la matriz columna.
    6. Centrifugar por 30 s a 10.000 x g para eluir el ADN genómico. Estimar la concentración de ADN y la pureza midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nmusing un espectrofotómetro y confirmar que el un /A 260 280 ratio es mayor que 1.8.

3. Amplificación de la polimerización en cadena

  1. realizar la 1 st polimerización en cadena usando el genoma de S. mutan s WT y el gen sintético spc r como plantillas PCR (ver cuadro 1). Amplificar la región que flanqueaba río arriba del gen gtfC, la región que flanqueaba aguas abajo del gen gtfC y el gen de spc r utilizando los tres tipos de cebadores descritas anteriormente ( figura 1A), como por La tabla 2 y tabla 3.
    Nota: Cartillas, reactivos y ciclos de amplificación de PCR se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
  2. Fraccionar cada producto PCR en un gel de agarosa 1% y suprimir las bandas correspondientes usando un cortador de banda gel.
  3. Purificar cada producto amplificado de DNA de los geles con un spin columna y sílice gel de membrana kit de extracción de.
    1. Transferencia las rodajas de gel a una microcentrífuga limpiarla del tubo y mezclan con 500 μl de binding buffer (incluido en el kit). Incubar la mezcla a 55 ° C durante 15 minutos hasta que las rodajas de gel se disuelvan completamente.
    2. Coloque la columna de spin (incluida en el kit) en un tubo de recogida (incluido en el kit), cargar la muestra en la columna de vuelta y centrifugar por 30 s en 11.000 × g. Descartar el flujo a través, añadir 600 μl de tampón de lavado (incluido en el kit) a la columna de la vuelta a lavar la membrana de silicona y centrifugar por 30 s en 11.000 × g.
    3. Descartar el flujo y centrifugar durante 2 min a 11.000 × g secar la membrana de silicona.
    4. Coloque la columna de vuelta en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 50 μl de tampón de elución (incluido en el kit) e incubar a temperatura ambiente durante 2 min
    5. Centrifugar durante 2 min a 11.000 × g a fin de eluir el ADN amplificado. Estimar la concentración de ADN y la pureza midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nmusing un espectrofotómetro y confirmar que el un /A 260 280 ratio es mayor que 1.8.
  4. Realizar los 2 nd polimerización en cadena de la fusión de 2-step PCR utilizando los tres fragmentos aproximadamente equimolares como plantillas de PCR, según tabla 2 < /stRong > y tabla 3.
    Nota: Estos fragmentos fueron amplificados y empalmar usando los cebadores anidados ' N_up adelante y atrás N_down ' o los iniciadores exteriores ' arriba-hacia adelante y hacia abajo-atrás ' ( figura 1B). Cebadores PCR, reactivos y ciclos de amplificación se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
  5. Una décima parte de la mezcla de reacción de PCR (5 μl) en un gel de agarosa al 0,8% de la carga y comparar el tamaño de banda amplificado con el tamaño esperado de la banda para confirmar la generación de los productos apropiados ( figura 1).
  6. Concentran el restante producto final de PCR por la precipitación del etanol sin purificación.
    1. Añadir 55 μl de ultra pura agua a la mezcla restante de la polimerización en cadena para ajustar el volumen total de 100 µL.Add un volumen de una décima parte de 3 M acetato de sodio (10 μl), pH 5.2, seguido de 2,5 volúmenes de etanol al 100% (250 μL). Mezclar y congele durante 30 min a -80 ° C.
    2. Centrifugar 20 min a 15.000 × g a 4 ° C, busque el sedimento en el fondo del tubo y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de etanol al 70%, centrifugar durante 5 min a 15.000 × g a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Secar el pellet por aproximadamente 30 min y disolver con 10 μl de agua ultra pura.

4. Competente preparación celular y transformación celular

s
  1. stock de racha mutan S. UA159 sobre una placa de agar BHI. Incube la placa durante la noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  2. Recoger una colonia solo usando un palillo esterilizado e inocular en 5 mL de caldo BHI. Incubar la cultura durante la noche a 37 ° C en condiciones anaerobias S. mutan.
  3. Transfiera 2 mL de la cultura S. mutan a 50 mL de caldo BHI e incubar durante 6-8 h a 37 ° C a una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0.2-0.4 bajo condiciones anaeróbicas.
  4. Centrifugar las células durante 15 min a 2.000 × g a 4 ° C, eliminar el sobrenadante y lavan las células dos veces con 40 mL de agua helada seguida por 40 mL de glicerol al 10%.
    Nota: Las sustancias residuales afectan posterior electroporación.
  5. Aspire el sobrenadante con una pipeta Pasteur, se reduce la adherencia del precipitado de células en glicerol al 10%. Resuspender las células en 1 mL de glicerol al 10% fresco, añada 50 μl de la suspensión en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-80 ° C hasta justo antes del uso.
  6. Mezcle la alícuota de 50 μl de células competentes heladas con 5 μl de la construcción de la interrupción descrita en la sección 3. Añadir la mezcla a cubetas de electroporación (con un 0,2 cm de distancia entre electrodos). Emplear el modo de Staphylococcus aureus (1,8 kV, 10 μF, Ω 600, 1 pulso) del aparato de electroporación para electroporate.
  7. Suspender las células en 500 μl de caldo BHI inmediatamente después de la electroporación y añadir 50 μl de la suspensión a las placas de BHI agar que contiene espectinomicina.
    Nota: Incubación de Extra tiempo después de la electroporación no es necesaria. Sin embargo, incubación de 1-2 h después de la electroporación puede mejorar la eficiencia de transformación.
  8. Incube la placa durante 2-6 días a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
    Nota: S. mutans Δ gtfB es construido como se describe anteriormente. La región entera de la codificación de los genes gtfB se sustituye por eritromicina resistencia gene 8 en Δ de S. mutans gtfB. Cada cepa de S. mutans se cultiva en caldo BHI a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.

5. Verificación de la interrupción del Gene y almacenamiento

  1. elegir colonias al azar e inocular en la mezcla de PCR para llevar a cabo colony PCR según la tabla 2 y tabla 3. Cebadores PCR, reactivos y ciclos de amplificación se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
  2. Carga la mezcla de reacción de PCR en gel de agarosa al 1% para confirmar el proceso estadístico r-banda de DNA específico.
  3. Elegir la Colonia positiva utilizando un palillo esterilizado y subcultura células en 10 mL de BHI que contiene espectinomicina caldo durante 2 días a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  4. Verificar la generación de S. mutans Δ gtfC.
    1. La suspensión de células se dividen igualmente. Extracto de ADN genómico de las células descritas anteriormente (pasos 2.3. a 2.5.5.). Realizar PCR con ADN genómico como la plantilla de la polimerización en cadena usando las cartillas para la verificación de la interrupción de la gtfC (tabla 1) según la tabla 2 y tabla 3.
      Nota: Las cartillas PCR, reactivos y ciclos de amplificación se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
    2. La mezcla PCR en gel de agarosa al 2% de la carga y comparar el tamaño de banda amplificado con el tamaño esperado de la banda para confirmar la generación de los productos adecuados .
    3. Centrifugar la suspensión de células restantes durante 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de PBS.
    4. Centrifugar 15 min a 2.000 x g a 4 ° C. Resuspender la celda de pellets en 1,5 mL de caldo BHI con 25% de glicerol y almacenar de-80 ° Cor -20 ° C.

6. Análisis fenotípico

  1. racha de cada cepa de s de S. mutan en una placa de agar BHI. Incube la placa durante la noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  2. Recoger una colonia solo usando un palillo esterilizado e inocular en 2 mL de caldo BHI con o sin un antibiótico apropiado. Incubar durante una noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  3. Inocular 20 μl de la suspensión durante la noche de la cultura en 2 mL de caldo BHI con sacarosa 1% o 5% sin antibióticos en un tubo de vidrio, las células con el tubo de ensayo en posición inclinada durante la noche a 37 ° C en condiciones anaerobias de la cultura.
    4. Tubos de ensayo
  4. vortex el vidrio para 10 s y decantar suspensiones de cultura. Lavar los tubos de prueba tres veces con agua destilada. Añadir 1 mL de 0.25% Coomassie brilliant blue (CBB) a los biofilms la mancha en la pared del tubo y luego incubar 1 minuto
  5. Decantar la solución de tinción, lavar los tubos de prueba tres veces con agua destilada y secar los tubos de ensayo.
  6. Evaluar la densidad de color y extensión del CBB manchado-biofilm visualmente para determinar la capacidad de formar biofilm en un análisis fenotípico.

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Resultados

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La figura 2 muestra el tamaño de cada producto desde la 1st PCR, como se observa en el gel de agarosa al 1%, fue en buen acuerdo con el tamaño previsto de aproximadamente 1 kb. La figura 3 muestra el análisis de electroforesis de gel de los productos de la 2y PCR. La figura 4 muestra las colonias de S. mutans transformadas con la construcción de la interrupción y un aná...

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Discusión

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En el presente Protocolo, deberán diseñarse los iniciadores 1st PCR para amplificar 1 kb aproximadamente aguas arriba y aguas abajo flanqueando las regiones de la región de destino en el genoma. Tales secuencias largas que flanquean son necesarios para mejorar la eficacia de la recombinación homóloga.

Las secuencias de los cebadores (arriba-atrás, abajo-adelante, spcr-adelante y spcr-reversa) en el presente Protocolo se determina automáticamen...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia [números de concesión 16 K 15860 T.M. y 15 K 15777 N.H.].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Streptococus mutanscepa en el laboratorio.Cepa de tipo salvaje (Cepa UA159)
Kit de extracción de ADN genómicoZymo ResearchD6005
Aparato de disrupción de batido de cuentasTaitecGM-01
Genes sintéticosEurofins GenomicsGen de resistencia a la espectinomicina y a la eritromicinaordenado a medida
TermocicladorAstecPC-708
Imprimaciones PCREurofins GenomicsPedido a medida35 bases de
ADN polimerasaTakaraR045AKit de extracción en gel de ADN polimerasa de alta fidelidad
Nippon GeneticsFG-91202Extracción de ADN a partir de gel de agarosa
Cortador de banda de gelNippon GeneticsFG-830
EspectrofotómetroBeckman CoulterDU 800
ElectroporadorBio-rad1652100
Cubeta de electroporaciónBio-rad1652086espacio de 0,2 cm
AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03Sistema de cultivo anaeróbico
Caldo de infusión cerebro-corazónBecton, Dickinson237500Medios de cultivo bacteriano
SpectinomycinWako195-11531Antibióticos
EritromicinaWako057-07151Antibióticos
SacarosaWako196-00015Para el desarrollo de biopelículas
CBB R-250Wako031-17922Para la tinción de biopelículas
de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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