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Artículo de método

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

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DOI:

10.3791/56325

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12 de octubre de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

En este artículo

Resumen

Describimos aquí un ensayo fluorométrico sin células bioquímico para la determinación de la peroxidación lipídica HDL. Este ensayo rápido y reproducible puede ser utilizado para determinar la función del HDL en estudios a gran escala y puede contribuir a nuestra comprensión de la función del HDL en enfermedad humana.

Resumen

Los niveles de colesterol (HDL-C) bajo lipoproteína de alta densidad son uno de los más poderosos predictores independientes negativos de enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV). La estructura y la función del HDL en lugar de C-HDL pueden predecir con mayor precisión la ateroesclerosis. Varios HDL proteína y lípidos composición que deterioran la función del HDL cambios en Estados inflamatorios tales como la ateroesclerosis. Función de HDL suele determinarse por célula basado en ensayos tales como ensayo de eflujo de colesterol pero estos ensayos tienen falta de desventajas numerosas de estandarización. Ensayos libres de células pueden dar medidas más sólidas de la función del HDL en comparación con ensayos de célula. Oxidación de HDL deteriora la función del HDL. HDL tiene un papel importante en el transporte de peróxido de lípido y alta cantidad de peróxidos de lípidos está relacionado con la función de HDL anormal. Deben considerarse las interacciones lípido-sonda cuando ensayos de interpretación de los resultados de fluorescencia no enzimáticos para la medición del estado oxidativo de lípidos. Esto nos motivó a desarrollar un método enzimático sin células bioquímico para evaluar HDL peróxido contenido en lípidos (HDLox) que contribuye a la disfunción del HDL. Este método se basa en la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y el fluorocromo rojo Amplex que puede cuantificar (sin colesterol oxidasa) el contenido de peróxido de lípido por mg de HDL-C. Aquí un protocolo es describedfor determinación de la peroxidación de lípidos HDL usando el reactivo de fluorocromo. Variabilidad del ensayo puede reducirse por la estricta normalización de condiciones experimentales. HDLox los valores más altos están asociados con la función de antioxidante de HDL reducida. La lectura de este ensayo se asocia con lecturas de ensayos basadas en celdas validados, medidas sustitutas de enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico. Este enfoque técnico es un método robusto para evaluar la función de HDL en las enfermedades humanas donde systemic inflamación, estrés oxidativo y lípidos oxidados tienen un papel clave (como la ateroesclerosis).

Introducción

La enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV) es la principal causa de muerte en todo el mundo1,2. Estudios epidemiológicos han mostrado que niveles bajos de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) son generalmente inversamente asociados con el riesgo para el desarrollo de ateroesclerosis1,2. Aunque varios estudios apoyan un papel ateroprotectores para HDL1,2, el mecanismo por el cual HDL atenúa la iniciación y progresión de la aterosclerosis es complejo 3,4. Así, se ha sugerido que la compleja estructura y función de HDL más que absoluta pueden predecir más exactamente ateroesclerosis 5,6,7,8. Varios HDL proteína y lípidos composición que deterioran la función del HDL cambios en Estados inflamatorios tales como la ateroesclerosis. Estos i) reduce su potencial del eflujo de colesterol 9, ii) disminuir el antiinflamatorio y aumento de proteínas proinflamatorias asociadas a HDL 6,7, iii) disminución de niveles del factor antioxidante y actividad y esferoides capacidad de inhibir la oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDLox)10 y iv) aumentar el lípido hidroperóxido contenido y redox actividad (HDLox)9,11. Sólidas pruebas que evalúan las funciones de pleotropic de HDL (como el eflujo de colesterol, función antioxidante) pueden complementar la determinación de HDL-C-HDL en la clínica.

Función del HDL es evaluada generalmente por métodos basados en la célula como el eflujo de colesterol ensayo de8,13,12,14. Estos métodos tienen limitaciones importantes, incluyendo una heterogeneidad significativa en cuanto a tipos de células utilizadas, tipo de lectura registrado, falta de estandarización y los efectos de confusión de triglicéridos 7,15. Estos inconvenientes plantean dificultades para los estudios clínicos grandes16. Ensayos libres de células pueden dar medidas más sólidas de la función del HDL en comparación con ensayos de célula. El eflujo de colesterol es una de las funciones más importantes de HDL pero sólo puede ser determinado por ensayos de célula. Otros enfoques para determinar la función de HDL como proteómica17,18,19,20,21,22,23, ensayos de quimiotaxis celular monocito de HDL función 17,22,25 y 24 no se han estandarizado y no puede usarse en estudios a gran escala en seres humanos.

HDL cuenta con importantes antioxidantes ateroprotectores efecto5,6,7,8. Se ha determinado la función antioxidante de las HDL en presencia de LDL en el anterior celular gratis análisis fluorométrico 26. Estos métodos fluorométrico bioquímicos de la función de antioxidante de HDL fueron desarrollados originalmente por Mohamad Navab y Alan Fogelman y sus colegas26. Aunque muchos estudios en humanos han utilizado estos métodos para determinar HDL función 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lípidos (HDL)-lípidos (LDL) y las interacciones lípido-fluorocromo pueden limitar la reproducibilidad de estos ensayos bioquímicos no enzimáticos gratis celular de HDL función27,28.

El interés reciente se ha centrado en las consecuencias funcionales de la oxidación de HDL que es el resultado de la oxidación de lípidos y proteínas dentro de HDL 27,29,30. Estudios anteriores han demostrado que oxidación de HDL deteriora la función de HDL 27,29,30. HDL tiene un papel importante en el transporte de peróxido de lípido y alta cantidad de peróxidos de lípidos está relacionado con la función de HDL anormal. Así contenido en peróxido lipídico HDL puede ser utilizado para determinar HDL función 9,17,20,31 y dado las limitaciones conocidas de anteriores ensayos de HDL función7, 15,27,32, hemos desarrollado un método fluorométrico alternativo que cuantifica HDL lípido contenido en peróxido (HDLox) 32. Este método se basa en la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y el fluorocromo rojo Amplex que puede cuantificar (sin colesterol oxidasa) el contenido de peróxido de lípido por mg de HDL-C 32. El principio bioquímico de la prueba se muestra en la figura 1. Hemos demostrado que este enfoque basado en la fluorescencia no tiene las limitaciones del previo análisis del función de HDL de27,28. Este ensayo ha sido seguir perfeccionando y estandarizados en nuestro laboratorio, por lo que puede ser utilizado confiablemente en estudios humanos de gran escala incluso con plasma criopreservados 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lectura de este ensayo se asocia con lecturas de ensayos basadas en celdas validados, medidas sustitutas de enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. aquí, se describe este método, sencillo y robusto para medir contenido en peróxido lipídico HDL (HDLox). Este ensayo puede utilizarse como una herramienta para responder a preguntas importantes de investigación sobre el papel de la función del HDL en enfermedad humana donde systemic inflamación, estrés oxidativo y lípidos oxidados tienen un papel clave (como la ateroesclerosis)32.

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Protocolo

todos los experimentos con muestras biológicas humanas fueron realizados con la aprobación ética de la Universidad de California en Los Ángeles, Los Ángeles y el Comité de ética humana de Alfred Hospital, Melbourne.

Nota: hay muchas variaciones de la función de fluorocromo HDL ensayo (véase discusión) 32. A continuación describimos el protocolo que da los resultados más consistentes y reproducibles. Un resumen del ensayo se muestra en la figura 2.

1. procesamiento de la muestra

  1. uso del suero fresco, no hemolizadas (puede ser recogida en tubos de separador de suero) o citrato plasma obtenido después de 12-14 horas de ayuno. Si utiliza muestras criopreservadas, incluyen el control apropiado como se describe en el presente Protocolo.

2. Día 0-preparación para el ensayo de

  1. Prepare trabajo diseño de experimento con los controles adecuados, muestras y replica. Ejecute cada muestra por lo menos en triplicado. Un diseño bien representante 96 se muestra en la figura 3.
  2. Calcular todos los volúmenes de reactivos que se utilizarán para el ensayo basado en el número de muestras y repeticiones de.
    Nota: Incluye un volumen adicional de 10% en cada bolsa de trabajo para asegurarse de que hay suficiente volumen para cada reactivo del experimento específico.
  3. Etiqueta los tubos para todos los diferentes pasos del ensayo p. ej. para la separación de HDL, la medición de HDL-C (opcional) y el fluorochromeassay.

3. Día 1-preparación de controles

  1. preparación de estudio específicos combinado control
    1. crear una muestra de control de suero o plasma combinado de estudio todas las muestras. Si ejecuta 20 muestras en cada placa por triplicado, se combinan 10 μl de cada muestra en un control de 200 μL agrupados. Dar una alícuota separada de este control agrupado al laboratorio clínico para determinar el valor de HDL-C de este control.
      Nota: Utilice este control agrupado para estandarizar el análisis y dar cuenta de todo posible conocido (por ejemplo, tipo de suero matriz versus plasma, congelación y descongelación, congelación) y factores de confusión desconocidos que pueden afectar la variabilidad experimental 27 , 28.
  2. Preparación específicas del laboratorio de control de calidad (QCs)
    1. preparar un amplio stock de HDL en cada laboratorio (por ejemplo HDL aislado de 5 mL de plasma de donantes sanos 10) y criopreservar varias alícuotas de este acciones para minimizar los ciclos de congelación-descongelación.
    2. Uso por lo menos 10 diferentes replica de esta población para determinar el valor promedio de HDLox. Valores de un rango aceptable de medición HDLox para cada muestra de control de calidad incluido en cada ensayo está dentro < 15% del coeficiente de variación de este valor medio.
    3. Dar una alícuota separada de este control agrupado al laboratorio clínico para determinar el valor de HDL-C de este control (por ejemplo, 40 mg/dL).
      Nota: Un enfoque detallado cómo utilizar sangre de bancos de sangre para crear estos controles ha sido previamente descrito 27 , 28 , 32. Utilice QCs adicionales según sea necesario (por ejemplo, uno de un donante sano sabido que tienen función de HDL normal y uno de un donante conocido en gran parte anormal función de HDL.
  3. Optimización de señal de fondo y valores en blanco (opcionales)
    1. para reducir al mínimo el fondo, añadir la cantidad apropiada de catalasa (1-4 U/mL) en el medio de incubación para eliminar rápidamente la forma H 2 O 2 debido a la oxidación espontánea del aire de los amortiguadores.
      Nota: Puesto que los valores de los pocillos del blanco (no HDL) se se restan de los valores de las muestras de HDL y los resultados están siendo registrados en relación con un control combinado (que se incluye en el mismo plato bien 96), hemos encontrado que este paso no prácticamente no afectar t los resultados. Por lo tanto, optimización de la señal de fondo con la catalasa puede ser omitido, si es necesario.

4. Día 1-separación de HDL colesterol mediante precipitación de HDL

Nota: utilice un reactivo precipitante de colesterol HDL estandarizado disponible comercialmente para aislar apoB agotado suero según el fabricante ' s instrucciones. Estos reactivos son ampliamente utilizados en los ensayos colorimétricos para determinar los niveles de colesterol HDL.

  1. Fresca (o descongelar) muestra de plasma o suero.
  2. Mezclar volúmenes iguales (por ejemplo 80 μL) del plasma y el reactivo de precipitación de colesterol de HDL (20% p/v polietilenglicol en Tampón glicina a pH 10.0 (25 ° C)).
  3. Mezcla bien mediante pipeteo arriba y abajo.
  4. Centrifugar a 1000-2000 x g durante 10 minutos
  5. Aspirar el sobrenadante (fracción HDL).
  6. Idealmente utilizar de inmediato el HDL aislado para la fluorochromeassay de la peroxidación lipídica de HDL. Sin embargo, si varias muestras son en el mismo día y otros pasos tales como medición de la concentración de HDL-colesterol también se hacen, luego almacenar el HDL aislado a 4 ° C y utilizarlo al día siguiente para la función de fluorochromeHDL ensayo.

5. Día 1-determinación de HDL-C en HDL aislado

Nota: esto es opcional si el valor de HDL-C del laboratorio clínico se utiliza para normalizar la HDLox por la cantidad de HDL-C.

  1. Cuantificar el colesterol HDL del plasma, utilizando colorimétrico estándar ensayos de 27. Añadir 50 μl de reactivo de colesterol en cada pozo y determinar la concentración de colesterol utilizando un lector de placas colorimétrico y un colesterol estándar en cada juego.

6. Día 2-preparación de reactivos

  1. soluciones preparar HRP y colesterol de HRP 5 U/mL de la solución (rango 1-10 U/mL).
  2. Preparar 20 mM fluorocromo (p. ej., Amplex rojo) soluciones: descongelar un vial de reactivo de fluorocromo y DMSO a temperatura ambiente. Antes del uso, disolver reactivo fluorocromo (1 mg) en 200 μL de DMSO. Solución stock congelado en ≤-20 ° C, protegido de la luz.
  3. Preparar controles positivos y negativos: uso 1 X ' tampón de reacción ' sin colesterol y 20 mM H 2 O 2 solución diluida como control positivo y negativo, respectivamente.

7. Día 2-fluorocromo ensayo

  1. añadir 50 μl de 1 x buffer de reacción como blanco (control negativo).
  2. Opcional: Añadir solución de trabajo de 20 mM de H 2 O 2 como control positivo en cada placa.
  3. Para minimizar la variabilidad experimental y asegurar además de los reactivos y las muestras se realiza constantemente y de manera oportuna, realiza todas las adiciones de las muestras en un separado 96 bien fondo redondo, claro, poliestireno o polipropileno placa (placa 1). Luego utilizar una pipeta multicanal para transferir volúmenes específicos 3 placas de 96 pocillos (placas de 2-4: bot polipropileno, planaTom, negro) (que tienen idéntico diseño) ( figura 2, figura 3).
    1. Por ejemplo, primero agregue 160 μl de HDL aislado en cada pozo/muestra de la placa 1 y luego con el uso de pipeta multicanal transfiera 50 μl de HDL-colesterol de cada muestra de pozo en las placas de 96 pozos negras. Cambiar consejos entre cada fila o columna y utilizar las puntas sin filtrar para todas las transferencias de.
  4. Dejar las muestras en los pozos. No se deshaga. Hay no hay pasos de lavado entre la adición de reactivos.
  5. Añadir 50 μl de solución de HRP 5 U/mL (0,25 U) a cada pocillo.
    Nota: Uso HRP antes de la adición del reactivo de fluorocromo.
  6. Incubar durante 30 min a 37 ° C. No deseche las muestras después de la incubación (no hay pasos de lavado entre adiciones de reactivos).
  7. Añadir 50 μl de fluorochromereagent para una concentración final de 300 μm. En este punto, el volumen de reacción total es 150 μL. mezcla bien y proteger de la luz.
  8. Evaluar la lectura fluorescente (en la oscuridad) cada minuto durante 120 min a 37 ° C con un lector de placa fluorescente (530/590 filtros de nm).
    Nota: Utilice un intervalo más corto de 60 minutos con muestras frescas. Hemos encontrado esa serie 120 minutos da más datos reproducibles con el uso de muestras criopreservados.
  9. Registrar datos utilizando software apropiado.

8. Día 3-Análisis

  1. unidades de fluorescencia (unidades arbitrarias) de grabar a 120 minutos después de la adición de fluorocromo reactivo para todas las muestras incluyendo los pocillos del blanco y todos los controles de.
  2. Calcular el valor medio de unidades de fluorescencia (basado en por lo menos triplica) (HDL ox_sample). No tome valores atípicos (> 2 SDs de valor promedio) en cuenta.
  3. Restar la fluorescencia de fondo utilizando la siguiente ecuación:
    figure-protocol-1
  4. normalización de la cantidad de colesterol HDL (HDL-C): normalizar el valor de peroxidación de lípidos de HDLox para cada muestra (incluyendo el control agrupado) por el HDL-C) (mg/dl). A lo largo de la sección de resultados, HDL buey se presenta como n HDLox (HDL-C) medida para reflejar el ajuste para el HDL-C. Utilice la siguiente ecuación:
    figure-protocol-2
  5. normalizar la expresión de HDLox valor de peroxidación de lípidos de cada muestra contra el valor de un control combinado. Normalizar el n valor de peroxidación de lípidos (HDL-C) HDLox para cada muestra (ajustado para HDL-C) por n valor de peroxidación de lípidos (HDL-C) HDLox del control agrupado. A lo largo de la sección de resultados, HDL buey se presenta como medida de buey de nHDL para reflejar el ajuste por variabilidad experimental y HDL-C. Utilice la siguiente ecuación:
    figure-protocol-3
    Nota: este método es similar a otros enfoques experimentales establecidos para reducir la variabilidad experimental de mediciones tales como internacional había normalizada ratio (INR) 44 , 45. Este enfoque ha sido validado en estudios clínicos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.
  6. realizar control de calidad de resultados experimentales, utilizando muestras de control de calidad estándar. Cada laboratorio debe establecer sus propios controles de calidad (QCs). Idealmente no hay un control de calidad para nHDLox de una muestra con conocidas HDL disfuncional y un control de calidad para nHDLox de una muestra de donantes sanos [e.g. uso grupo de muestras de adultos jóvenes que son donantes de banco de sangre establecido y no tiene comorbilidad conocida o factores de riesgo para enfermedad cardiovascular incluyendo fumar]. El control último estandariza resultados entre diferentes laboratorios. Los valores promedio de estos QCs son establecidos basado en al menos 5 muestras (normalmente usamos 10 repeticiones para este importante paso).
    1. Compruebe si QCs medidos en cada ensayo tienen valores dentro del rango de valores. Asumiendo una variabilidad experimental máximo aceptable de 15%, todos los valores experimentales medidos deben caer dentro del 15% de los valores medios conocidos de control de calidad establecido. Use las ecuaciones siguientes:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      Nota: Si cualquiera de control de calidad incluido muestras () normal versus HDL disfuncional) da HDLox valores fuera de rango (establecido en cada laboratorio) entonces repetir el experimento.
  7. Realizar control de calidad de los resultados experimentales utilizando el coeficiente de variación (CV) para cuantificar la variabilidad experimental: repetir todas las muestras con CV % > 15%. Utilice la siguiente ecuación:
    figure-protocol-6
    Nota: es un típico intra-ensayo (dentro de la misma placa) y la variabilidad experimental Inter-ensayo (entre diferentes placas) < 15%. 2) típico CV intraensayo es entre 1-7% y un típico interassay CV es entre 3-10%.

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Resultados

Se añaden 50 μl de cada muestra de HDL en cada pozo como en el paso 7.3. 50 μl de solución HRP 5 U/mL (0,25 U) se añaden en cada pozo como en el paso 7.5. Las muestras se incuban durante 30 min a 37 ° C como en el paso 7.6. Entonces se añaden 50 μl de reactivo de fluorocromo en cada pozo como en el paso 7.7 (concentración final de 300 μm). La lectura fluorescente (en oscuro) entonces se evalúa cada minuto durante 120 minutos a 37 ° C con un lector de placa fluorescente (530/590 filtros de...

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Discusión

El protocolo aquí descrito ofrece una herramienta robusta para responder a preguntas de la investigación sobre el papel de la función de HDL en la aterosclerosis y la enfermedad humana. El ensayo cuantifica el contenido en peróxido lipídico HDL por mg de HDL-C mediante amplificación enzimática (HRP). Este enfoque evita limitaciones conocidas de anteriores ensayos de función de HDL (p. ej. ensayo de eflujo de colesterol) incluyendo una heterogeneidad significativa en cuanto a tipos de células utilizadas, tipo de lectura r...

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Divulgaciones

Este protocolo y el análisis son relevantes para la patente PCT/US2015/018147.

Agradecimientos

Los autores reconocen con gratitud el trabajo de Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman y Srinivasa Reddy por su papel clave en el desarrollo de iteraciones anteriores de este modelo. T.A.A. es apoyado por Beca Postdoctoral un RMIT Universidad del rector. AJ y AH son apoyados por el NHMRC proyecto grant 1108792. TK es apoyado por subvenciones de NIH NIH K08AI08272, subvención del NIH/NCATS # µL1TR000124.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
reactivos experimentales
HDL PEG (polietilenglicol) reactivo de precipitaciónPointe ScientificH7511
Amplex Red.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de ensayo de colesterol rojo Amplex.
• ≤ – 20° C y toro; Desecado
• Proteger de la luz
DMSO.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de ensayo de colesterol rojo Amplex.
• ≤ – 20° C y toro; Desecado
• Proteger de la luz
Peroxidasa de rábano picante (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤ – 20° C y toro; Desecado
• Protege de la luz
la colesterol esterasa.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de ensayo de colesterol rojo Amplex.
• ≤ – 20° C y toro; Desecado
• Proteger del colesterol ligero Estándar de
referenciaLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤ – 20° C y toro; Desecado
• Proteger de
la luz Resorufin fluorescense Estándar de referenciaLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤ – 20° C y toro; Desecado
• Proteger de la luz
5x Reaction Buffer.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de ensayo de colesterol rojo Amplex.
• ≤ – 20° C y toro; Desecado
• Proteger de la luz
Reactivo automatizado para colesterol HDLThermoFisher Scientific Co., San José, CA, EE. UU.TR39601
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Plasticware
96 placas de pocillos (polipropileno, fondo plano, transparente).Sigma AldrichM0687
Placas de 96 pocillos (polipropileno, fondo plano, negro).Sigma AldrichM9936
1.5 mL Tubos EppendorfEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, estérilesThermoFisher Scientific Co., San José, CA, EE. UU.14-488-058
Pipetas multicanal Thermo Scientific, 8 canales, 125 ThermoFisher Scientific Co., San José, California, Estados Unidos.  14-387--955
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Software
Gen5 2.01 softwareBiotek, Vermont, USANA
strong>Name CompañíaNúmero de catálogoComentarios
>Equipment
placasBiotek, Vermont, USANA
<Gen5 Lector de

Referencias

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