Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

Shubhendu Sen Roy; Huy Cong Xuan Nguyen; Thomas A. Angelovich; Anna C. Hearps; Diana Huynh; Anthony Jaworowski; Theodoros Kelesidis

doi:10.3791/56325

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Artículo de método

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

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DOI:

10.3791/56325

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12 de octubre de 2017

Shubhendu Sen Roy¹ , Huy Cong Xuan Nguyen¹ , Thomas A. Angelovich²^,³ , Anna C. Hearps² , Diana Huynh¹^,⁴ , Anthony Jaworowski²^,⁴ , Theodoros Kelesidis¹

¹University of California, Los Angeles, ²Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, ³School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, ⁴Department of Infectious Diseases, Monash University

En este artículo

Resumen

Describimos aquí un ensayo fluorométrico sin células bioquímico para la determinación de la peroxidación lipídica HDL. Este ensayo rápido y reproducible puede ser utilizado para determinar la función del HDL en estudios a gran escala y puede contribuir a nuestra comprensión de la función del HDL en enfermedad humana.

Resumen

Los niveles de colesterol (HDL-C) bajo lipoproteína de alta densidad son uno de los más poderosos predictores independientes negativos de enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV). La estructura y la función del HDL en lugar de C-HDL pueden predecir con mayor precisión la ateroesclerosis. Varios HDL proteína y lípidos composición que deterioran la función del HDL cambios en Estados inflamatorios tales como la ateroesclerosis. Función de HDL suele determinarse por célula basado en ensayos tales como ensayo de eflujo de colesterol pero estos ensayos tienen falta de desventajas numerosas de estandarización. Ensayos libres de células pueden dar medidas más sólidas de la función del HDL en comparación con ensayos de célula. Oxidación de HDL deteriora la función del HDL. HDL tiene un papel importante en el transporte de peróxido de lípido y alta cantidad de peróxidos de lípidos está relacionado con la función de HDL anormal. Deben considerarse las interacciones lípido-sonda cuando ensayos de interpretación de los resultados de fluorescencia no enzimáticos para la medición del estado oxidativo de lípidos. Esto nos motivó a desarrollar un método enzimático sin células bioquímico para evaluar HDL peróxido contenido en lípidos (HDLox) que contribuye a la disfunción del HDL. Este método se basa en la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y el fluorocromo rojo Amplex que puede cuantificar (sin colesterol oxidasa) el contenido de peróxido de lípido por mg de HDL-C. Aquí un protocolo es describedfor determinación de la peroxidación de lípidos HDL usando el reactivo de fluorocromo. Variabilidad del ensayo puede reducirse por la estricta normalización de condiciones experimentales. HDLox los valores más altos están asociados con la función de antioxidante de HDL reducida. La lectura de este ensayo se asocia con lecturas de ensayos basadas en celdas validados, medidas sustitutas de enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico. Este enfoque técnico es un método robusto para evaluar la función de HDL en las enfermedades humanas donde systemic inflamación, estrés oxidativo y lípidos oxidados tienen un papel clave (como la ateroesclerosis).

Introducción

La enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV) es la principal causa de muerte en todo el mundo¹^,². Estudios epidemiológicos han mostrado que niveles bajos de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) son generalmente inversamente asociados con el riesgo para el desarrollo de ateroesclerosis¹^,². Aunque varios estudios apoyan un papel ateroprotectores para HDL¹^,², el mecanismo por el cual HDL atenúa la iniciación y progresión de la aterosclerosis es complejo ³....