El ensayo de reconstitución de organoides (ORA) para el análisis funcional del tallo Intestinal y las células del nicho

Resumen

Organoide intestinal culturas establecen de criptas todas y no permite el análisis de auto renovación y diferenciación de una manera específica de la célula. Este protocolo describe reconstitución de potencia ordenada (Lgr5⁺) y lugar (Paneth) células, que dan lugar a organoides permitiendo su modificación bioquímica y genética previa y análisis funcional.

Resumen

El epitelio intestinal se caracteriza por un índice de rotación extremadamente rápida. En mamíferos, la guarnición epitelial toda se renueva dentro de los 4-5 días. Las células madre intestinales residen en la parte inferior de las criptas de Lieberkühn son asignadas por la expresión del gen Lgr5 y preservar la homeostasis a través de su característica alta tasa proliferativa¹. A lo largo del intestino delgado, Lgr5⁺ las células madre están entremezcladas con células secretoras especializadas llamadas células de Paneth. Células de paneth secretan compuestos antibacterianos (por ejemplo, la lisozima y cryptdins/defensinas) y ejercen un papel que controlaba en la flora intestinal. Más recientemente, se ha descubierto una nueva función para las células de Paneth, es decir, su capacidad para proporcionar apoyo de nicho a células Lgr5⁺ a través de varios ligandos claves como Wnt3, EGF y Dll1².

Cuando aislado ex vivo y cultivadas en presencia de factores específicos de crecimiento y componentes de la matriz extracelular, criptas intestinales toda dan lugar a larga vida y uno mismo-renovar estructuras 3D llamado organitas muy parecidos a la cripta vellosidad arquitectura epitelial del intestino adulto³. Organoide culturas, cuando estableció de criptas enteras, permiten el estudio de auto renovación y diferenciación del nicho de células madre intestinales, aunque sin abordar la contribución de sus componentes individuales, es decir, la Lgr5⁺ y Células de Paneth.

Aquí, describimos un nuevo enfoque para el análisis de organoides que se aprovecha de la capacidad de Paneth y células Lgr5⁺ para asociarse y formar organoides cuando cultivadas conjuntamente. Este enfoque, aquí denominado "ensayo de reconstitución de organoide" (ORA), permite la modificación genética y bioquímica de Paneth o Lgr5⁺ células, seguidas de reconstitución en organoides. Como tal, permite el análisis funcional de los dos componentes principales del nicho de células madre intestinales.

Introducción

El epitelio intestinal es el tejido más rápidamente renueva a sí misma en el cuerpo mamífero y, como tal, ha sido objeto de una gran cantidad de estudios dirigidos a la identificación y caracterización funcional de las células madre adultas que residen en la parte inferior de la cripta de Lieberkühn, destinado por la expresión del gen Lgr5 y dependiente de señales Wnt canónico¹. En particular, las células de vástago Lgr5⁺ flanqueadas y apoyadas por las células del nicho especializado, es decir, las células de Paneth, que también dependen de Wnt de señalización para su maduración². Juntos, estos dos tipos celulares subyacen autorenovación de la guarnición epitelial intestinal y mantener el equilibrio homeostático diario: Lgr5⁺ células rápidamente se dividen y dan lugar a progenitoras y más especializan intestinal epitelial células; Células de Paneth proporcionan factores del nicho fundamental (p. ej., Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5⁺ células madre². La capacidad de las criptas intestinales cuando plateado ex vivo para formar estructuras organizadas y renueva a sí misma llama organoides o "mini-entrañas", se ha explotado como una herramienta experimental para proporcionar la penetración en procesos tales como la auto renovación y diferenciación en condiciones normales y patológicas incluyendo cáncer⁴. Se han establecido culturas organoide de varios tejidos, incluyendo el intestino, páncreas, hígado y riñón de ratón y muestras humanas⁴. El método de extracción y los factores de crecimiento empleados para el desarrollo de las culturas de estos organoides son específicas de tejido y diseñado para impulsar la diferenciación multilineal y mímico lo más cerca posible el original nicho de células madre en vivo. Organoides pueden tener aplicaciones potenciales incluyendo el tratamiento de enfermedades genéticas, la evaluación de eficacia terapéutica en el cáncer, el análisis de toxicidad de la droga o el estudio de la organogénesis in vitro⁵.

En general, la principal limitación de organoide culturas cuando establecido a partir de muestras de tejido es la falta de especificidad celular. Por ejemplo, organitas intestinales establecidas de criptas intestinales toda no permiten el análisis de los componentes celulares, englobado dentro de la fuente de tejido (por ejemplo, contienen criptas todo Lgr5⁺, Paneth, y células progenitoras).

Aquí, describimos un nuevo método, conocido como ORA, que combina las ventajas de las culturas organoide intestinal con el análisis funcional de sus componentes más fundamentales, a saber, madre (Lgr5⁺) y células de nicho (Paneth). Esto se logra a través de la capacidad única de Paneth y células de Lgr5⁺ para asociar físicamente a otro cuando co incuban y dan lugar a organoides^2,6,10. Aprovechando esta característica y tratados previamente los dos tipos celulares individualmente antes de lo que les permite reconstituir el organitas. Al hacerlo, cada componente de la célula puede estar expuesto a determinada droga, factor de crecimiento, inhibidor bioquímico, modificación genética o tratamiento químico antes de la reconstitución y la formación de organoide. Por lo tanto, usando el análisis ORA permitirá la determinación de si un determinado tratamiento farmacológico o modificación genética tiene un efecto específico sobre las células madre o sus contrapartes de nicho.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron según las pautas y leyes de bienestar animal local.

1. preparación de instrumentos, medios de cultivo y platos

1. Sistema de autoclave 1 intestinales tijeras, tijeras normales y pinzas en un recipiente estéril.
2. Colocar un plato de 96 pozos (fondo plano) en una incubadora a 37 ° C.
3. Preparar 10 mL de medio de cultivo completo con los reactivos indicados en la tabla de materiales.
4. Incubar el medio completo a 37 ° C en un baño de agua.
5. Descongele la membrana basal reconstituida colocando en un cubo de hielo. La membrana basal reconstituida se convertirá en líquido a 4 ° C.
6. Llene 4 placas de Petri con solución salina tamponada con fosfato frío o abreviado PBS (4 ° C).

2. aislamiento de las criptas intestinales pequeñas

1. Sacrificio por inhalación de CO₂ de un Lgr5- eGFP-IRES-CreER^t2 ratón sobre fondo C57BL6/J. Disecar el peritoneo longitudinalmente con un par de tijeras.
2. Mantenga el estómago con el fórceps y cortadas transversalmente por la mitad.
3. Con las tijeras intestinales de ahora en adelante, sacar el intestino y colocar en una placa de Petri con PBS.
   Nota: Tijeras intestinales tienen una fuerte y una punta Roma. La punta Roma de estas Tijeras es no dañar la arquitectura de la cripta vellosidad al abrir el intestino.
4. Comenzar colocando la punta Roma en el estómago y empuje suavemente a través del píloro. Continúe cortando con las tijeras y tracción con el fórceps.
5. Una vez que el intestino entero se abre longitudinalmente, lavar en PBS frío sujetándola con las pinzas y enjuáguelo suavemente en la solución de PBS con movimientos en forma de U.
6. Una vez que se eliminan todos los restos de heces, proceder a alisar el intestino en una tabla de cortar, luminal hacia arriba. El lado luminal es fácilmente reconocible por la ausencia de vasos sanguíneos y por su aspecto pálido en comparación con la parte exterior.
7. Con un portaobjetos de vidrio, quite con cuidado las vellosidades raspando el intestino aplanado. Realizar este paso dos veces a lo largo de toda la longitud del tejido.
8. Trocear el intestino con una cuchilla quirúrgica estéril 2-5 mm.
9. Colocar los pequeños fragmentos intestinales en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de PBS frío hielo.
10. Limpiar los fragmentos de tejido, eliminando cualquier impureza restante transfiriendo hacia arriba y hacia abajo en el PBS. Deseche el sobrenadante y repetir este paso hasta que el PBS es totalmente claro.
11. Añadir 15 mL PBS frío, para llevar el volumen final total de PBS a 25 mL. Añadir 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 45 min sobre un rodillo de 4 ° c.
12. Descartar el PBS/EDTA.
13. Añadir 10 mL de PBS y separar las criptas mediante pipeteo duramente los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo (por lo menos tres veces). Recoger el sobrenadante.
14. Repita el paso 2.13 cuatro veces. Añadir el medio de cultivo para alcanzar un volumen final de 50 mL.
15. Sedimenten las células por centrifugación (300 x g durante 5 min).
16. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de cultivo y las criptas de pellets por centrifugación (80 x g durante 3 min).

3. célula preparación

1. Deseche el sobrenadante de las criptas sedimentados y resuspender en 1 mL de tripsina como-enzimas junto con 50 μl DNasa (50 μg/mL).
2. Incubar las células en un baño de agua a 32 ° C por 2 min.
3. Añadir 10 mL de medio de cultivo. Disocian las criptas en las células mediante pipeteo duramente hacia arriba y hacia abajo por lo menos 5 veces.
4. Filtrar la solución a través de un tamiz de 40 μm (para eliminar grumos y otras impurezas) y de la pelotilla de las células a 300 x g durante 5 minutos.

4. galjanoplastia y citometría de flujo

1. Preparar 50 mL de solución salina tamponada de 1 x Hank o solución de suero (FCS) HBSS/2% vaca fetal y resuspender el precipitado en 1 mL para cada 10⁶ células
2. Añadir a la suspensión de células BV421 Lin^– (CD31, CD45, TER119) a una concentración de 1: 100 y CD24-APC y CD117-PE ambos a una concentración de anticuerpos de 1: 250 por 30 min.
3. Tipo Lgr5⁺ células madre y células de Paneth en separado bajo atan los tubos. Para obtener más información sobre la distribución de protocolos para Lgr5⁺ y células de Paneth, véase Roth et al. ⁷ y Schewe et al. ⁶
   1. Centrifugar las células clasificadas a 300 x g durante 5 min resuspender las células en 100 μl de medio con los componentes descritos en 1.3 (véase la Tabla de materiales).
4. Tratamiento (p. ej., por modificación química o genética) de las células de Paneth (n = 2000) o las células de vástago Lgr5⁺ (n = 2000).
   1. Para tratar células, se utilizan 5 μl de reactivo de transfección mediada por liposomas en un volumen total de 100 μl de medio de cultivo y ARN interferente pequeño (siRNA) a una concentración de 100 nM. Incubar durante 30 min a 37 ° C por siRNA o por el tiempo necesario para la modificación solicitada.
5. Lavan las células dos veces en 500 μl de medio de cultivo.
6. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos y resuspender las células en 10 μl de medio de cultivo.
7. Los dos componentes celulares de la piscina (Paneth o Lgr5⁺ células) 20 μl volumen total y centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
8. Co incubar el Paneth y células de Lgr5⁺ durante 10 min a TA.
9. Extraiga 10 μl del sobrenadante y deje un menisco de líquido para asegurarse para no aspirar el sedimento celulares.
10. Añadir 30 μl de reconstituido la membrana basal a las células para un volumen total de 40 μl, resuspender las células y de la placa en una placa bien 96 precalentado. Después de 10 min, añadir 200 μL de medio completo (véase la Tabla de materiales). Medio de cambio cada 48 h.
11. Cuenta de multiplicidad de organoide en día 5.

Resultados

El ensayo de reconstitución de organoide permite el análisis funcional separado de los componentes esenciales del nicho y células del epitelio intestinal, aquí demostrada por ARN interferente pequeño (siRNA) del gene del Apc .

Para lograr este objetivo, primero utilizamos fluorescente celular activada (FACS) para separar células Lgr5⁺ 8000 y 6000 células de Paneth de ratones C57BL6/J endogámicas de c...

Discusión

El ORA permite el refinado análisis funcional de los dos componentes esenciales del nicho de células madre intestinales, es decir, Lgr5⁺ y células de Paneth. Este enfoque ha sido empleado previamente por nosotros y otros con ligeras modificaciones^6,10,11. Aquí, presentamos el procedimiento ORA como un protocolo de laboratorio estandarizadas y reproducibles. También, nos informe sobre los efectos de la desregu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Concentración final: 10 mM
Penicilina/estreptomicina *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Concentración final: 1%
Hepes *Thermo	Fisher Scientific	15630080	Concentración final: 10 mM
EGF murino recombinante *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Concentración final: 50 ng/ml
Recombinante murino Noggin *	Peprotech	250-38	Concentración final: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Concentración final: 10 µ M
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Concentración final: 1 µ M
R-espondina murina recombinante *	R& Sistemas D	3474-RS-050	Concentración final: 1 mg/ml
Flexitube Solución génica siRNA APC	Qiagen	GS11789	Concentración final: 100 nM
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45 Biolegend		103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Tubos de baja unión	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* La combinación de estos reactivos constituye el medio

102424 de cultivo completo