Gran volumen, iluminación conductualmente relevantes para Optogenetics en Primates no humanos

Resumen

Se presenta un protocolo para construir un iluminador penetrante de tejido para ofrecer luz sobre grandes volúmenes con diámetro mínimo.

Resumen

Este protocolo describe un iluminador de gran volumen, que fue desarrollado para la manipulación de optogenetic en el cerebro de primates no humanos. El iluminador es una modificado fibra óptica de plástico con punta de grabado al agua fuerte, tal que la luz que emite la superficie es > 100 x de una fibra convencional. Además de describir la construcción del iluminador de gran volumen, este protocolo detalla la calibración de control de calidad para asegurar la mejor distribución lumínica. Además, este protocolo describe técnicas para insertar y retirar el iluminador de gran volumen. Estructuras superficiales y profundas pueden ser iluminadas. Este iluminador de gran volumen no necesita estar físicamente junto a un electrodo, y porque la luz está hecha de plástico, no de vidrio, simplemente se dobla en circunstancias cuando destruiría fibras ópticas tradicionales. Porque este iluminador ofrece luz sobre volúmenes de tejido conductualmente relevantes (≈ 10 mm³) sin mayor daño de penetración de una fibra óptica convencional, que facilita estudios de comportamiento usando optogenetics en primates no humanos.

Introducción

Optogenetic herramientas, que permiten un control neuronal exacto milisegundo, impulsado por la luz son ampliamente utilizadas para estudiar la fisiología funcional y comportamiento en roedores e invertebrados. Sin embargo, desafíos técnicos limitó el uso de optogenetics en el cerebro de primates no humanos, que tiene un volumen ~ 100 x más grande que el cerebro de roedores ¹.

Para facilitar la optogenetics estudios en primates no humanos, un iluminador fue diseñado para abordar dos objetivos concurrentes: iluminación de gran volumen y penetración mínimo daño. Los intentos anteriores para abordar uno de estos problemas vienen en la cara del otro. Paquetes de fibras se iluminan grandes volúmenes pero con mayor diámetro y, por lo tanto, daños^2,3. Fibras de vidrio afilado reducen el daño de la penetración, pero estrecho foco luz a superficies de emisión de luz < 100 μm^{2 4,5}. Iluminación externa del cerebro a través de una ventana en la dura elude el reto de daños de penetración y puede permitir la iluminación de gran volumen, pero sólo puede ser utilizado para algunos superficiales cerebro áreas⁶.

Para crear un iluminador de gran volumen, de pequeño diámetro (Figura 1a), la punta de un plástico óptico de fibra es cónico y el núcleo y el revestimiento son grabadas (Figura 1bc). A diferencia de otras fibras afiladas que enfocar luz en un punto estrecho, el grabado permite que la luz escape uniformemente hacia fuera los lados de la punta, por lo tanto, distribución de luz ampliamente sobre un área grande (figura 1 de). Debido a daños de penetración son proporcional al diámetro de la penetración, este iluminador no tiene más daño de penetración que una fibra convencional, pero tiene > 100 x la luz emitiendo luz superficie de área y ofrece más ampliamente con 1/100 la potencia de luz densidad en un cerebro fantasma (1.75% agarosa) (Figura 1e). Un modelo Monte Carlo (figura 1f) ilustra la diferencia de propagación de luz entre una fibra convencional y el iluminador de gran volumen cuando tienen densidades de energía de luz igual como su superficies de emisión de luz. Cada iluminador es calibrada individualmente usando una esfera integradora (Figura 2a, b) para asegurar la distribución lumínica a lo largo de la punta (figura 2C).

Este iluminador de gran volumen ha sido validado con la manipulación de optogenetic de comportamiento y de disparo neuronal en primates no humanos. La longitud de la punta de la fibra puede ser adaptada a cualquier área del cerebro y al mapa de campo receptivo individual de cada animal. El iluminador puede ser asociado con un electrodo de penetración para grabaciones neuronales que abarcan la longitud de la iluminación. Además, porque la fibra puede llevar cualquier color de la luz visible, puede ser asociado con cualquiera de las moléculas de optogenetic disponible disponibles.

Protocolo

Nota: todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con las directrices de los NIH y fueron aprobados por el Instituto de Massachusetts de tecnología Comité de cuidado Animal.

1. iluminador fabricación

1. Use un par de tijeras afiladas para cortar un tramo de 250 μm de diámetro fibra óptica de plástico que por lo menos 10 cm de largo mayor que el deseado iluminador total.
2. Sacar 15-20 cm de chaqueta de polietileno de un extremo de la fibra óptica de plástico con un pelacables 22 calibre.
3. Garantizar la distal más 3-5 cm del extremo pelado de la fibra en una abrazadera de tornillo de banco mesa.
4. Sujete el extremo con forro de la fibra tensa con una mano con un tirón constante constante. La fibra debe estar paralela al piso, perpendicular a la prensa. Mantener esta tensión constante en la fibra durante el calentamiento y enfriamiento (pasos 1.5 y 1.6 abajo) para que la fibra quede recta y tensa como diluye.
5. Utilizando la posición más baja de una pistola de calor de doble temperatura (570/1.000 ° F), calentar la sección pelada de la fibra hasta que se adelgaza a un diámetro de 60-100 μm, o sobre el diámetro de un cabello humano.
6. Mantener la tensión constante de la fibra permitiendo la fibra que se enfríe. Falta de mantenimiento de tensión puede provocar la fibra rizar.
7. Confirmar el diámetro de la punta adelgazada bajo un microscopio de disección. Alternativamente, uno puede utilizar pinzas.
   1. Si la fibra no es lo suficientemente delgada, repita los pasos 1.4 por 1.6 según sea necesario para alcanzar el diámetro de la punta deseada.
   2. Opcional si vuelve a tirar, ponga una marca pequeña en la porción más estrecha de la fibra si se calentarán otra vez para que el centro de la pistola de calor apunta a la parte más estrecha de la fibra.
   3. Si la fibra es demasiado delgada, volver a empezar.
8. Una vez que la fibra se haya enfriado por completo y se ha conseguido el diámetro deseado, apriete la fibra 3 cm desde el punto más estrecho a cada lado. Con un rápido y agudo tire del eje de la fibra, separar los lados para crear una punta cónica.
9. Examinar la punta cónica bajo una potencia baja (por ejemplo, 4 X) en el microscopio de disección. Si la punta está bifurcada o rizada ( figura 1f), descartar la fibra de.
10. Preparación para grabar la punta cónica colocando un trozo de cinta de laboratorio cerca del extremo de la punta, dejando lo últimos 5 mm expuesto. La cinta protege la fibra del aguafuerte sobre la longitud deseada de la emisión de luz. Esta longitud de la punta fue seleccionada basado en el grueso de la corteza de primates en la región de destino. Pudiera estar expuesta una longitud más larga o más corta dependiendo de la longitud deseada de la iluminación. Si desea una longitud de punta de grabado de pistas diferentes, el borde de la cinta de laboratorio puede ser acercado a o más lejos de la punta cónica.
11. Plegar un cuadrado pequeño (~ 1 x 2 pulgadas) de 5 μm carburo de silicio pulido hoja entre los dedos pulgar e índice. Coloque la punta de la fibra entre los dos lados de la hoja de pulido y grabado suavemente la fibra mediante pequeños movimientos circulares, como si un BB del balanceo entre el pulgar y el índice. Girar con frecuencia la fibra para que los lados están grabados uniformemente. Aparece la punta de la fibra “ rugosa ” a simple vista en las áreas que han sido grabadas, mientras que zonas no grabadas aparecen típicamente lisas.
12. 1.11 Repita el paso con un óxido de aluminio de 3 μm lapeado hoja.
13. Colocar un conector en el extremo de la luz frente a la punta al ácido. Esto permite que el iluminador conectar un cable óptico o láser.
    Nota: Este método difiere el método preferido para fijación de vidrio / fibras ópticas de sílice en las virolas. Porque la virola de metal es más duro que la fibra óptica de plástico, pulido de la fibra y la férula como una unidad después de pegado puede dañar el plástico de la fibra óptica como pequeños fragmentos de metal producido durante el proceso de pulido se pueden incrustar en fibra plana-hendida.
    1. Quitar unos 5 mm de la chaqueta de polietileno desde el lado opuesto del iluminador con un pelacables 22 calibre.
    2. Cortar el extremo opuesto con un cuchillo caliente para alisar la superficie.
    3. Pulir el extremo opuesto con lapeado sucesivamente más finas hojas: 0.3 μm, 5 μm, 3 μm y 1 μm.
    4. Insertar el plano opuesto extremo en una virola de acero inoxidable de diámetro interno de 260 μm hasta que quede a ras con el extremo del casquillo.
    5. Confirmar visualmente que el extremo opuesto se pule suavemente y uniformemente con un microscopio de fibra.
    6. Quitar la fibra de la férula y cintas la virola verticalmente sobre el borde de una mesa con la fibra apuntando hacia abajo.
    7. Llene una jeringa de 1 mL con epoxy plástico y coloque una aguja Roma de 18 calibre a la jeringa de.
    8. Utilice la aguja para aplicar epoxy abajo en la virola. Llenar completamente la virola con el epóxido.
    9. Inserte la fibra en el ferrule.
    10. Limpie cualquier exceso de epoxy de la superficie pulida de la fibra con un paño húmedo sin pelusa antes de secar, si es necesario. De lo contrario, epoxi sobrante puede eliminarse después de 12-24 h.
    11. Tienda la fibra suavemente hasta calibración y coloque un tapón sobre la férula.

2. Iluminador de calibración y Control de calidad

Nota: estos métodos para la calibración de evaluación para no linealidad a diferentes distancias de la punta de la fibra de salida de luz. Desigual distribución de la luz resulta típicamente de un “ lleno de baches ” o “ ondulado ” cónico.

1. Crear un blindaje ligero diafragma para la parte superior de la esfera integradora utilizando absorbiendo luz hoja ( figura 2).
   Nota: Use guantes cada vez que manejo la luz absorbente papel aluminio para evitar que la piel los aceites desde la creación de manchas que reflejan luz.
   1. Doblez a 2 ” 4 ” pieza de luz absorbente papel sobre sí mismo para formar un 2 ” x 2 ” Plaza. un método alternativo es cortar un 2 ” x 2 ” Plaza con una luz absorción lateral y una luz que refleja de lado (es decir, un lado de papel de aluminio estándar); sin embargo, el método de doblado es más seguro ya que proporciona un borde embotado para manejar el diafragma en el paso siguiente.
   2. doble cinta de laboratorio o con cinta aislante a lo largo de los bordes de la plaza para enlazar los bordes no doblado. Esto une los lados tanto protege contra cortes de bordes afilados.
   3. Perfore un agujero en el centro de la plaza con una aguja de 26 calibre.
   4. Quitar el tornillo grande en la tapa de la esfera de integración y cubrir la abertura con el diafragma. Coloque el agujero sobre el centro. Si el diafragma se creó con una absorción de luz y una luz que refleja el lado, coloque la luz absorbente lado arriba y la luz que refleja hacia abajo, hacia el interior de la esfera integradora.
      Nota: Para evitar polvo y la suciedad entren en la esfera de integración y que el agujero de centrado, seguro el diafragma hacia el exterior de la esfera integradora con cinta lab.
2. Medida de luz de salida a lo largo de la punta en otros 500 μm un micromanipulador o brazo estereotáctica y una esfera de Ulbricht.
   Nota: Cuando el láser está en se deben usar gafas de seguridad de la longitud de onda adecuada.
   1. Conecte el extremo opuesto de la fibra de un láser o la luz de la fuente, pero no activan la luz todavía de la salida.
   2. Fijar el iluminador para un soporte estereotáctica (preferably con cinta de laboratorio) con la punta de 7-10 mm por debajo de la parte inferior del soporte del.
   3. Tornillo el titular estereotáxicas en el brazo estereotáctica
   4. Alinee la punta de la luz con el agujero en el centro del diafragma. Cero el instrumental quirúrgico cuando la punta está en el mismo nivel exacto que el diafragma.
   5. Girar apagado las luces de la habitación y cero la esfera integradora.
   6. Activar el láser (u otra fuente de luz) y medir la potencia total de la luz salida a través de la.
      Nota: Utilizar la menor potencia posible para las pruebas de calibración.
   7. Baje la fibra 500 μm en el integrando esfera y repita el paso 2.2.6.
   8. Continuar bajando la fibra dentro de la esfera de integración y medir la salida de luz total en 500 μm incrementos hasta el apagado de niveles de potencia de luz total
      PRECAUCIÓN: Total potencia de luz debe nivel una vez la punta toda la esfera. No continúe bajando la fibra más 1-2 mm más allá del grabado punta longitud. Si la punta entra en contacto con la parte inferior de la esfera de integración, pueden derretir o arruinar la esfera integradora.
3. Confirmar una fibra uniforme grabada trazando total potencia de luz de salida como una función de hasta qué punto la fibra se ha reducido en la esfera de integración para confirmar linealidad.

3. iluminación en Vivo

Nota:, estos métodos se muestran usando un modelo de plástico en lugar de un primate no humano.

1. Implante se implantó una cámara de grabación de 25 mm de diámetro sobre el área cerebral de interés antes de la experimentación.
2. Realizar anatómica resonancia magnética (RM) antes de la experimentación. Colocar una rejilla de encargo de la grabación en la cámara y llene con lubricante quirúrgico estéril para permitir la visualización de cuadrícula y determinación del nivel de las estructuras del cerebro dura y objetivo.
3. Preparar una torre micro-coche antes de cada sesión de evaluación.
   1. Afijo abrazaderas de un tubo de guía de 25 calibre con punta biselada en el medio e inferior en la unidad. Dos pinzas sirven para garantizar que el tubo de guía recta. Dos de estas abrazaderas se pueden mover manualmente si lo desea.
      Nota: El tubo guía puede ajustaron o soldado a las abrazaderas de.
   2. Fijar el iluminador de gran volumen en la abrazadera superior en la misma unidad. Esta abrazadera se une al motor.
   3. El iluminador de gran volumen a través del tubo guía del hilo de rosca totalmente y confirmar que la punta del iluminador se extiende más allá de la punta del tubo guía de.
      Nota: La longitud del iluminador que se extiende pasado el extremo del tubo guía es igual a la distancia entre la dura y el margen inferior de la región del cerebro blanco, como determinada mediante MRI.
   4. Sumerja el tubo guía y el iluminador en una solución antiséptica (p. ej., clorohexidina) para esterilizar.
4. Colocar una rejilla personalizada esterilizada dentro de la cámara limpia y fijarla en una orientación previamente especificada con un tornillo en el lado de la cámara. La rejilla que se muestra aquí tiene espacio de 1 mm; sin embargo, puede personalizar el espacio según sea necesario.
   Nota: Esto debe ser idéntico a la red y orientación en la resonancia magnética anatómica.
5. Garantizar el soporte de micro-coche estereotáctico en la cámara de grabación en una orientación predeterminada.
6. Retraer el iluminador esterilizado del tubo guía tirando el iluminador usando pinzas estériles, romos. La punta del iluminador debe ser 5-10 mm por encima de la punta del tubo guía.
   Nota: El iluminador se doblará hacia fuera entre el tubo guía y la abrazadera. Esto no dañará el iluminador flexible.
7. Fijará la unidad micro al titular y coloque el tubo guía en el agujero de rejilla blanco.
8. Baje la fase de impulsión micro hasta el tubo guía está sólo hasta el nivel de la duramadre.
   Nota: Si lo desea, una segunda unidad de micro con un electrodo puede ser colocada en el escenario y baja en un agujero de red diferentes. El campo local potencial de este electrodo mostrará un artefacto de luz dependiente de la distancia, que puede utilizarse para confirmar la colocación iluminador.
9. Trate de la parte inferior el iluminador manualmente con pinzas estériles.
   1. Si hay alguna resistencia, retraiga el iluminador 5 - 10 mm, esperar 10 minutos para permitir que el tejido y vuelva a intentarlo.
   2. Si todavía hay resistencia en el segundo intento, retraer la punta de iluminador en el tubo guía, bajo la guía del tubo de 0,25 mm e inténtelo de nuevo.
   3. Repetir hasta las diapositivas de iluminador a través del tubo guía sin ninguna resistencia.
   4. Baje el iluminador hasta que esté bien tenso.
      PRECAUCIÓN: No empuje el iluminador con fuerza contra resistencia. En estos casos el tubo guía normalmente ha no penetró la dura completamente. Empujar con fuerza la fibra hará que se curva sobre sí mismo, evitando la fibra de entrar en el cerebro y posiblemente destruir la punta ( figura 1 g).
10. Conecte el casquillo en el otro extremo del iluminador a la óptica más grande establecido o láser.
11. Asegúrese de que la luz no es visible a los primates no humanos.
    1. Usar black out blindaje u hoja para abarcar completamente las grabación torres de absorción de luz.
    2. Colocar todas las conexiones ópticas en sobres protegidos de luz absorbente papel.
    3. Escudo de todos los cables de parche con cualquier luz absorbente papel o cinta aislante negra.
    4. Como precaución extra, poner un banco de diodo electroluminoso (LED) de la trampa del mismo color de luz utilizado en el experimento detrás de los primates no humanos y encender los indicadores LED continuamente a 2,5 Hz. Esto evita que los ojos ajuste completamente a la oscuridad. Si hubiera salida inadvertida de luz, esta luz intermitente ayudaría a evitar la fuga de servir como un disparador de comportamiento.

Resultados

La iluminación de los volúmenes grandes del cerebro en primates no humanos permite la manipulación del comportamiento relevante optogenetic. Acker et al. (2016) utiliza este iluminador de gran volumen con la halorodopsina rojo-cambiado de puesto, las mordazas ⁷ para estudiar la contribución temporal del campo frontal del ojo (FEF) para Movimientos sacádicos memoria-dirigida en dos monos rhesus. Específicamente, las neuronas de la FEF fueron inyectadas con un vector viral que contiene las ...

Discusión

Mientras que optogenetic herramientas son ampliamente utilizados para el estudio de la enfermedad y la fisiología en roedores, el desafío técnico de iluminar los volúmenes grandes del cerebro limitó el uso de optogenetics en primates no humanos. Pionera en estudios en monos utiliza densidades de energía de luz grande (~ 100 mW/m² a 20 W/mm²) para iluminar pequeños volúmenes, tal vez < 1 mm³y efectos conductuales modestos reportados con opsins excitatorias de la corteza

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fibra óptica de plástico	Fibra óptica industrial	SK-10	250 micras de diámetro, línea Super Eska
Pelacables	Klein Tools	11047	banco de calibre 22
	Wilton	11104	Abrazadera de tornillo de banco de montaje en mesa genérica
Pistola de calor de doble temperatura	Milwaukee	8975-6	570 / 1,000 ° F
Marcador de laboratorio	VWR	52877
Microscopio de disección	VistaVision	82027-156	Microscopio estereoscópico con luz incandescente doble, aumento de 2X/4X, disponible en VWR Cinta de
laboratorio	VWR	89097-972	Paquete de 4 de color violeta; sin embargo, el color de la cinta no importa Hoja de
lapeado de carburo de silicio	ThorLabs	LF5P	Grano de 5 micras, paquete de 10
Hoja de lapeado de óxido	de aluminio ThorLabs	LF3P	grano de 3 micras, paquete de 10
hojas de lapeado de óxido de aluminio	ThorLabs	LF1P	grano de 1 micra, paquete de 10
hojas de lapeado de alúmina calcinada	ThorLabs	LF03P	grano de 0,3 micras, paquete de 10
cuchillos calientes	Fibra óptica industrial	IF370012	60 vatios, servicio pesado
Alcance de inspección de	fibraThorLabs	FS201	opcional
Férula de acero inoxidable	Fibra óptica de precisión	MM-FER2003SS-265	265 micras diámetro interior
mL jeringa	BD	14-823-30	La punta Luer-lok es preferible para reducir el riesgo de fugas, pero no es estrictamente necesaria
Epoxi plástico	Fibra óptica industrial	40 0005
Aguja roma de calibre 18	BD	305180
Toallita sin pelusa de 1,5 pulgadas de largo (KimWipe)ThorLabs		KW32	disponible en muchos proveedores
Lámina absorbente ligera	ThorLabs	BKF12
Cinta aislante	3M	Temflex 1700	Opcional, puede sustituir a otras marcas / modelos
Aguja afilada de calibre 26	BD	305111	0,5 pulgadas de longitud
Micromanipulador	Siskiyou	70750000E	puede sustituir a otras marcas/modelos
Brazo esteretáctico	Kopf	1460	puede sustituir a otras marcas/modelos
Las gafas de seguridad láser	KenTeK	KCM-6012	deben seleccionarse en función del color del láser utilizado, ejemplo dado aquí
Láser u otra fuente de luz	vortran	Stradus 473-50	ejemplo de láser azul
Esfera integradora	ThorLabs	S142C	Medidor de potencia adjunto, también disponible en ThorLabs, artículo #PM100D
Cámara de grabación Ultem	Crist instrument company	6-ICO-J0	Personalizado con muesca de alineación
Microdrive de torre con abrazaderas	NAN	DRTBL-CMS
Tubo guía	Personalizado	N/A	Hecho de aguja espinal (BD) de calibre 25 o tubo romo
Sistema de controlador NAN	NAN	NANDrive
Diseño de cuadrícula personalizado		personalizados	personalizados disponibles a pedido
Pinzas romas	FischerScientific	08-875-8A	pinzas romas genéricas de acero inoxidable Pinzas
digitales	Neiko	01407A	Disponible en amazon.com. Puede seleccionar un calibrador de resolución más fina para mediciones más precisas.
Cable	de conexión ThorLabs	FG200LCC-custom	Este es un ejemplo de muchos cables de conexión posibles. Siempre que el diámetro de la fibra sea menor o igual al diámetro de la fibra del iluminador de gran volumen y siempre que los conectores interactúen, cualquier cable de conexión (vidrio o plástico, comprado o fabricado en el laboratorio) está bien para esta aplicación.
Tapones antipolvo de plástico transparente	ThorLabs	CAPF	Paquete de 25
manguitos de acoplamiento divididos de cerámica	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S