Artículo de método

Investigación básica en medicina de Plasma - un enfoque de rendimiento de procesamiento de líquidos a las células

DOI:

10.3791/56331

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17 de noviembre de 2017

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1ZIK plasmatis, Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology

En este artículo

Resumen

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Se muestra un protocolo de tratamiento de plasma físico frío de alto rendimiento de las células y líquidos. Se trata de configurar composiciones de gas de alimentación diferentes para ignición de plasma, medición de espectros de emisión de plasma y el posterior análisis de líquidos y actividad celular después del tratamiento de plasma.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la medicina de plasma, gases ionizados con temperaturas cercanas a la de sistemas vertebrados se aplican a las células y tejidos. Plasmas fríos generan especies reactivas conocido a redox regular procesos biológicos en la salud y la enfermedad. Evidencia preclínica y clínica señala efectos beneficiosos del tratamiento con plasma en la cicatrización de la úlcera crónica de la piel. Otros temas emergentes, tales como tratamiento del cáncer de plasma, están recibiendo una atención creciente. Investigación médica de plasma requiere conocimientos interdisciplinario en física, química y biomédica. Uno de los objetivos de la investigación del plasma es caracterizar células tratadas con plasma en una variedad de aplicaciones específicas. Esto incluye, por ejemplo, recuento y viabilidad, oxidación celular, actividad mitocondrial, citotoxicidad y modo de muerte celular, análisis de ciclo celular, la célula la expresión superficial del marcador y liberación de citoquinas. Este estudio describe los equipos esenciales y flujos de trabajo necesarios para la investigación en Biomedicina de plasma. Describe el funcionamiento de un chorro a presión atmosférica argón plasma, específicamente seguimiento sus espectros de emisión básicos y alimentación configuración de gas para modular la producción de especies reactivas. Utilizando una mesa xyz de alta precisión y software de computadora, el chorro es sobrevolado en milisegundo precisión las cavidades de las placas de 96 pocillos en micrómetro de precisión para la máxima reproducibilidad. Se muestran ensayos de aguas abajo para el análisis de líquido de moléculas redox activos, y las células blanco son tratados con plasma. Específicamente, se analizan las células del melanoma en una secuencia eficaz de diferentes ensayos consecutivos pero usando las células del mismo: medida de actividad metabólica, celular total y la expresión superficial del marcador de la calreticulina, una molécula importante para la muerte de la célula inmunogénica de las células cancerosas. Estos ensayos recuperar contenido información biológica acerca de los efectos de plasma de una sola placa. En conjunto, este estudio describe los pasos esenciales y protocolos para la investigación médica de plasma.

Introducción

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Especies reactivas son reguladores redox importantes en la enfermedad, incluyendo cicatrización anormal1 y el cáncer. 2 importante, estas especies están implicadas en la patología, así como su resolución terapéutica. 3 , 4 frío física plasma es un gas ionizado que expulsa especies reactivas de muchas clases. 5 desde la llegada del supuesto plasmas fríos que operan a temperatura de cuerpo6, plasmas fríos pueden aplicarse a las células y tejidos sin daño térmico. Demostrando la eficacia y la aplicación segura de los dispositivos de plasma en las observaciones preclínicas y clínicas, tres han recibido acreditación como dispositivos médicos en Alemania. 7 sobre todo en cuanto a seguridad de genotóxicos, varios estudios han demostrado la ausencia de eventos mutagénicos con el primer dispositivo, un jet de plasma de argón de la presión atmosférica. 8 , 9 , 10 los otros dos dispositivos son vertidos llamados de barrera dieléctrica (DBD), que funcionan mediante un principio diferente que el chorro de plasma. Específicamente, jets permiten bisturí-como tratamiento de superficies y cavidades mientras que plasmas DBD son eficaces en el tratamiento de zonas de tejido más grande pero más bien plana. Explotando el celular redox señalización11, el objetivo de la técnica es utilizar especies reactivas generadas por plasma para aplicaciones biomédicas. 12 una aplicación especialmente prometedora de la terapia de plasma clínica es el apoyo de la cicatrización de heridas. 13 , 14 , 15 además, plasma fue demostrado para tener efectos contra el cáncer en modelos animales. 16 , 17 , 18

Antes de validar la eficacia y seguridad de las aplicaciones del plasma en modelos animales, o incluso los seres humanos, estandarizado en vitro las necesidades de investigación a realizar con los dispositivos de plasma. Estos experimentos son esenciales para explorar aplicaciones de plasma y delinear los mecanismos en el trabajo. Por otra parte, la investigación básica es necesario para comprender el impacto de la composición de especies reactivas y posteriores efectos biológicos. Este estudio demuestra cómo se puede integrar en investigación biomédica para comprender mejor y controlar sus efectos en las células de plasma. Describe la adaptación de la composición del gas de la alimentación, supervisión de la producción de especies reactivas, aplicaciones de plasma, líquidos, tejidos, células, y los resultados químicos y biológicos resultantes. Además, se proporcionan ejemplos que instruir sobre la normalización del tratamiento de plasma y posteriores ensayos biológicos, con énfasis en investigación médica plasma en placas de 96 pocillos. Este enfoque tiene ventajas: i) la minimización del número de células necesarias por condición, reactivo costos y tiempo de práctica por muestra; II) asignación de una mayor precisión de los resultados como tratamientos duplicados o triplicados pueden configurarse con facilidad; y iii) facilitación de ensayo aguas abajo lector de placas de formato de 96 pocillos, proyección de imagen y experimentos de citometría de flujo.

Protocolo

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1. plasma especies monitoreo y configuración de tratamiento

  1. Especie de plasma control
    1. Utilice un chorro de plasma de la presión atmosférica y un máximo de dos litros por minuto de flujo de gas de alimentación estándar.
    2. Perpendicular al eje de la pluma, la posición del chorro delante de un espectrofotómetro de emisión óptica y registro fotoemisión y longitud de onda (200-1.000 nm) usando software dedican.
    3. Mezclar 0.5% de nitrógeno o de oxígeno ya sea seco o humidificado (5%) gas de la alimentación.
    4. Repita la espectroscopia de emisión óptica para cada condición de gas.
    5. Analizar con el software apropiado para la representación gráfica de datos.
  2. Instalación de tratamiento de plasma
    1. Fijar el chorro a una mesa de xyz dirigido por ordenador.
    2. Identificar la posición de los pozos y generar un script de ordenador para mover el jet se unió a la mesa, con los tiempos de tratamiento adecuado, sobre el centro de cada pozo.
    3. Añadir 104 de cualquier tipo de mamíferas células adherentes en 100 μl de medio de cultivo celular completa (RPMI1640 con 10% FCS, glutamina 2% y 1% de penicilina/estreptomicina) en varios pozos bajo campana de flujo laminar.
    4. Permiten la adhesión celular a ocurrir durante la noche a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono.
    5. Tratar las células con plasma de 20 s a diferentes alturas (z) intervalos de 250 μm.
    6. Añada 25 μl de yoduro de propidio en medio de cultivo celular en cada pocillo.
    7. Imagen de las células bajo el microscopio para determinar la altura específica que no induce necrosis de las células debido a la alimentación de gas empuja el medio de cultivo sobre las células a un lado.
      Nota: Por más tiempo de tratamiento, identificar líquido evaporación en esta altura particular, en el plasma y desactivar el modo, por la placa de pesaje antes y después del tratamiento de plasma para identificar la cantidad de microlitros de doubledistilled agua necesaria para restablecer homeostasis osmótica en los pozos tratados.
    8. Preparar un protocolo final para la tabla xyz con tiempos respectivos de tratamiento (aquí: 20 s, 40 s, 60 plasma s y 60 s gas control) y bien puestos, y listos pipetas multicanales y depósitos para manejo de líquidos de placas de 96 pocillos en ensayos posteriores.

2. Análisis de principales componentes reactivos líquidos tratados con Plasma

  1. Análisis de tratados con Plasma de peróxido de hidrógeno
    1. Tratar 100 μl de solución salina con tampón fosfato (PBS) con plasma por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano.
    2. Preparar una mezcla de maestro por la carga de 100 μl de PBS con 10 U de peroxidasa de rábano y 5 μm de reactivo de detección de peróxido de hidrógeno (suficiente para un bien, aumentar en consecuencia).
    3. Agregar 95 μl de la master mix a cada pocillo.
      Nota: El paso anterior debe realizarse bajo un banco limpio o en una habitación separada de la de la fuente de plasma de ozono de aire ambiente puede disminuir la sensibilidad del ensayo.
    4. En un plato aparte, preparar una serie de doble dilución de peróxido de hidrógeno en PBS con una concentración superior de 100 μm de 100 μl PBS.
    5. Añadir 5 μl de peróxido de hidrógeno o las muestras a los pocillos que contienen el reactivo de detección.
    6. Incluyen pozos que contienen reactivo de detección solamente para la sustracción de fondo después de la lectura.
    7. Incube la placa en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.
    8. Colocar la placa en el lector de microplacas miden fluorescencia en λex 535 nm y λem 590 nm.
      Nota: Si se esperan altas concentraciones de peróxido en las muestras, la dilución de la muestra debe incrementarse o lecturas deben hacerse con tiempos de incubación más cortos para evitar la saturación del ensayo.
    9. Restar valores en blanco de todas las muestras, calcular la curva estándar de peróxido y cuantificar las concentraciones de peróxido muestra desconocida de esa curva de la línea de base.
  2. Análisis de Plasma tratado con nitrito
    1. Tratar 100 μl de PBS con plasma por triplicado en placas de placas 96well.
    2. Preparar una mezcla principal de solución de detección de nitrito mediante la adición de 1 μl de reactivo de cuantificación a 99 μl de doubledistilled agua (suficiente para un bien, aumentar por consiguiente).
    3. Añada 100 μl por pozo a una placa 96well claro, placas. Ampliar según sea necesario para el número de pozos.
    4. Preparar una serie de dilución de estándares de nitrito en agua doubledistilled.
    5. Añadir 10 μl de estándares o muestras a la mezcla principal en 96well placas.
    6. Incube la placa en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    7. Añadir 5 μl de solución de revelado de la cuantificación de nitrito a cada pocillo.
    8. Leer la fluorescencia en un lector de microplacas a λex 365 nm y λem 450 nm.
    9. Restar valores en blanco de todas las muestras, calcular la curva estándar de nitrito y cuantificar las concentraciones de nitrito muestra desconocida de esa curva de la línea de base.
  3. Análisis de superóxido tratados con Plasma
    1. Hacer una mezcla maestra de citocromo oxidado (1 mg/mL) y catalasa (20 μg/mL) en PBS.
    2. Añada 100 μl de la mezcla principal a los pocillos de una placa de 96 pocillos clara, fondo plano.
    3. Tratar la mezcla principal con plasma en triplicado por la condición de tratamiento.
    4. Leer absorbancia a 550 nm utilizando un lector de microplacas; graficar estos datos.
    5. Calcular la cantidad de superóxido generado utilizando el coeficiente de extinción molar del citocromo C y la longitud de la trayectoria de la luz del líquido dentro de un pozo.

3. la respuesta biológica de las células expuestas a Plasma

  1. Lectura multidimensional de células tratadas con Plasma: actividad metabólica
    1. Utilizar una campana de flujo laminar para todos de los siguientes procedimientos.
    2. Semilla 104 células (melanoma murino B16) 100 μl totalmente complementan con medio de cultivo de células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano.
    3. Permiten la adhesión celular durante la noche a 37 ° C en el ambiente humidificado de la incubadora con 5% de dióxido de carbono.
    4. Utilizando la tabla de xyz, tratar pozos con plasma o gas según un esquema predefinido y añadir las células nuevamente dentro de la incubadora durante 20 h.
      Nota: Si lo desea, sacar sobrenadante después de 20 h para analizar productos extracelulares; Agregar luego 100 μl de medio fresco.
    5. A cada pocillo, añadir 25 μl del medio de cultivo celular que contiene 500 μm resazurina (concentración final 100 μm); preparar tres pozos con resazurina solo en medio de cultivo celular sin células de fondo.
    6. Incubar durante 3 horas en la incubadora.
    7. Leer la fluorescencia en λex 535 nm y λem 590 nm en un lector de microplacas.
    8. Reste la fluorescencia del fondo de todas las muestras y normalizar datos a valores de control.
  2. Lectura multidimensional de células tratadas con Plasma: Análisis de imagen
    1. Utilizar la placa de la pozo de 3.1.7 y descartar el sobrenadante.
    2. Añada 100 μl de medio de cultivo de células frescas con yoduro de propidio de 1 μg/mL.
    3. Colocar la placa bajo un microscopio con una etapa motorizada a la imagen de cada pozo.
      Nota: Los datos de la proyección de imagen dependen de la pregunta experimental; aquí, objetivo 20 X fue utilizado en un dispositivo de proyección de imagen de alto contenido para leer campos de 3 x 3 vista en cada pozo en un campo brillante canal, canal de contraste de fase digital y canal de fluorescencia (yoduro de propidio), utilizando la luz adecuada excitación y emisión filtros.
    4. Uso software de análisis de imagen cuantitativo para determinar la superficie citosólica en imágenes de contraste de fase digital de todos los campos de vista reflejada en cada pozo.
      Nota: Analizar otros parámetros si lo desea, por ejemplo, el número de células viables y/o muertas o actividad mitocondrial usando manchas dedicadas. Si utiliza otras manchas que se describen en este trabajo, asegúrese de que las manchas de fluorescencia utilizadas para microscopía no espectral se superponen con los fluorocromos utilizados en experimentos de citometría de flujo posterior.
    5. Gráfico de los datos y si lo desea, la prueba de correlación con los valores obtenidos para la actividad metabólica.
  3. Lectura multidimensional de células tratadas con Plasma: citometría de flujo
    1. Para este análisis, utilice la placa de la pozo paso 3.2.5.
    2. Deseche el sobrenadante y lavar dos veces con 200 μL de PBS que contiene calcio y magnesio (0,9 mM y 0,5 mM, respectivamente).
      Nota: Fijar y permeabilizar las células en esta fase más biológicas lecturas no cubiertos en esta contribución, como la tinción de análisis intracelular del antígeno o ciclo celular.
    3. A cada pocillo, añada 50 μl de PBS con calcio y magnesio que contiene anticuerpos de monoclonales de anti-ratón calreticulina ng/mL 50.
    4. Incubar durante 15 min en la incubadora.
    5. Lavado dos veces con 200 μL de totalmente suplido de medio de cultivo celular y elimine el líquido de la placa.
    6. Añadir 100 μl de solución de la separación de células a cada pozo e incubar por 20 min en la incubadora.
    7. Utilizar otro conjunto de células sin manchas de B16 en suspensión para configurar el protocolo de adquisición flujo cytometric, estrategia y ganancias y los voltajes de fotodetectores que bloquean.
    8. Coloque la placa en un citómetro de flujo equipado con un muestreador automático para placas de 96 pocillos.
    9. Adquirir un mínimo de 1.000 células en el delantero y lateral dispersión población generalmente asociado con células viables.
    10. Utilizar software dedicado para el análisis de citometría de flujo, archivos .fcs a la puerta de la población de interés y determinar la intensidad de fluorescencia media de calreticulina.
    11. Ver datos y si lo desea, la prueba de correlación con los valores obtenidos para la deposición de actividad, proyección de imagen o antioxidante metabólica.

Resultados

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En este estudio, fue descrito un flujo de trabajo optimizado para la investigación médica sobre los efectos de plasma. El enfoque multidisciplinario utilizado aquí analiza el perfil de emisión óptica básica del chorro de plasma, los principales componentes reactivos en el líquido, y las respuestas biológicas de las células trataron con plasma (figura 1).

Para realizar este flujo de trabajo, un número de componentes se necesita para configurar correctamente la fuente de plasma (figura 2). Los diversos gases (aquí principalmente argón, oxígeno y nitrógeno) fueron suministrados a y controlados por varios controladores de flujo másico. Un panel central se utilizó para ajustar digitalmente los controladores de flujo másico para flujos de gas de alimentación predeterminada. Para producir composiciones de gas específico de la alimentación, los gases se mezclaron físicamente utilizando un panel de las válvulas que combinado gases de entre varios controladores de flujo de masa (figura 2A). La fuente de plasma fue encendida, y el efluente de plasma se estableció frente a un espectrofotómetro de USB (figura 2B) con un rango óptico de 200 nm a 1000 nm. Para el tratamiento de los líquidos y las células, un flujo de trabajo eficiente fue descrito usando placas de 96 pocillos. Placas de varios pocillos se llevaron a cabo utilizando un marco plástico que se fija en la placa base con inserciones a sus orificios impresas (figura 2C). La configuración entera fue puesta bajo una campana de flujo laminar (figura 2D). Esta configuración incluye una tabla de xyz a la que se montó la pieza de mano del chorro de plasma. Los elementos de control del motor pueden ser ubicados fuera del Banco, si éste es suficientemente grande con cable puertos desde y hacia la mesa de xyz. Importante, la tabla fue controlado por ordenador y puede ser programada para suspender el chorro sobre el centro de cada pocillo con la precisión del micrómetro para la cantidad de tiempo deseada. Por otra parte, la posición de inicio (como en nuestra configuración, bien A1) fue elegida libremente (figura 2E). Junto con el soporte de placa de plástico, esto permitió un tratamiento plasma reproducible con cualquier variación diaria exclusivamente relacionadas con la configuración de los experimentos biológicos y líquidos.

Espectroscopia de emisión óptica (OES) se utilizó para seguir distintos picos relacionados con componentes del plasma reactivo en condiciones diferentes gas de la alimentación (figura 3A). Por ejemplo, el segundo sistema positivo de nitrógeno con picos de 330 nm a 380 nm representan especies de nitrógeno reactivo y el pico a 309 nm representa de radicales de hidroxilo (flecha en figura 3A). Comparado con gas argón solo, aumentó la presencia de especies de nitrógeno con una mezcla de nitrógeno en el gas de la alimentación, mientras que la adición de oxígeno o humedad disminuida o reducida, respectivamente. Por el contrario, la presencia de radicales hidroxilo se disminuyó con oxígeno o nitrógeno pero aumenta marcadamente si humidificado argón fue utilizado como gas de la alimentación. Para el tratamiento de los líquidos en plasma, la evaporación causada por el gas argón y argón plasma se determinó primero (figura 3B). Lo importante, ambas condiciones no dió resultados similares porque plasma también ejerce efectos sobre la temperatura. En consonancia con los resultados OES de radicales hidroxilo, deposición de peróxido de hidrógeno significativamente disminuida con la adición de oxígeno o nitrógeno pero aumentó con gas humidificado de la alimentación (figura 3C). Por otra parte, la adición de nitrógeno en el gas de la alimentación condujo a las concentraciones de nitrito significativamente mayores en comparación con los líquidos tratados con plasma de argón (figura 3D). Este flujo de trabajo también puede ser empleado para investigar el impacto de plasma en líquidos con distintas composiciones. Por ejemplo, las concentraciones de peróxido de hidrógeno parecen ser independiente de la presencia de suero de ternera fetal en el PBS y RPMI1640 medio de cultivo celular (figura 3E). En las mismas muestras, la presencia de suero disminuyó las concentraciones de nitrito en medio de cultivo PBS y célula en comparación con los no-suero que contiene (figura 3F). Más superóxido se produjo en las condiciones de gas argón seco con adiciones de oxígeno y/o nitrógeno amortiguamiento significativamente la generación de superóxido, excepto el plasma de argón-oxígeno humidificado (figura 3G).

Para el tratamiento de plasma de las células en placas de varios pocillos, la placa que contiene las células sembradas el día anterior fue quitada de la incubadora y agregada para el soporte de plástico. Se aplicó un modelo de tratamiento programado, era compensar la evaporación y la placa fue colocada en la incubadora durante 20 h. Nota que después de la incubación, sobrenadantes de cultivo celular podrían han sido recogidos en una placa de 96 pocillos nuevo, vacíela y almacenado a- 80 ° C para la evaluación de las proteínas de interés. A continuación, resazurina fue agregado a las células de cada pozo. Facturación de resazurina no fluorescente para resorufin fluorescente sólo se vio facilitado por enzimas activas de generación de NADPH y se correlacionó con la actividad metabólica general (figura 4A). Intensidades de fluorescencia fueron similares a la percepción visual de la placa e indicaron efectos citotóxicos del tratamiento prolongado de plasma (figura 4B). Condiciones de gas humidificado eran más perjudiciales que las condiciones del gas seco. Las mismas células de la placa fueron utilizadas para ensayos de más abajo. Las células de la placa fueron microscópicamente investigados (figura 4C). Utilizando software de proyección de imagen, varios pozos de la placa fueron examinados para comparación cualitativa (figura 4D). Software permite la cuantificación del área total cubierta por las células dentro del campo de visión adquirida en cada pozo y se normalizaron los datos resultantes a los respectivos controles (figura 4E). Se observó una disminución del área total de la célula en las muestras de tratamiento del plasma, sobre todo con las condiciones del gas humidificado de la alimentación. Después de la proyección de imagen, las células fueron lavadas, teñidas con anticuerpos anti-ratón calreticulina, separadas y analizaron mediante citometría de flujo (figura 4F). Significa fluorescencia intensidades de calreticulina de tinción en células viables (figura 4G) fueron calculados y comparadas entre las muestras (figura 4H). Tratamiento de plasma inducida por un upregulation de calreticulina en superficie de la célula de melanoma murino, que correspondió al tiempo de tratamiento del plasma aplicado a condiciones de gas seca de la alimentación. Para humidificado condiciones de gas de la alimentación, 20 s y 40 s de tratamiento inducido por una fuerte exposición de calreticulina en comparación con el más letal 60 s tiempo de tratamiento. Esto sugiere que hubo una regulación no-lineal de la calreticulina de exposición con respecto a la cantidad de antioxidantes que te presenten a las células.

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Figura 1 : Flujo de trabajo de investigación médica del plasma de la física a la biología de. La producción de especies reactivas del chorro de plasma de argón de la presión atmosférica está sintonizada modulando el gas de la alimentación. Las moléculas en la fase de gas de plasma se controlan usando la espectroscopia. El plasma se utiliza para tratar líquidos e investigar deposición de oxidante. Las células cultivadas en microplacas son tratados con plasma, y se realizan lecturas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 : Configuración del Banco de investigación plasma. (A) gases diferentes en acero inoxidable tubos son conducidos en varios controladores de flujo másico que se controlan mediante un panel central. La composición del gas de la alimentación individual se mezcla después con un panel de las válvulas. (B) algunos componentes reactivos del plasma pueden controlarse usando la espectroscopia de emisión óptica para investigar diferencias entre varias composiciones del gas de la alimentación. (C) para la investigación del plasma de alto rendimiento, se utilizan microplacas de 96 pocillos. Para asegurar un constante punto de partida para el tratamiento del plasma automatizado y programable, la placa se agrega a un marco garantizando la misma posición absoluta de placas al día. (D) el chorro de plasma se fija a una controlado por ordenador xyz mesa ubicada bajo una campana de flujo laminar. Todos 96 ubicación exacta y el tiempo de permanencia del plasma sobre cada uno bien se escribe en un archivo de programa para guiar el movimiento de la fuente de plasma. La cubierta principal de los aparatos de chorro de plasma, así como los controles de motor se encuentran en las inmediaciones. (E) automatizado de tratamiento de plasma de una placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 : Chorro de plasma y el líquido análisis. (A) se muestra espectroscopia de emisión óptica de las condiciones del gas de alimentación diferentes. El segundo sistema positivo de nitrógeno (330 nm a 380 nm) fue aumentado con la adición de nitrógeno, ausente en el caso de la adición de oxígeno y notablemente reducido con argón humidificado (paneles de la izquierda). El pico de radicales hidroxilo en 309 nm (flecha) disminuida en condiciones de nitrógeno y oxígeno pero aumentados marcado con argón humidificado en comparación con el gas argón solo. Exposición de líquidos conduce a la evaporación del Gas (B). La cantidad de evaporación por pozo en una placa 96well sobre el tratamiento con plasma y argón gas solo se determinó pesando la placa antes y después del tratamiento usando una escala fina. Evaporación en las muestras de plasmatreated fue superior comparado con en las muestras de gastreated de argón. (C) generación de peróxido de hidrógeno en los líquidos de plasmatreated correlacionada en cierta medida con el pico nm 309 de radicales hidroxilo en (A). Humidificado plasma de argón (5%) aumentó aproximadamente 4fold peróxido concentraciones. (D) nitrito fue elevado cuando el nitrógeno fue agregado al gas de alimentación, y este efecto fue aumentado con plasma de argón humidificado. La adición de oxígeno disminución de generación de nitrito pero no significativamente. (E, F) Concentraciones de peróxido y nitrito de hidrógeno aparece en diferentes tipos de líquidos, es decir, RPMI1640 medio de cultivo celular con (R10F) y sin (R0F) así como PBS con y sin suero fetal de ternero (FCS). Niveles de peróxido no difirió entre los diferentes medios de comunicación (E) mientras que los niveles de nitrito fueron disminuidos perceptiblemente en presencia de suero. (G) producción de superóxido fue mayor para el gas argón seco de alimentación gas; adición de nitrógeno, oxígeno o argón humidificado dio menor deposición de superóxido en el líquido. Datos mostrados (B-G) son la media + SEM de dos o tres experimentos. El análisis estadístico fue realizado (C, D) con una vía análisis de varianza comparando medios conjunto de condiciones de gas seco o húmedo de la alimentación contra el control respectivo (** p < 0.01; *** p < 0,001). Además, las condiciones sólo para gas plasma de argón se compararon mediante la media de todo el grupo y la prueba de t (### p < 0,001). Más análisis estadístico (F) se realizó utilizando pruebas t comparando los valores de cada tratamiento del plasma y la condición media en las muestras con FCS ni FCS (* p < 0.05; ** p < 0.01); también, FCS o soluciones que contienen FCS no se compararon en cada tiempo de tratamiento de plasma utilizando la prueba t (# p < 0.05; ## p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 : Tratamiento del plasma y su impacto en las células. (A) las células fueron expuestas al plasma y resazurina fue agregado después de 20 h para evaluar la actividad metabólica. (B) actividad disminuyó significativamente en las muestras plasmatreated comparadas a los controles de gas. Una disminución marcada fue vista con la humectación de los gases de alimentación mientras que la adición de oxígeno o nitrógeno provoca toxicidad en condiciones de gas argón seco y húmedo. (C) medio que contiene yoduro de propidio (PI) fue agregado. (D) un resumen se muestra en los pocillos de la placa con contraste de fase digital (naranja) que representa la fracción citosólica de cada célula y PI (verde) para identificar las células muertas. Herramientas de imagen permitió la cuantificación de la superficie total dentro del campo de visión de cada uno bien cubierto con las células. (F) las células fueron lavadas y se incubaron con anticuerpos o con otros marcadores de la célula para caracterizar efectos de plasma biológico mediante citometría de flujo. (G) se emplearon estrategias de Gating y análisis del marcador fue realizado y en comparación entre muestras. Datos mostrados (B, E, H) denotan la media + SEM de un representante de tres experimentos independientes. Barra de escala = 200 μm (D). Comparación estadística se realizó mediante dos vías análisis de varianzas (B, H) comparando, para cada condición de gas, cada tratamiento de plasma para su control respectivo gas (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001). Además, los valores para cada condición de adiciones de nitrógeno y/u oxígeno se compararon con valores de plasma de gas argón para seco y húmedo condiciones por separado (dos vías análisis de varianzas; ### p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Investigación básica es fundamental para el desarrollo de una comprensión de la eficacia de los mecanismos que sustentan la medicina de plasma en investigación preclínica y clínica. Investigación fundamental también promueve la investigación de nuevas aplicaciones para los tratamientos. Aunque está bien establecido que plasmas median sus efectos biológicos a través de la generación de oxígeno reactivo y nitrógeno especies19, todavía hay tres principales desafíos en el campo. ¿En primer lugar, las especies son importantes? Esto se puede contestar en parte mediante la modulación de la composición del gas de la alimentación de plasmas con diagnóstico óptico y lecturas biológicas. 20 en segundo lugar, ¿qué efectos pueden verse en objetivos biológicos como las células? Esto, al menos en parte, trata con experimentos de cultivo de células y un número de ensayos. En las células eucariotas, efectos pleiotrópicos incluyendo ciclo de la célula detención21, apoptosis22, necrosis23y piel celular estimulación24,25,26, así como un apoyo o disminución de células motilidad o actividad metabólica27,28,29. El tercer desafío, relacionadas con estos efectos pleiotrópicos, es identificar las moléculas claves que determinan la respuesta celular a oxidantes derivados de plasma para explicar diversos efectos en diferentes tipos de células. Esto puede hacerse por ómicas técnicas30,31,32 , o para arriba o desregulación de genes de la blanco usando siRNA (redox) señalización inhibidores, antioxidantes y enzimas antioxidantes, así como la modulación de la producción de especies reactivas de plasma. 33 , 34 , 35 por lo tanto, protocolos de ensayo aerodinámico son necesarios para grandes conjuntos de muestra con un gran número de iteraciones de pruebas.

Este estudio es un ejemplo de un flujo de trabajo experimental eficaz, desde la física a la biología, para la investigación médica plasma con respecto a los retos antes mencionados. Detalles sobre los aspectos de ingeniería de la fuente del plasma y la generación de plasma se han descrito antes. 36 , 37 , 38 todos estos ensayos se realizan en las placas 96well, que tiene un número de ventajas. Por ejemplo, muestras como sobrenadantes de cultivo celular pueden ser fácilmente llevadas de ensayo placas de colección para investigar, por ejemplo, las concentraciones de proteína a través de la enzima-ligado-análisis del inmunosorbente. Si hay equipamiento científico capaz de leer directamente de 96 pozos, este enfoque reduce al mínimo los costos por muestra y handsontime y maximiza resultados al multiplexar diferentes ensayos de la misma muestra. El uso de multicanal pipetas además agiliza la manipulación de la muestra. En principio, el ensayo descrito aquí puede también llevarse a cabo utilizando formatos de placa bien con diámetros muy grandes, aunque esto requeriría pasos pipeteo adicionales en otros tubos y recipientes para análisis de aguas abajo. Tipos de placa más pequeños tales como placas de 384well, sin embargo, no presentan la geometría conveniente para la investigación biomédica plasma con chorros de flujos de gas grande de la alimentación. En concreto, no puede garantizarse que pozos solos pero no adyacentes son afectadas durante el tratamiento.

Análisis de líquido son esencial para investigar el depósito de especies por el plasma. En los análisis de expertos, una configuración paralela de diferentes ensayos puede caracterizar líquidos plasmatreated en cuanto a antioxidantes diferentes al mismo tiempo. Esta multiplexación permite el desarrollo de un cuadro distinguido de plasmaderived especies. El enfoque descrito es altamente sensible a investigar las concentraciones de peróxido de hidrógeno al39, que a menudo es necesario pero no siempre suficiente para explicar efectos de plasma. 40 , 41 , 42 efectos biológicamente relevantes también pueden ser evaluadas en líquidos con un ensayo de glutatión no incluido aquí. 43 el ensayo de nitritos específicos se recomienda sobre Griess-ensayos convencionales debido a la sensibilidad del ensayo mayor 10fold (datos no mostrados). Plasmatreated líquidos también se pueden investigar para la formación de ácido hipocloroso mediante el ensayo de DTNB. Sin embargo, los resultados anteriores no indica la formación de esa especie con nuestra fuente de plasma. 19 , 39 , 44 cuando haya terminado el tratamiento del plasma, deterioro de especies ocurre en el tiempo. Nitrito reacciona en nitrato; también, el peróxido se consume con el tiempo. Sin embargo, estos procesos toman varias horas. 35 absorción c citocromo es estable durante varias horas así. Por ello, si procesos ocurren dentro de los primeros 30 min después del tratamiento, variación en las concentraciones de las especies de larga vida descritas aquí son insignificantes. Sin embargo, debe tenerse cuidado al investigar ciertos tipos de medios de comunicación (p. ej., medio de Eagle modificado de Dulbecco) como ingredientes puede compactar hasta al 90% de peróxido dentro de 1 h (datos no mostrados) conduce a una subestimación de la deposición de peróxido de plasma en líquidos.

Un ensayo múltiple se presenta que las gamas de investigar actividad metabólica sobre la superficie celular (morfología) a la expresión de marcadores de superficie celular. Una combinación de estos análisis puede revelar resultados interesantes. Por ejemplo, ya hemos demostrado en THP1 monocitos que cuentas célula y actividad metabólicas no disminuye de forma lineal después de la exposición al plasma. En vez de 45 , con el aumento del tiempo de tratamiento de plasma, las células fueron observadas que aumentaron de tamaño y tenía una mayor masa mitocondrial, lo que conduce a mayores tasas metabólicas en una base de percell. Esencialmente, la combinación de lector del multiplate, microscopia y citometría de flujo multiplexa la información sobre respuestas celulares después de un tratamiento de plasma. En células de melanoma, nos centramos aquí en efectos citotóxicos y su inmunogenicidad mediada por calreticulina. 46 en principio, muchas otras preguntas pueden abordarse con esta aproximación a la actividad metabólica con la proyección de imagen y flujo cytometry resultados. Por ejemplo, diferenciación de la célula (por ejemplo, la polarización de macrófagos), potencial de la membrana mitocondrial, análisis de ciclo celular, la motilidad celular, biomecánica o formación de micronúcleos para el análisis de genotoxicidad puede también ser investigada en células tratadas con plasma. Citometría de flujo multicolor permite incluso más aplicaciones en diferentes poblaciones celulares al mismo tiempo. Esto incluye, por ejemplo, el análisis del estado de fosforilación de proteínas como factores de transcripción, cuantificación de ARNm, medición de citocinas intracelulares, o evaluación de tioles reducidos total a nivel de célula de señalización. Adicional información biológicamente relevante que está disponible para cada muestra ayuda en desarrollar el cuadro de efectos redox de plasma para entender mejor las aplicaciones de plasma actuales y futuros.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Financiado por el Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF concesión 03Z22DN12 y 03Z22DN11 de números) se agradece.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de detección accutaseBioLegend423201
amplex Ultra Red (incluye peroxidasa de rábano picante y H2O2)ThermoA36006
gas argónAir LiquideN50
B16F10 células de melanoma murinoATCCCRL-6475
catalasaSigmaC30
incubadorade cultivo celularBinderCB210
plástico para cultivo celularNUNC156545
citocromo c, oxidadoSigmaC2037
análisis de datossoftware GraphPadprisma 7.03
suero fetal bovinoSigmapor lotes escala
finacualquiera con resolución de 0,01 mg
citómetro de flujoBeckman-CoulterCytoFlex S
citometría de flujo análisis de datosBeckman-CoulterKaluza 1.5a
GlutaminaSigmaG7513
software de cuantificación de imágenesPerkinElmerHarmony 4.5
campana de flujo laminarThermoMaxisafe 2020
controlador de flujo másicoMKSG-series
Kit de detección de nitritos Measure-iTMicroscopio ThermoM36051
PerkinElmerOperetta CLS
espectroscopía de emsión ópticaAvantesAvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilina/estreptomicinaPipetas Thermo15140122
Eppendorf/Marcasingle/multi chanel
lector de placasTecanM200pro
yoduro de propidioBioLegend421301
resazurinaVWRB21187.06
RPMI1640 medios de cultivo celularPanbioTechP04-16500
xyzmesa CNC pasoHIGH-Z S-400/T 
probado

Referencias

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