Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

Summary

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del protocolo para el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA). Este modelo permite a los investigadores a estudiar el crecimiento de células de osteosarcoma metastásico (OS) en el tejido del pulmón usando un widefield fluorescencia o un microscopio de escaneo láser confocal.

Abstract

El ensayo de metástasis pulmonar (PuMA) es un ex vivo el explante de pulmón y el sistema de cultivo de célula cerrada que permite a los investigadores a estudiar la biología de la colonización del pulmón en osteosarcoma (OS) por microscopía de fluorescencia. Este artículo proporciona una descripción detallada del protocolo y discute ejemplos de obtención de datos de imagen en crecimiento metastático con campo amplio o plataformas de microscopia confocal de la fluorescencia. La flexibilidad del modelo PuMA permite a los investigadores a estudiar no sólo el crecimiento de las células de la OS en el microambiente del pulmón, sino también evaluar los efectos de la terapéutica anti-metastásico con el tiempo. La microscopia confocal permite la proyección de imagen de alta resolución, sin precedentes de las interacciones de la célula de OS con la parenquimia de pulmón. Por otra parte, cuando se combina el modelo de PuMA con colorantes fluorescentes o reporteros genético proteína fluorescente, los investigadores pueden estudiar el microambiente del pulmón, las estructuras celulares y subcelulares, funciones de los genes y actividad del promotor en células metastásicas de OS. El modelo PuMA proporciona una nueva herramienta para los investigadores de osteosarcoma a descubrir la nueva biología de la metástasis y evaluar la actividad de nuevas terapias anti-metastásicas, dirigidas.

Introduction

Mejores resultados para los pacientes pediátricos con osteosarcoma metastático (OS) sigue siendo una crítica necesidad clínica ¹. Esto subraya la importancia de desarrollar nuevas terapias dirigidas molecularmente. Quimioterápicos convencionales que la proliferación de células de tumor de destino no han demostrado para ser eficaces en el tratamiento de enfermedad metastásica y, por tanto, estrategias novedosas deben apuntar el proceso metastático sí mismo ². El actual artículo discute los aspectos prácticos de un tipo relativamente nuevo de ex vivo el modelo metástasis de pulmón, el ensayo de metástasis pulmonar....

Protocol

Todos los protocolos de animal de que se obtuvieron datos de proyección de imagen fueron realizados con la aprobación del cuidado Animal y uso Comité de Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud. Todos los protocolos animales discuten y retratado en el artículo video han sido aprobados por el Comité de cuidado Animal de Universidad de British Columbia.

1. preparación de las células tumorales para la inyección y materiales para el modelo de PuMA

Nota: La cantidad de soluciones y células será suficiente para 1 ratón. Ampliar según sea necesario si más ratones se utilizan en el estudio. Recetas de ....

Results

Microscopía de fluorescencia de campo amplio de baja magnificación

Para microscopía de fluorescencia de campo amplio de lonchas de pulmón PuMA, imágenes representativas y cuantificación de datos se muestra en la figura 2y Figura 4A y B. Las propensiones metastásicas para líneas de alta y baja metastático de la célula son visual.......

Discussion

El siguiente artículo técnico describe algunos aspectos prácticos del modelo PuMA en el estudio de colonización pulmonar en OS. Algunos pasos críticos en el protocolo donde los investigadores deben tomar cuidado adicional son los siguientes:

a) canulación de la tráquea. La tráquea puede ser dañada fácilmente mientras que disecar el músculo circundante y el tejido conectivo. Además, la aguja del catéter puede introducirse fácilmente a través de la tráquea. Preste atención a cómo el bisel de la .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabla 2
de cultivo celular para medios A, medios B y medios completos
fuertesMNNG-HOS	LÍNEA	CELULAR DE SO altamente metastásico	CRL-1543
			celular de SG poco metastásico
MG63.3	Laboratorio Amy LeBlanc (NCI)	N/A línea	celular de SG altamente metastásica
MG63	ATCC	CRL-1427	celular de OS poco metastásico
10X M199 medios	Thermofisher	11825015	Medios base para medios A y medios B
Agua destilada (esterilizada)	Thermofisher	15230-147	Componente de medios A & B-media
7.5% solución de bicarbonato de sodio	Thermofisher	25080094	componente de A-media & B-media
Hidrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Componente de A-media & B-media
Acetato de retinol-soluble en agua	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Componente de A-media & B-media
Penicilina/estreptomicina 10X solución concentrada (10000 U/ml)	Thermofisher		15140122 Componente de A-media & B-media, medios completos.
Solución de insulina bovina (10 mg / ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Componente de A-media & B-media
DMEM, alto contenido de glucosa	Thermofisher	11965092	medio base de Complete
Media L-glutamina (200 mM)	Thermofisher	25030081	componente de Complete Media
Fetal Bovine	Serum Thermofisher	16000044	componente de Complete Media
Dulbecco' s Thermofisher 14190144 solución salina tamponada con fosfato			se utiliza en el cultivo celular.
Hank' s Solución de sales tamponadas, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol	Thermofisher	14175095	Se utiliza para resuspender el pellet celular antes de la inyección
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo	fenol Thermofisher	25200114	Se utiliza en cultivo celular.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Se utiliza para marcar el parénquima pulmonar.
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
Table 3
Materiales para PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Confocal LSM vertical microscopio
Zeiss 780 Confocal LSM	Zeiss N	/A	Microscopio confocal LSM invertido
ratones SCID	Charles River	N/A	NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, mujer, 6-8 semanas
de edad GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Se utiliza como soporte para secciones de tejido pulmonar.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Se utiliza durante la insuflación del pulmón.
Jeringa de 1 ml con aguja de calibre 27	Fisherscientific	14-826-87	Se utiliza para la inyección en la vena de cola.
Jeringa de 10 ml	BD 309604		Se utiliza para la insuflación pulmonar.
Catéter de calibre 20	Terumo	SR-OX2032CA	Se utiliza durante la insuflación del pulmón.
Juego de extensión Abbott IV (30", Estéril)	Medisca	8342	Se utiliza durante la insuflación del pulmón.
Hisopos con alcohol	BD 326895		Para limpiar la vena de la cola antes
Guantes quirúrgicos estériles	Fisherscientific	Varía según el tamaño	Manejo escéptico de los pulmones de ratón Regla de
30 cm	Grapas		Se utilizan para la insuflación del pulmón.
Soporte de soporte para regla	Pipette.com	HS29022A	Se utiliza para la insuflación del pulmón.
Placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm	Ibidi	81158	Se utiliza para la obtención de imágenes de cortes de pulmón
Almohadillas absorbentes con barrera contra la humedad impermeable	VWR	56617-014	Se utiliza para revestir el área de trabajo estéril en la campana biológica.
Catgut Sutura Lisa Absorbible	Braun	N/A	Se utiliza para atar la tráquea canulada.
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Table 4
Instrumentos quirúrgicos para PuMA
Micro Tijeras de disección 3.5" rectas afiladas/afiladas	Roboz	RS-5910	Para cortar secciones de pulmón
de 4" (10 cm) Punta Larga Dentada Recta Extra Delicada de 0,5 mm	Roboz	RS-5132	Para manipular/sujetar secciones pulmonares.
4" (10 cm) Punta larga dentada de curva ligera de 0,8 mm	Roboz	RS5135	Para manipular/sujetar secciones pulmonares.
pinzas de vendaje para el pulgar; Dentado; Delicado; 4.5" de longitud; 1,3 mm Ancho de punta	Roboz	RS-8120	Para disección general.
Pinzas de vendaje para el pulgar de 4,5" dentadas de 2,2 mm Ancho de punta	Roboz	RS-8100	Para disección general.
Tijeras de disección micro extrafinas de 3,5" rectas afiladas/afiladas, hoja de 20 mm	Roboz	RS-5880	para disección general.
Tijeras Knapp; Recto; Punzante-contundente; Longitud de la hoja de 27 mm; Longitud total de 4"	Roboz	RS-5960	Para disección general.