Este protocolo sirve como un esquema para establecer un sistema funcional de Tet-ON en líneas celulares de cáncer y su posterior utilización, en particular para estudiar el papel de proteínas derivadas de células de tumor en el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del tumor.
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Artículo de método
Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor
En este artículo
Resumen
Resumen
siRNA y shRNA-mediada derribar los métodos de regulación de la expresión génica (KD) son herramientas muy valiosas para entender la función del gen y proteína. Sin embargo, en el caso que la KD de la proteína de interés tiene un efecto letal sobre las células o el efecto esperado del KD es dependiente del tiempo, incondicionales métodos KD no son apropiados. Sistemas condicionales son más adecuados en estos casos y han sido objeto de mucho interés. Estos incluyen sistemas de sobreexpresión de ecdisona-inducible, citocromo P-450 inducción sistema1, y la tetraciclina regulado sistemas de expresión de genes.
El sistema de expresión de gene de tetraciclina regulado permite control reversible sobre la expresión de la proteína por la inducción de expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina. En este protocolo, se presenta un diseño experimental utilizando sistema Tet-ON funcional en líneas celulares de cáncer humano condicional regulación de la expresión génica. Entonces se demuestra el uso de este sistema en el estudio de la interacción monocito célula de tumor.
Introducción
Los macrófagos asociados tumor (TAMs) contribuyan al desarrollo de tumor por promover el crecimiento del tumor, metástasis y regular la respuesta inmune2. Cáncer células inflamatorias monocitos recluta, que infiltran el tumor y se diferencian en pro-tumorigenic TAMs3. Infiltración del tumor con TAMs correlaciona con mala evolución clínica y se ha relacionado con la función inmunosupresora de macrófagos4,5. Sin embargo, los mecanismos del reclutamiento de macrófagos que el tumor no se exploraron bien y una mejor comprensión de los caminos implicados es crucial par....
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Protocolo
La sección de protocolo que utiliza monocitos humanos obtenidas de voluntarios sanos sigue las pautas del Comité de ética de Investigación Hospital Los Ángeles humanos de los niños y ha sido aprobada por la Junta de revisión institucional en el Material humano Número de protocolo: CCI 08-00208.
1. preparación de líneas celulares de cáncer con tetraciclina regulado shRNA expresión
- Clonación del shRNA PAI-1 en Tet-pLKO-puro vector 8 , 9
- Diseño de oligómeros de shRNAs que contienen edadI y EcoRI escote sitio en el extremo 5', la secu....
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Resultados
Tres secuencias de shRNAs fueron probadas para el KD más eficiente de PAI-1. Para ello, secuencias shRNA contra PAI-1 y revueltos (tabla 1) se clonaron en vectores de expresión Tet-pLKO-puro siguiendo el protocolo descrito anteriormente. La línea de células de fibrosarcoma HT 1080 fue estable transfected con constructos generados y las células fueron tratadas con doxiciclina durante 3 días. La expresión de PAI-1 se verificó por Western Blot ()
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Discusión
Compuesto por una variedad de tipos celulares, la TME es crucial para el desarrollo del cáncer. Para determinar las condiciones de crecimiento óptimo, las células cancerosas atraen monocitos a través de la secreción de factores quimiotácticos. Aquí presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo de reclutamiento de monocitos por células tumorales en vitro. Para ello, se utiliza una combinación de sistema de expresión inducible gene, purificación de monocitos humanos primarios y como un ejemplo de un análisis.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer Jacqueline Rosenberg para corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los nosotros Departamento de salud y servicios humanos/nacional institutos de salud con una subvención YA DeClerck (concesión 5R01 CA 129377) y la TJ Martell Foundation. MH Kubala es el receptor de un premio de beca de desarrollo de carrera de investigación del Instituto de investigación de Saban en el Hospital Los Angeles de los niños.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vector lentiviral Tet-pLKO-puro | Addgene | 21915 | |
| FBS (sin tetraciclina) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Kit de enriquecimiento de monocitos humanos | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cortar Tampón inteligente | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Sistema de limpieza de gel y PCR | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Químicamente competente E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 juego de tinción para el protocolo de tinción de Wright-Giemsa | 123-869 | ||
| células HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Enzima de restricción XhoI | NEB | R0146S | |
| Ligasa | NEB | M0202S | |
| Tampón de ligasa | NEB | M0202S | |
| EDTA 0,5 M solución | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Solución de Poly-L-Lisina | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Acetato de sodio | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Butirato de sodio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μ Filtros de jeringa | M VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hidroximetil)aminometano (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| ditioeritritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| etanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| triptona | Amresco | J859-500g | |
| extracto de levadura | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicilina | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanoácido sulfónico (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromicina | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Hicalato de doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Soporte permeable para placa de 24 pocillos con 8.0μ m Membrana de PET transparente | Becton Dickinson | 353097 | |
| Albúmina de suero bovino | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Aplicador con punta de algodón | Medline | MDS202000 | |
| Protocolo Hema 3 Paquete STAT | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Aceite de inmersión, alta viscosidad | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicilina Estreptomicina | Gibco | 15140122 |
Referencias
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A.....
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Reimpresiones y permisos
