Cuantificación de microorganismos a bajas concentraciones usando microscopia holográfica Digital (DHM)

Summary

La microscopia holográfica digital (DHM) es una técnica volumétrica que permite muestras de 50-100 X más gruesa que la microscopía brightfield en resolución comparable, con enfoque realizado post-processing. Aquí DHM se utiliza para identificar, contar y microorganismos en muy bajas densidades y en comparación con las mediciones de densidad óptica, gérmenes y conteo directo.

Abstract

Detecta y cuenta escasas muestras bacterianas tiene muchas aplicaciones en los alimentos, bebidas y la industria farmacéutica, diagnóstico médico y para la detección de vida por las misiones robóticas a otros planetas y lunas del sistema solar. En la actualidad, se cuentan escasas muestras bacterianas por microscopia de la galjanoplastia o epifluorescencia de cultura. Placas requieren largos tiempos de incubación (días a semanas) y microscopía de epifluorescencia requiere extensa de tinción y concentración de la muestra. Aquí, demostramos cómo se utiliza la microscopia holográfica digital fuera del eje (DHM) para enumerar bacterias en cultivos muy diluidas (100-10⁴ células/mL). En primer lugar, se discute la construcción de la DHM personalizado, junto con instrucciones detalladas sobre la construcción de un instrumento de bajo costo. Se discuten los principios de la holografía, y se utiliza un modelo estadístico para estimar cuánto deberían videos para detectar células, basadas en las características de rendimiento óptico del instrumento y la concentración de la solución bacteriana (tabla 2) . Video detección de células a 10⁵, 10⁴10³y 100 células/mL se demuestra en tiempo real utilizando hologramas no reconstruidos. Reconstrucción de imágenes de amplitud y fase se demuestra utilizando un paquete de software de código abierto.

Introduction

Determinación de la exacta conteos bacterianos en muestras muy diluidas es crucial en muchas aplicaciones: algunos ejemplos son alimentos y agua calidad análisis^1,2,3; detección de patógenos en sangre, líquido cefalorraquídeo o esputo^4,5; producción de productos farmacéuticos, incluyendo agua estéril⁶; y análisis de la comunidad ambiental en ambientes oligotróficos como en el abierto océano y los sedimentos^7,8,

Protocol

1. crecimiento y enumeración de bacterias

Nota: esto es aplicable a casi cualquier cepa bacteriana en el medio adecuado ³⁶. En nuestro ejemplo, utilizamos tres cepas: Serratia marcescens como una cepa de laboratorio común, fácil identificación; y una cepa ambiental más pequeña, altamente móvil, Shewanella oneidensis MR-1. Para comparar la detección de móviles frente a las células no-motile, un no-motile Shewanella mutante, Δ FlgM, también se utiliza para comparación ³⁷. Todas las cepas se cultivan en caldo de lisogenia (LB).

1. Prepare medio estéril de LB ....

Results

Los resultados deben indicar la capacidad para detectar las bacterias vivas y muertas en niveles muy bajos de DHM. El número de bacterias contadas debe ser coherente con los resultados obtenidos utilizando las cuentas Petroff-Hauser cuentas cámara y placa. Estándar métodos estadísticos proporcionan información sobre la exactitud de los métodos de detección distintos a diferentes concentraciones bacterianas.

.......

Discussion

Reconstrucción numérica de hologramas: la reconstrucción numérica de hologramas, se utiliza el método de espectro angular (ASM). Se trata de la circunvolución del holograma con la función de Green para el DHM. El frente de onda compleja de la imagen en un determinado plano focal se puede calcular empleando el teorema de la circunvolución de Fourier como sigue:

(1)

Donde

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Levadura	BD Biosciences	212750
Bacto Triptona	BD Biosciences	211705
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	7710	Muchas opciones de compra
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
Placas de Petri de 10 cm	VWR	10053-704
Tubos de cultivo de 15 mL Falcon	( Corning Life Sciences)	352002	Cámara
Petroff-Hauser	Microscopía electrónica Sciences	3920
jeringas de 10 mL	BD Biosciences	309604	No es necesaria la punta Luer-Lok
Luer macho a 1/16" Racor de púas	McMaster-Carr	51525K291
Esterilizable en autoclave 1/16" ID Tubo de PVC para flujo	Nalgene	8000-0004	Se vende por longitud, compre en consecuencia
Bomba de jeringa	Harvard Apparatus PHD	2000
Sample Chamber	Custom	n/a	Ver Sección de Materiales
Microscopio holográfico	Custom	n/a	See Wallace et al.
Software de código abierto	Custom	https://github.com/bmorris3/shampoo