Este artículo describe un protocolo para el aislamiento axénico a gran escala y la colección de miracidia nadan de la humana platija de la sangre mansoni de Schistosoma y su posterior procesado para la introducción en cultivo en vitro .
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Artículo de método
Total aislamiento y cultivo In Vitro de Intramolluscan etapas de la humano platija de la sangre Schistosoma Mansoni
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Resumen
Resumen
Humanas sangre trematodos, Schistosoma spp., tienen un ciclo de vida complejo que comprende las fases del desarrollo asexuales y sexuales dentro de un caracol intermedio y mamífero huésped definitivo, respectivamente. La capacidad para aislar y sostener las etapas del ciclo de vida diferente bajo condiciones de cultivo en vitro ha facilitado enormemente las investigaciones de los mecanismos celulares, bioquímicos y moleculares de regulación de host, el desarrollo y crecimiento del parásito interacciones. Transmisión de la esquistosomiasis requiere reproducción asexual y el desarrollo de múltiples etapas larvales en el host de caracol; desde el miracidium contagiosa, a través de esporocisto primaria y secundaria, a la etapa final de cercarial que es contagioso a los seres humanos. En este trabajo presentamos un protocolo paso a paso para la eclosión total y aislamiento del mansoni del schistosoma miracidia de huevos obtenidos de hígados de ratones infectados y su posterior introducción en cultivo en vitro . Se prevé que el protocolo detallado anime a nuevos investigadores y ampliar este importante campo de investigación de esquistosoma.
Introducción
El ser humano sangre platijas Schistosoma spp., son los agentes causativos de la esquistosomiasis, una enfermedad tropical desatendida que afecta a un estimado de 230 millones de personas en todo el mundo1. La especie más difundida, Schistosoma mansoni, se distribuye geográficamente en América del sur, el archipiélago Caribe, Oriente Medio y África subsahariana2. El ciclo de vida de S. mansoniy otros esquistosomas, es complejo, que implica un mamífero hospedador definitivo y los caracoles de agua dulce del género Biomphalaria que sirven como hospederos intermediarios obligados.
S. mansoni macho y hembra adulto del gusano pares viven en las venas mesentéricas posteriores de la reproducción del huésped mamífero, lo que resulta en la liberación de huevos embrionados (ova) que se metieran en las pequeñas vénulas de la mucosa intestinal. Huevos se rompe a través de las paredes del recipiente, migran a través de tejido mucoso y finalmente entrar en la luz intestinal donde son anuladas con las heces. Cuando óvulos entran las larvas nadan libremente y de agua dulce (miracidia) Portilla, deben, en poco tiempo, encontrar un caracol Biomphalaria adecuado para infectar a fin de continuar su ciclo de vida. Este proceso de infección consiste en miracidial accesorio a la superficie de cuerpo exterior de caracol seguida por la penetración activo y la entrada de la larva en el host. Pronto después de la entrada, el miracidium comienza a arrojar sus placas epidérmicas ciliadas externas como forma un sincitio se convertirá en la nueva superficie exterior (tegumento) de la siguiente etapa larval, el sporocyst primario o madre. A través de reproducción asexual, cada sporocyst primario produce y libera una segunda generación de esporoquistes, denominados secundarios o esporoquistes de hija, que a su vez, generaran y liberan grandes cantidades de la fase final de la intramolluscan, la cercaria3 . A escapar de la sede de caracol, cercariae nado libre es capaces de conectar a y penetrar directamente en la piel de un humano o de otro huésped mamífero adecuado. Al entrar en su nuevo host, cercariae transforma a la etapa de parásito esquistosómula y invade el sistema vascular. A su vez, migran a los pulmones y luego a la vena hepática donde maduran a gusanos adultos, forman pares masculinos y femeninos y viajar a las venas mesentéricas para completar su ciclo de vida.
Exitoso intramolluscan o el desarrollo de la "fase Caracol" de esquistosomas larvales es esencial para la continuación del ciclo de transmisión humana de host a host. De importancia crítica es la entrada siguiente períoda del miracidium nadan libremente en el host de caracol y su transformación temprana a la etapa del sporocyst primario. Dependiendo de la compatibilidad fisiológica e inmunológica entre huésped y parásito, es durante esta fase de desarrollo larval inicial éxito o el fracaso para establecer infecciones es determinado4,5,6 . Desarrollo posterior de esporocisto primaria capaz de producir asexualmente esporoquistes secundarios, que luego generan cercariae infeccioso en humanos, además requieren un entorno de host fisiológica permisiva que ofrece para todos los del crecimiento del parásito y necesidades de reproducción.
Hasta la fecha, poco se sabe sobre el subyacente fisiológico, bioquímico y moleculares procesos controlar las interacciones de schistosome caracol, especialmente las moléculas y vías implicados en regulación de la reproducción y desarrollo larval, o modulación de respuestas inmunitarias del huésped. Acceso a un gran número de estos estadios larvarios en condiciones en vitro cultura que permiten manipulación experimental facilitaría enormemente el descubrimiento de vías de desarrollo y los mecanismos subyacentes del crecimiento celular, diferenciación y la reproducción. Crítico parásito vías o mecanismos, identificados a través de la experimentación en vitro , podrían utilizarse para interrumpir el crecimiento/reproducción larvaria en el host de caracol, o caracol huésped inmune mecanismos implicados en el reconocimiento y eliminación de miracidial o sporocyst etapas.
En este artículo y el vídeo de presentación, ofrecemos una descripción detallada de un método para aislar gran cantidad de nado libre S. mansoni miracidia para la introducción en cultivo en vitro que luego puede ser sometida a seguimiento experimental manipulación (ver figura 1 para una descripción esquemática del flujo de trabajo de protocolo). Aunque se han descrito procedimientos similares previamente7,8,9, sentimos que un protocolo detallado sería útil a los investigadores que deseen emplear este modelo para abordar preguntas todavía sin respuesta relacionadas con intramolluscan desarrollo larvario, proliferación celular e interacciones inmunes schistosome caracol. Además, este enfoque se podría adaptar fácilmente para el aislamiento de huevos de otros trematodos médicamente importantes tales como vejiga-vivienda S. hematobium, hígado trematodos o tremátodos del pulmón.
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales y cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité de uso de la Universidad de Wisconsin-Madison bajo protocolo y atención institucional del Animal no. V005717. El siguiente protocolo consiste en trabajar en un centro de bioseguridad nivel 2 (BSL2) para patógenos humanos, aunque ninguna de las etapas de esquistosoma, representadas en este protocolo son infecciosas para los seres humanos o de otros mamíferos. Seguir las políticas institucionales para el manejo de grupo de riesgo 2 (RG2) patógenos humanos.
Nota: Utilizamos mujer ratones Swiss-Webster (6 - semanas de edad) debido a su mayor susceptibilidad a la infección10, produciendo así mayores cargas de huevo. Tucker et al. , describen los protocolos de infección del ratón y caracol utilizados en este modelo de sistema11. La Tabla de materiales enumera todos los equipos específicos, materiales, reactivos y fuentes animales para llevar a cabo este protocolo experimental.
1. proceso de hígados infectados
- Eutanasia a ratones, post-infección 6-7 semanas, por asfixia de CO2 (tasa de 10-30% del volumen de la cámara por minuto). Ratones de monitor para el cese de la respiración y del latido del corazón.
Nota: Por lo general, a 20 ratones pueden procesarse en un momento dado. - Después de la transferencia sacrificaron ratones a un gabinete de bioseguridad, poner ratones en sus espaldas y rocíe las superficies ventrales con etanol al 70%. Remojar durante 1 minuto.
- Apriete y tire hacia arriba la piel del abdomen inferior y en toda la base de la piel que mantiene pellizcada más cercana al abdomen con tijeras quirúrgicas estériles. Tire la piel corte anterior (es decir, hacia la cabeza) para revelar el hígado. Tenga en cuenta que el hígado agrandado y manchado debido a una respuesta granulomatosa inducida por huevo (figura 2A).
- Retirar el hígado y colocarlo en un vaso que contiene 200 mL de estéril solución de NaCl del 1,2% que contiene pluma/strep.
- Repita los pasos 1.3 y 1.4 con los ratones restantes.
Nota: Veinte ratones generalmente se procesan en una sola cosecha. - Coloque los hígados en una placa Petri estéril y retirar tejidos de hígado sin grasa/conectivos con pinzas estériles.
- Transferencia ajustado/limpiar hígado a una botella de centrífuga estériles de 250 mL que contiene ~ 200 mL de solución estéril de NaCl de 1.2% con pluma/strep.
- Enérgicamente sacudir la botella que contiene el hígado y, con una pipeta desechable estéril, retire la superficie excesiva espuma/flotación ruina. Poco a poco retirar la solución salina restante en un recipiente o fregadero que contiene 1% cloro (desinfectante).
- Añadir ~ 200 mL de solución salina fresca a los hígados y repita el paso 1.8 tres veces más.
2. hígado extracción y miracidial aislamiento
- Coloque los hígados en una taza pequeña batidora de acero inoxidable estéril y añadir 2 mL de solución de NaCl al 1.2% (figura 2B).
- Cubra la taza con papel de aluminio y una placa de Petri para evitar derrames y mezclar durante 1 minuto alternando baja y alta velocidad (20 s baja velocidad/10 s velocidad; repetición) (figura 2).
- Distribuir la suspensión de hígado mezclada en botellas de centrífuga estériles de 250 mL (para 20 hígados usan 4 botellas).
- Añadir solución salina estéril con antibióticos a ~ 200 mL botella de volumen total. Pesa/balanza botellas antes de centrifugar.
- Centrifugar el hígado mezclado a 290 x g durante 15 min a 4 oC. suavemente retirar el sobrenadante en un recipiente con lejía antes de desecharlos.
- Repita los pasos del 2.4-2.5 una vez. Asegúrese de resuspender completamente el hígado sedimento antes de centrifugar.
- Después de descartar la última solución salina lavar (paso 2.6), agregue 200 mL de agua estéril estanque con pluma/estreptococos al tejido hepático alimentos Peletizado, agitar para Resuspender el sedimento y transferir la suspensión a un matraz aforado estéril de 1 L que ha sido completamente cubierto con aluminio papel de aluminio, excepto en la parte superior 3 cm del cuello (Figura 2D).
Nota: Use dos botellas (= 10 hígados) cada frasco de 1 L. Agua de estanque simula el entorno natural de agua dulce necesario para estimular miracidial eclosión de los huevos. - Usar agua estéril, llenar el frasco a unos 3 cm por encima de la lámina que cubre el cuello. Entonces, sin demora (como miracidia pronto comienzan a eclosionar), quitar la espuma residual y tejido hepático flotando a la superficie mediante pipeteo rápidamente hasta ~ 12 mL de agua del estanque que contenía desechos y descartarlo en un separado deseche el tubo. Vuelva a colocar con agua estéril fresca.
- Repetir limpieza paso 2.8, tres veces, comprobando la presencia de miracidia en el tubo de descarte. Dejar de repetición de la limpieza paso si miracidia aparece en la solución de lavado.
- Después del último lavado, agregue lentamente ~ 12 mL de agua tibia charca estéril (previamente calentado a 30 oC) para crear un gradiente de temperatura con agua caliente limpia y estéril en la parte superior.
Nota: Esto se logra mejor descargando lentamente a lo largo de la parte del cuello del frasco para evitar la mezcla. - Coloque una cubierta de caja de Petri pequeña sobre la apertura del frasco y brillar una luz brillante en la parte superior del matraz por encima de la cubierta de aluminio para iluminar la superficie superior del agua.
Nota: Normalmente, dentro de 5-10 minutos, nadando miracidia, atraído por la luz, se concentrará en gran número dentro de los primeros 2-3 cm de agua de los estanques (Figura 3A).
3. Miracidial cosecha y cultivo
- Cuando miracidia han acumulado en la superficie después de 10 min, utilizando una pipeta de transferencia estéril, retire ~ 8 mL de agua del estanque y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Coloque el tubo que contienen miracidia en hielo.
- Añadir back 8 mL de agua estéril tibia por el interior del matraz volumétrico y esperar otros 10 minutos.
- Utilizando tubos de nuevo cada vez, repita los pasos 3.1 y 3.2 tres veces más. Después de la colecciónth 4, mantenga el tubo final en hielo durante 10 minutos permitir que el miracidia resolver. Este conjunto de tubos consta de la primera cosecha.
- Tubos de centrífuga que contienen miracidia 290 x g durante 1 min a 4 oC en una centrífuga refrigerada previamente enfriada.
- Retire inmediatamente la mayor parte del sobrenadante (~ 7 mL) teniendo cuidado de no perturbar el sedimento del parásito (figura 3B).
- Piscina todas la miracidia de esta primera cosecha en un tubo, luego lavar todos los tubos originales con agua estéril ~ 1 mL y añada al tubo "agrupado".
- Permite parásitos a reposar en hielo ~ 5 min y otra vez centrifugar los parásitos a 290 x g durante 1 min a 4 oC.
- Cuidadosamente Quite el sobrenadante y añadir que 6-8 mL estéril Chernin equilibrada solución de sal (CBSS +; véase tabla de materiales) que contienen pluma/strep.
- Suspender suavemente las miracidia y alícuota en una placa de cultivo de 24 pozos (1 mL por pozo), seguido por enjuague el tubo en 6-8 mL CBSS + y añadir 1 mL de enjuague a cada pocillo. Incubar los parásitos a 26 oC normoxic condiciones. Concentraciones de miracidia aislado varían, pero generalmente promediarán ~ 7000/mL.
- Si los parásitos se concentran aún en la fuente de luz, repita los pasos 3.1 a 3.9 a continuar cosechando tarde eclosión miracidia pero aumentar el intervalo de tiempo entre colecciones de 15-20 minutos.
Nota: Este nuevo conjunto de tubos representa la segunda cosecha. Sin embargo, porque miracidial números por lo general son bajos, las larvas de todos los tubos generalmente son agrupadas en una sola cultura, bien que contiene 2 mL CBSS +. - En cultivo y poscosecha de 24 h, resuspender suavemente esporoquistes en sus pozos por pipeteo.
- Espere unos minutos para permitir que los parásitos resolver en el fondo de los pozos. Una vez que han colocado, retire con cuidado el sobrenadante (~1.5 mL), que contendrá la mayoría de las placas epidérmicas ciliadas derramada por miracidia durante transformación larvaria. Esta "transformación" sobrenadante puede desechar o incorporada a estudios de seguimiento de productos de secreción de larvas.
- Añadir 1,5 mL de CBSS fresco + a cada bien y suavemente la pipeta para resuspender esporoquistes. Repita el paso 3.12 si se desea más lavar o cambiar a un medio diferente.
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Resultados
La gran mayoría de miracidia normalmente habrán sido recogida en las dos primeras "cosechas". Incubación de miracidia aislado en CEMB + desencadena el proceso de transformación de miracidio-sporocyst (Figura 4A- C). En la primera hora siguiente traslado a cultura pozos que contienen CBSS +, la mayoría de miracidia deje nadar (Figura 4A). A las 6 h en cultura, miracidia estamos activamente vertimiento sus placas e...
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Discusión
Miracidia de S. mansoni, aislados y manipulados como se describe en este documento, puede infectar solamente el anfitrión intermedio del caracol y por lo tanto no representan un riesgo biológico humano durante esta fase de desarrollo larvario. Sin embargo, para evitar la exposición accidental, infección de los caracoles, debe tenerse cuidado para realizar aislamientos miracidial en una ubicación diferente de áreas donde especies de caracoles Biomphalaria susceptibles pueden ser presente o mantenido. Un ...
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Divulgaciones
Autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Financiado en parte por subvenciones de NIH RO1AI015503. Ratones infectados de schistosome fueron proporcionados por del NIAID esquistosomiasis Resource Center en el Instituto de investigaciones biomédicas (Rockville, MD) a través de NIH NIAID contrato HHSN272201000005I para la distribución a través de recursos del BEI.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Chernina (CBSS+) | Para 1 litro de solución | ||
| 2,8 g de cloruro de sodio | Fisher Scientific | S271-3 | Disuelva las sales, excepto el cloruro de calcio, y |
| 0,15 g de cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P5405 | azúcares en 800 mL ddH2O |
| 0,07 g de fosfato de sodio, dibásico anhidro | Fisher Scientific | S374-500 | Disolver el cloruro de calcio por separado en 200 |
| 0,45 g de sulfato de magnesio heptahidratado | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0,53 g cloruro de calcio dihidratado; | Mallinckrodt | 4160 | Agregue lentamente el soln de calcio al soln de sal/azúcar con |
| 0,05 g de bicarbonato de sodio | Fisher Scientific | S233-3 | con mezcla constante |
| 1 g de glucosa | MP Biomedicals | 152527 | Ajuste a pH 7.2 y filtre la esterilización con a |
| 1 g de trehalosa | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µ m Filtro desechable con tapa de botella 10 |
| mL 100X penicilina/estreptomicina | Hyclone | SV30010 | Agregue penicilina filtrada y estreptomicina soln uso previo |
| Incompleto Bge medio (Ibge) | Para solución de 900 mL | ||
| 220 mL Schneider' s Drosophila medio modificado | Lonza | 04-351Q | Mezcle el medio de Schneider con 680 mL ddH2O |
| 4,5 g de hidrolizado enzimático de lactoalbúmina | Sigma-Aldrich | L9010 | Agregue hidrolizado de lactoalbúmina y galactosa |
| 1,3 g de galactosa | Sigma-Aldrich | G0625 | Ajuste a pH 7.2 y filtre la esterilización usando un 0.22 µ m Filtro de tapa de biberón desechable preesterilizado |
| Medio Bge completo (cBge) | Para 100 mL de solución | ||
| 90 mL Medio Bge | Para inactivar el calor FBS: Incubar FBS descongelado en | ||
| Suero fetal bovino (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | baño de agua a 60° C durante 1 hora mientras suavemente |
| 1 mL 100X penicilina/estreptomicina | Hyclone | SV30010 | girando el frasco cada 10 min FBS alícuota inactivado por calor en tubos de 15 mL y almacenar a -20&nb;C. Mezcle medio + FBS y filtro esterilizar con un filtro de 0.22 µ m pre-esterilizado Filtro de tapa de botella desechable Agregue penicilina y estreptomicina antes de usar |
| Agua de estanque (solución madre) | 1 L de solución madre | ||
| 12,5 g de carbonato de calcio | Fisher Scientific | C64-500 | Mezcle todas las sales en 1 litro de ddH2O |
| 1,25 g de carbonato de magnesio | Fisher Scientific | M27-500 | Tenga en cuenta que las sales no tendrán completamente |
| 1,25 g cloruro de sodio | Fisher Scientific | S271-3 | disuelto. Agitar vigorosamente para suspender |
| 0,25 g cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P5405 | sales antes de hacer el soln |
| Agua del estanque (solución de trabajo) | 1,5 L de solución | ||
| 0,8 mL de agua de estanque con solución madre (agitar antes del uso) en | Mezcle el caldo con ddH2O | ||
| 1500 mL de ddH2O | Esterilice el agua del estanque mediante autoclave (lento | ||
| 1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X | Hyclone | SV30010 | Agregue penicilina y estreptomicina antes de su uso |
| (1.2% NaCl) | 1.5L de solución | ||
| 18 g de cloruro de sodio en 1500 mL de ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Solución salina para autoclave para esterilizar |
| 1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X | Hyclone | SV30010 | Agregue penicilina y estreptomicina antes de su uso |
| Equipo y material adicional: | |||
| 7-L cámara | Siguiendo el protocolo aprobado por la IACUC n.º V001551 | ||
| Ratones | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, hembra, 6 semanas de edad, murino | |
| Tanque <>2 y regulador | libre de patógenos | ||
| placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | TPP | 92424 | |
| Matraces | |||
| Fuente de luz (150W) | Chiu Tech Corp | Modelo F0-150 | |
| Centrífuga, refrigerada, cubo oscilante | Centrífuga Eppendorf | Modelo 5810R | |
| frascos (250 mL) | Nalgene | ||
| de 15 mL, estériles | Corning | 430053 | |
| Pipetas de transferencia desechables estériles | Fisher Scientific 1371120 | ||
| 0.22 y micro; m Filtro de tapa de botella desechable preesterilizado | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Batidora de acero inoxidable | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Vaso batidora, capacidad de 100 mL | Waring Commercial | ||
| Microscopio compuesto invertido | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
Referencias
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