Total aislamiento y cultivo In Vitro de Intramolluscan etapas de la humano platija de la sangre Schistosoma Mansoni

Resumen

Este artículo describe un protocolo para el aislamiento axénico a gran escala y la colección de miracidia nadan de la humana platija de la sangre mansoni de Schistosoma y su posterior procesado para la introducción en cultivo en vitro .

Resumen

Humanas sangre trematodos, Schistosoma spp., tienen un ciclo de vida complejo que comprende las fases del desarrollo asexuales y sexuales dentro de un caracol intermedio y mamífero huésped definitivo, respectivamente. La capacidad para aislar y sostener las etapas del ciclo de vida diferente bajo condiciones de cultivo en vitro ha facilitado enormemente las investigaciones de los mecanismos celulares, bioquímicos y moleculares de regulación de host, el desarrollo y crecimiento del parásito interacciones. Transmisión de la esquistosomiasis requiere reproducción asexual y el desarrollo de múltiples etapas larvales en el host de caracol; desde el miracidium contagiosa, a través de esporocisto primaria y secundaria, a la etapa final de cercarial que es contagioso a los seres humanos. En este trabajo presentamos un protocolo paso a paso para la eclosión total y aislamiento del mansoni del schistosoma miracidia de huevos obtenidos de hígados de ratones infectados y su posterior introducción en cultivo en vitro . Se prevé que el protocolo detallado anime a nuevos investigadores y ampliar este importante campo de investigación de esquistosoma.

Introducción

El ser humano sangre platijas Schistosoma spp., son los agentes causativos de la esquistosomiasis, una enfermedad tropical desatendida que afecta a un estimado de 230 millones de personas en todo el mundo¹. La especie más difundida, Schistosoma mansoni, se distribuye geográficamente en América del sur, el archipiélago Caribe, Oriente Medio y África subsahariana². El ciclo de vida de S. mansoniy otros esquistosomas, es complejo, que implica un mamífero hospedador definitivo y los caracoles de agua dulce del género Biomphalaria que sirven como hospederos intermediarios obligados.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité de uso de la Universidad de Wisconsin-Madison bajo protocolo y atención institucional del Animal no. V005717. El siguiente protocolo consiste en trabajar en un centro de bioseguridad nivel 2 (BSL2) para patógenos humanos, aunque ninguna de las etapas de esquistosoma, representadas en este protocolo son infecciosas para los seres humanos o de otros mamíferos. Seguir las políticas institucionales para el manejo de grupo de riesgo 2 (RG2) patógenos humanos.

Nota: Utilizamos mujer ratones Swiss-Webster (6 - semanas de edad) debido a su mayor suscept....

Resultados

La gran mayoría de miracidia normalmente habrán sido recogida en las dos primeras "cosechas". Incubación de miracidia aislado en CEMB + desencadena el proceso de transformación de miracidio-sporocyst (Figura 4A- C). En la primera hora siguiente traslado a cultura pozos que contienen CBSS +, la mayoría de miracidia deje nadar (Figura 4A). A las 6 h en cultura, miracidia estamos activamente vertimiento sus placas e.......

Discusión

Miracidia de S. mansoni, aislados y manipulados como se describe en este documento, puede infectar solamente el anfitrión intermedio del caracol y por lo tanto no representan un riesgo biológico humano durante esta fase de desarrollo larvario. Sin embargo, para evitar la exposición accidental, infección de los caracoles, debe tenerse cuidado para realizar aislamientos miracidial en una ubicación diferente de áreas donde especies de caracoles Biomphalaria susceptibles pueden ser presente o mantenido. Un .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Chernina (CBSS+)			Para 1 litro de solución
2,8 g de cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-3	Disuelva las sales, excepto el cloruro de calcio, y
0,15 g de cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P5405	azúcares en 800 mL ddH2O
0,07 g de fosfato de sodio, dibásico anhidro	Fisher Scientific	S374-500	Disolver el cloruro de calcio por separado en 200
0,45 g de sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma-Aldrich	M1880	mL ddH2O
0,53 g cloruro de calcio dihidratado;	Mallinckrodt	4160	Agregue lentamente el soln de calcio al soln de sal/azúcar con
0,05 g de bicarbonato de sodio	Fisher Scientific	S233-3	con mezcla constante
1 g de glucosa	MP Biomedicals	152527	Ajuste a pH 7.2 y filtre la esterilización con a
1 g de trehalosa	Sigma-Aldrich	T0167	0.22 µ m Filtro desechable con tapa de botella 10
mL 100X penicilina/estreptomicina	Hyclone	SV30010	Agregue penicilina filtrada y estreptomicina soln  uso previo
Incompleto Bge  medio (Ibge)			Para solución de 900 mL
220 mL Schneider' s Drosophila medio modificado	Lonza	04-351Q	Mezcle el medio de Schneider con 680 mL ddH2O
4,5 g de hidrolizado enzimático de lactoalbúmina	Sigma-Aldrich	L9010	Agregue hidrolizado de lactoalbúmina y galactosa
1,3 g de galactosa	Sigma-Aldrich	G0625	Ajuste a pH 7.2 y filtre la esterilización usando un 0.22 µ m Filtro de tapa de biberón desechable preesterilizado
Medio Bge completo (cBge)			Para 100 mL de solución
90 mL Medio Bge			Para inactivar el calor FBS: Incubar FBS descongelado en
Suero fetal bovino (FBS) (Optima)	Atlanta Biologicals	S12450	baño de agua a 60° C durante 1 hora mientras suavemente
1 mL 100X penicilina/estreptomicina	Hyclone	SV30010	girando el frasco cada 10 min FBS alícuota inactivado por calor en tubos de 15 mL  y almacenar a -20&nb;C.  Mezcle medio + FBS y filtro esterilizar con un filtro de 0.22 µ m pre-esterilizado  Filtro de tapa de botella desechable  Agregue penicilina y estreptomicina antes de usar
Agua de estanque (solución madre)			1 L de solución madre
12,5 g de carbonato de calcio	Fisher Scientific	C64-500	Mezcle todas las sales en 1 litro de ddH2O
1,25 g de carbonato de magnesio	Fisher Scientific	M27-500	Tenga en cuenta que las sales no tendrán completamente
1,25 g  cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-3	disuelto. Agitar vigorosamente para suspender
0,25 g  cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P5405	sales antes de hacer el soln
Agua del estanque (solución de trabajo)			1,5 L de solución
0,8 mL de agua de estanque con solución madre (agitar antes del uso) en			Mezcle el caldo con ddH2O
1500 mL de ddH2O			Esterilice el agua del estanque mediante autoclave (lento
1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	Agregue penicilina y estreptomicina antes de su uso
(1.2% NaCl)			1.5L de solución
18 g de cloruro de sodio en 1500 mL de ddH2O	Fisher Scientific	S271-3	Solución salina para autoclave para esterilizar
1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	Agregue penicilina y estreptomicina antes de su uso
Equipo y material adicional:
7-L cámara			Siguiendo el protocolo aprobado por la IACUC n.º V001551
Ratones	Taconic Biosciences		Swiss-Webster, hembra, 6 semanas de edad, murino
Tanque <>2 y regulador			libre de patógenos
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos	TPP	92424
Matraces
Fuente de luz (150W)	Chiu Tech Corp	Modelo F0-150
Centrífuga, refrigerada, cubo oscilante	Centrífuga Eppendorf	Modelo 5810R
frascos (250 mL)	Nalgene
de 15 mL, estériles	Corning	430053
Pipetas de transferencia desechables estériles	Fisher Scientific 1371120
0.22 y micro; m Filtro de tapa de botella desechable preesterilizado	EMD Millipore	SCGPS05RE
Batidora de acero inoxidable	Waring Commercial	Model 51BL31
Vaso batidora, capacidad de 100 mL	Waring Commercial
Microscopio compuesto invertido	Nikon Instruments	Eclipse TE300

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