Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

En ratones y seres humanos, aproximadamente la mitad de todo corticales inhibitorios interneurons (CIns) originan dentro de una estructura subcortical transitoria conocida como la eminencia ganglionar medial (MGE), donde los progenitores neuroepiteliales de CIns y neuronal y glial los subgrupos expresan el factor de transcripción Nkx2.1^1,2. CIn los subgrupos o subtipos son definidos por la intersección electrofisiológicos, neuroquímicos y morfológicas y características de conectividad de^3,4. El CIns derivado de MGE se pueden agrupar en subgrupos no superpuestos sobre todo basan en su expresión de PV o SST, la expresión de que se correlaciona con particular electrofisiológicos y conectividad tendencias⁵. Disfunción de interneuronas, especialmente ésos en el subgrupo de PV, se ha implicado en múltiples neuropsiquiátricos desórdenes y enfermedades^6,7. El objetivo general de este método es producir derivados de células mitóticas progenitores y precursores migratorias enriquecidos por PV o SST CIn destino para estudiar biología cortical interneurona y para uso en terapias basadas en células.

Hemos desarrollado un método escalable, altamente eficiente para la derivación de expresa Nkx2.1 interneurona progenitores y su progenie de troncales. Utilizando un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP reportero doble mESC línea⁸, Nkx2.1 progenitores o su progenie poste-mitotic expresando Lhx6 puede ser aislado por FACS y posteriormente utilizado en un número de aplicaciones posteriores. Mediante la manipulación de un número de vías de señalización, duración de la cultura y modo de la neurogénesis, podemos obtener millones de precursores de interneurona fluorescente etiquetado adecuados para multitud de aplicaciones posteriores.

Aunque existen varios otros métodos para la generación de MGE-como progenitores de troncales^{9,10,11,12,13,14}, nuestro método, que depende de la Wnt antagonista XAV-939, es particularmente eficaz en generar Foxg1/Nkx2.1 Co expresando progenitores telencéfalo. Además, la capacidad para seleccionar progenitores interneurona o su progenie poste-mitotic Lhx6 expresando a través de nuestro sistema dual de reportero, realza grandemente la capacidad de generar distintos progenitores y su progenie.

Nota: La línea de mESC reportero dual descrita en el presente Protocolo está disponible a petición (sande@mail.med.upenn.edu).

1. preparación de medios de comunicación

Nota: Calentar todos los medios a 37 ° C antes de su uso en cultivo celular.

1. Medios de fibroblastos embrionarios del ratón (MEF) (para la preparación de 500 mL)
   1. Añadir el suero bovino fetal (FBS) de 50 mL a mL 449 de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), y filtro a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
   2. Añadir a agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C hasta 1 mes o alícuota y tienda a ≤-20 ° C.
2. Medios de N2 (para la preparación de 500 mL)
   1. Añadir 5 mL de L-alanina-L-glutamina (100 x) y 500 μl 2-Mercaptoetanol (55 mM) a 489,5 mL DMEM: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) y el filtro a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
   2. Añadir agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) y 5 mL N2 suplemento-B después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C en la oscuridad durante 1 mes.
3. Medio de cultivo libre de suero (KSR) (para la preparación de 500 mL)
   1. Añadir 75 mL suplemento medio libre de suero, L-glutamina de 5 mL (100 x), 5 mL MEM aminoácidos no esenciales (AANE-MEM) (100 x), y 500 μl 2-Mercaptoetanol (55 mM) a no-413,5 mL de glutamina que contienen DMEM y filtrar a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
   2. Añadir a agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C durante 1 mes.
4. Media de células madre embrionarias de ratón (para la preparación de 500 mL)
   1. Añadir 75 mL células madre grado FBS, 5 mL AANE MEM (100 x), 5 mL de L-glutamina (100 x), y 500 μl 2-Mercaptoetanol (55 mM) a no-413,5 mL de glutamina que contienen DMEM y filtrar a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
   2. Añadir a agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C en la oscuridad hasta 1 mes o alícuota y tienda a ≤-20 ° C.

2. cultivo de troncales

1. Placa de mitotically inactivas células de alimentador MEF en medios MEF sobre placas de cultivo de tejidos tratado en 3-4 x 10⁴ células/cm². Permiten por lo menos 12 h que instalarse en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO₂ antes de las troncales de la galjanoplastia. Si no se utiliza inmediatamente, vuelva a colocar la media de la MEF cada 3 días. Disponer de MEFs si no se utiliza dentro de los 7 días de la galjanoplastia.
2. Añadir troncales (densidad entre 1-4 x 10⁴ células/cm²) a las placas MEF en mESC medios que contienen Factor inhibidor de leucemia de ratón (mLIF) (1.000 U/mL). Incube las células a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO₂.
3. Troncales con tripsina-EDTA (0.05% tripsina) de paso (1:5-1:10) una vez que el plato se convierte en ~ 70-80% confluente o si las colonias empiezan a tocar. Esto normalmente ocurre cada 2 días, pero puede tomar hasta 4 o 5 días dependiendo de la densidad de placas iniciales.
4. Mantener las troncales en una capa de alimentador MEF en medio de la mESC mantener la pluripotencialidad.
5. Antes de comenzar la diferenciación, paso de las células al menos una vez en las placas de gelatina recubierto sin MEFs para diluir a las MEFs.
   1. Preparar las placas de gelatina cubierto mediante la adición de 0.1% gelatina en tampón fosfato salino (PBS) con Ca^{2 +}/Mg^{2 +} a un plato de cultivo de tejidos tratado y dejar a 37 ° C durante por lo menos 1 h. placa de 1.5-2 x 10⁶ células/10 cm la placa (2.7-3.6 x 10⁴ células/cm²) y permitir que las células para expandirse durante 2 días antes de comenzar la diferenciación.

3. diferenciando troncales a progenitores telencéfalo MGE-como

1. Día de diferenciación (DD) 0 = "células a flotar"
   1. Después de las troncales han crecido placas de gelatina recubierto por 2 días, aspirar los medios de comunicación y lavar las células una vez con PBS sin Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Añadir suficiente tripsina-EDTA (0.05% tripsina) para cubrir la superficie de la placa (normalmente 4 mL tripsina-EDTA para un plato de cultivo de tejidos de 10 cm) y coloque las celdas en la incubadora a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO₂ 4 min.
   2. Después de 4 minutos, apagar el tripsina-EDTA con 2 veces el volumen de medios mESC. Transferir las células a un tubo de tamaño adecuado de la centrífuga y centrifugar las células a 200 x g durante 5 minutos. Después de 5 minutos, retire el tubo y aspirar los medios de comunicación sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado en 1 mL KSR:N2 media (1:1) que contiene el inhibidor BMP 193189 LDN (250 nM) y los inhibidores de Wnt XAV-939 (10 μm).
   3. Medir la concentración de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Inicio crecimiento las células como organismos embryoid (EBs) agregando 75.000 células/mL en medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene LDN-193189 (250 nM) y XAV-939 (10 μm) en platos de cultivo de tejidos no adherente. Incube las células a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO₂.
2. En DD1, preparar para celular "aterrizaje" por capa platos de cultivo de tejidos tratado con poli-l-lisina (10 μg/mL en PBS con Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) durante la noche (O/N) a 37 ° C con una humedad relativa ≥ 95% o menos de 1 h.
3. En DD2, aspirar la poli-l-lisina y cubrir las placas con laminina (10 μg/mL en PBS con Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) O/N a 37 ° C con una humedad relativa ≥ 95%.
   Nota: O/N es óptima, tan poco como 2 horas puede ser suficiente. Si no se utilizan las placas al día siguiente, Aspire laminina, reemplazar con PBS sin Ca^{2 +}/Mg^{2 +}y almacenar a 4 ° C hasta por 2 semanas.
4. DD3 ("células de la tierra")
   1. Antes de comenzar la disociación de EB, aspirar la laminina y permita que las placas completamente seco en una campana de cultivo de tejidos. No usar placas que aparecen brillantes o visiblemente húmedo. Transferencia de la EBs con medios de comunicación en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 3-4 min a 15 x g o hasta que el EBs han peleteado.
5. Aspire los medios de comunicación y añadir 3 mL de solución de la separación de células que contienen DNasa (2 U/mL) e incube a 37 ° C con una humedad relativa ≥ 95% y 5% CO₂ para 15 minutos película suavemente el tubo cada 3 minutos para facilitar la disociación de EB.
6. Una vez que el EBs no son accesibles o han transcurrido 15 min, añadir 6 mL KSR:N2 (1:1) que contienen DNasa (1 U/mL) y centrifugar durante 5 min a 200 x g.
7. Placa las células de KSR:N2 (1:1) que contiene 193189 LDN (250 nM), XAV-939 (10 μm) y el inhibidor Y-27632 de la roca (10 μm) en 4.5-5 x 10⁴ células/cm².

4. enriquecimiento de SST protocolo: "DD12 GFP alta Sonic Hedgehog (SHH)" (continuación de paso 3.7)

1. En DD5, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) y SSH (50 ng/mL).
2. Preparar las placas de cultivo de tejidos para volver a platear el día 8 (paso 4.4) siguiendo las instrucciones que se indica en pasos 3.2-3.3.
3. El DD7, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) y SHH (50 ng/mL).
4. En DD8, volver a la placa de las células.
   Nota: Aunque este paso no es esencial, volver a las células de la galjanoplastia puede reducir tipos celulares diferenciados tempranos, no deseados. Volver a también rompe pelotas de células que dificultan el análisis de immunohistochemical aguas abajo y aumenta la eficacia de FACS en más puntos del tiempo.
   1. Para volver a las células de la placa, separar las células de la placa con tripsina-EDTA (tripsina 0,05%) durante 5 minutos a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO₂. Sacian el tripsina-EDTA con 2 veces el volumen de KSR:N2, y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos filtrar las células a través de un tubo de filtro de 40 μm para remover cualquier matas. Volver a la placa las células a 250.000 células/cm² en N2/KSR (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) y Y-27632 (10 μm) con SHH (50 ng/mL).
      Nota: Si por el contrario, tomó la decisión es no volver a la placa las células DD8, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 que contienen SHH (50 ng/mL) cada 2 días de DD7 a DD12 y continuar agregar IGF-1 (20 ng/mL) y FGF-2 (10 ng/mL) hasta DD9.
5. En DD10, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 que contienen SHH (50 ng/mL).
6. En DD12, para obtener las células que están enriquecidas para los subtipos de SST, use FACS para aislar Lhx6::GFP-expresando solamente las células.
   1. Para separar las células, utilizar un reactivo de disociación celular que contiene tripsina no en lugar de tripsina-EDTA. Lavar las células una vez con PBS sin Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Añadir precalentada no tripsina con disociación celular reactivo con DNasa (2 U/mL) a las células. Colocarlos en la incubadora a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO₂ para 10-30 min o hasta que las células se han separado. Golpee suavemente las placas cada 5 min para ayudar a la disociación.
      Nota: Para las culturas DD11-12, sólo 10-15 minutos puede ser necesario. Las culturas DD15-16, 30 min o más puede requerir para la completa disociación.
   2. Una vez que las células han levantado totalmente la placa, proceder al aislamiento de FACS usando protocolos estándar o utilizar las células de otros análisis posteriores.

5. enriquecimiento de PV protocolo: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (continuación de paso 3.7)

1. En DD5, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL).
2. Preparar las placas de cultivo de tejidos para volver a la galjanoplastia en DD8 (paso 4.4) siguiendo las indicaciones dadas en los pasos 3.2-3.3.
3. El DD7, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL).
4. En DD8, placa vuelve a las células como se describe en el paso 4.4 con las siguientes excepciones: cuando vuelva a las células de la galjanoplastia, reemplace SHH agonista pulida (SAG; 30 nM) y agregar inhibidor PKC atípica (aPKCi; 2 μm). Tomados en conjunto, los medios de comunicación re-galjanoplastia es ahora N2/KSR (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 μm), SAG (30 nM) y aPKCi (2 μm).
5. En DD10, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm).
6. DD11
   Nota: en este punto, las células Nkx2.1::mCherry+ se enriquecen para convertirse en PV CIns.
   1. Separar las células de la placa para FACS, usando el mismo protocolo descrito en el paso 4.6. Si la decisión se toma para recoger las células Nkx2.1::mCherry+ en un día posterior de diferenciación, omita este paso.
7. En DD12, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm). En DD14, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm). En DD16, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm). En DD17, recoger las células de Nkx2.1::mCherry+ utilizando el mismo protocolo descrito en el paso 4.6.

6. PV-enriquecimiento de protocolo: "DD17 mCherry baja SHH" (continuación de paso 3.7)

1. En DD5, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL). El DD7, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL).
2. En DD9, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1). Partir de este momento, no hay factores de crecimiento adicionales son necesarios.
   1. Seguir cambiar el medio cada 2 días hasta la cosecha de las células en DD17.

El protocolo descrito en este documento es una versión modificada de nuestros protocolos publicados15,16,17 y ha sido optimizado para su uso con nuestra línea de mESC dual-reportero de Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Mediante la adición de los inhibidores de Wnt XAV-939 de DD0-5, combinado con nuevo chapado en DD8, logramos robusta inducción Nkx2.1, en donde más del 50% de todos los núcleos DAPI + cultura también Nkx2.1 expresan (figura 1A, B). Immunohistochemistry para el mCherry y GFP reporteros muestra expresión clara dentro de las regiones del immunoreactivity positivo Nkx2.1 (figura 1A). FACS de células vivas usando el reportero nativo muestra cuatro poblaciones de células que pueden claramente aisladas: (1) GFP/mCherry células de negativa doble, (2) mCherry sólo expresión de las células, (3) GFP sólo células expresa y (4) GFP/mCherry células expresando doble ( Figura 1). Mediante esta línea, una pequeña fracción de los progenitores comienza a encender el reportero mCherry alrededor DD8-9. Los niveles de mCherry pico entre DD12-13 y luego declinación constantemente como progenitores salir del ciclo celular y producen poste-mitotic Lhx6::GFP + interneurona precursores (figura 1). Correspondientemente, el reportero de Lhx6::GFP se enciende entre DD9-10 y picos alrededor de DD13-14 (figura 1). Aunque el número total de células de Lhx6::GFP continúa aumentando en la cultura, el porcentaje no lo hace, probablemente debido a la proliferación de otros linajes. Una vez el Lhx6::GFP + expresa del reportero, sigue siendo detectable indefinidamente puesto que Lhx6 es estable expresado en interneuronas corticales derivados de MGE maduro18,19. Aunque en gran parte sin traslapo en el forebrain murino expresión Nkx2.1 y Lhx6, hay una población transitoria de Nkx2.1::mCherry y Lhx6::GFP Co expresando las células en cultivo. Esto es al menos en parte debido a la perdurance del reportero mCherry más allá del plazo normal de expresión Nkx2.1, como la mayoría de las células de doble etiquetado no expresa niveles detectables de proteínas Nkx2.1 (Tyson y Anderson, inédito). Las células continúan expresar el reportero Lhx6 y cereza/Nkx2.1 proteína pueden ser de interneuronas del estriado20. Sin embargo, basado en nuestros estudios de proyección de imagen vivo, hay una ventana de aproximadamente 18 h donde se puede aisladas sincrónicos, recién poste-mitotic precursores expresan Nkx2.1::mCherry y Lhx6::GFP (Tischfield Anderson, inédito y ver Tischfield et al. 17). así, por la recogida de Nkx2.1::mCherry y Lhx6::GFP las células positivas doble en cualquier punto durante el protocolo, es posible obtener una población de células que predominantemente han cerrado el ciclo celular en aproximadamente 18 h de cada uno. Esto está en contraste con Nkx2.1::mCherry y Lhx6::GFP-expresando solamente las células, que representan varios tipos de progenitores y precursores, respectivamente, de fechas de nacimiento diferentes.

La línea de la mESC dual-reportero de Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP puede utilizarse para enriquecer de interneuronas SST-fatal. En general, añadiendo SHH a las culturas y recogida de GFP + células en momentos anteriores en la diferenciación (p. ej., DD12) enriquece para los subtipos de SST. Basado en nuestras observaciones, no hemos visto una diferencia significativa en la relación SST:PV dependiendo si se agrega SHH en DD5 o DD8 (datos no mostrados). Mediante la adición de SHH (50 ng/mL) de DD8-12 y luego trasplantar las células expresa GFP sólo se obtiene en promedio una relación 7:1 de15,de SST:PV CIns (figura 2A)17. Para más detalles sobre los efectos de SHH y el tiempo en la cultura en destino interneurona usando nuestra línea dual-reportero mESC, ver Tyson et al. 15

Para enriquecer de CIns PV-predestinado, SHH debe omitirse de los medios de cultivo. De nota, consistente con el requisito de señalización mantener la expresión Nkx2.1 en progenitores mitotic21, SHH SHH señalización existe en estas culturas sin SHH exógeno se agrega desde el SHH señalización antagonista cyclopamine elimina NKX2.1 expresión15. Sin embargo, si las células son re-plateadas en DD8, esta SHH endógena está quitada, que SAG (30 nM) se debe agregar a los medios de comunicación de DD8-10 para mantener la expresión Nkx2.1 y la producción de CIns. Nuestro estudio anterior mostró por SHH la retención de las condiciones de cultivo y clasificación para las células Nkx2.1::mCherry+ en DD17, una relación ~2.6:1 de las células PV:SST se podría obtener (figura 2B)15. En contraste con SST subtipos, que se enriquecen en etapas más tempranas y en presencia de SHH exógeno, mayor duración en la cultura y falta de SHH exógeno enriquece para PV subtipos15. En un estudio más reciente, encontramos que aPKCi aplicada a nuestro protocolo "MGE" significativamente aumenta la fracción de Nkx2.1::mCherry progenitores que expresan ciclina D217, un marcador de células progenitoras intermedio22. Esta variación de protocolo se basó en nuestro encontrar que PV-expresión CIns proceden principalmente de progenitores intermedias, mientras que los progenitores de SST se originan principalmente de progenitores radiales en la superficie ventricular23. Hemos encontrado que cuando ordenan y trasplantado en neocortex neonatal ratón, estos progenitores grandemente están sesgados para la producción de PV-subtipos. Añadiendo aPKCi DD8-11 y luego clasificar las células de Nkx2.1::mCherry, hemos podido obtener una relación de 5.8:1 de PV:SST subtipos (figura 2)17. Para enriquecer más lejos para los subtipos de PV, también hemos aislado las células Nkx2.1::mCherry cultivadas en presencia de aPCKi DD8-17. Sin embargo, no logró un aumento en el cociente de la PV:SST más allá de lo que hemos podido obtener en DD11, a pesar de un aumento marginal en el porcentaje de subtipos de PV generado (Figura 2D). Diagramas de flujo para cada uno de estos protocolos se encuentran en la figura 3. 30 días después del trasplante los cerebros immunostaining de ratón anti-GFP (para mejorar la identificación de células Lhx6::GFP +), anti-PV y anti-SST con anticuerpos muestra que Lhx6::GFP + células exhiben características morfológicas maduritas con los patrones de la expresión PV y SST similar a en vivo homólogas (figura 4 y figura 5).

Para ayudar en la determinación de si una diferenciación CIn aparece exitoso, hemos preparado una serie de imágenes en cada etapa del protocolo para demostrar variabilidad normal (figura 6, figura 7, figura 8). Incluimos también una figura que demuestra cómo una fracasado diferenciación aparece en DD4 (figura 9). En general, diferenciaciones producirá niveles bajos (menos del 10%) de expresión Nkx2.1 y porcentajes de Nkx2.1::mCherry y Lhx6::GFP la inducción de aproximadamente el 1% o menos.

Figura 1: generación de precursores de interneurona Nkx2.1::mCherry y Lhx6::GFP. (A) se muestra aquí son imágenes representativas de inmunotinción para Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) y Lhx6::GFP (GFP) de diferenciación día 12 (DD12) cultura. Tenga en cuenta que estas imágenes se solapan los canales desde el mismo campo de vista. (B) cuantificación del porcentaje promedio de DAPI + núcleos que expresa Nkx2.1 en DD12 en cultura (n = 3 diferenciaciones independiente). (C) representante FACS parcela demostrando las cuatro diferentes poblaciones celulares que se puede aisladas usando nuestra línea de mESC reportero dual. Tenga en cuenta que mCherry es en el eje x y GFP es en el eje y. Así, el cuadro superior derecho representa células mCherry GFP-doble positivas. (D) curso del tiempo de inducción, Nkx2.1::mCherry y Lhx6::GFP DD6-16 expresado como el porcentaje de células en cultura sólo mCherry expresando, expresando GFP sólo, o mCherry/GFP Co expresando. Estos porcentajes se obtuvieron de las células cultivadas en presencia de SHH durante un protocolo enriquecen por el SST y representan promedios de 3 diferenciaciones independiente. Barras de error en (B) y (D) representan SEM. escala de la barra = 150 μm (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: manipulación de las condiciones de cultura enriquece diferencialmente para PV-versus SST-fatal mESC deriva interneuronas corticales. (A) porcentaje de PV + SST + y PV - SST-interneuronas obtiene cuando DD12, GFP sólo expresando las células cultivadas en presencia de SHH (50 ng/mL) de DD5-12 se trasplantan en neocortex neonatal y analizó el trasplante después de 30 días. (B) porcentaje de PV + SST + y PV - SST-interneuronas obtenido cuando sólo mCherry expresando células DD17, crecido sin SHH suplementario son transplantadas en neocortex neonatal y analizaron 30 días después del trasplante. (C) porcentaje de PV + SST + y PV - SST-interneuronas obtiene cuando DD11, mCherry sólo expresando las células cultivadas en presencia de SAG (30 nM; DD8-10) y aPKCi (2 μm; DD8-11) se trasplantan en neocortex neonatal y analizó el trasplante después de 30 días. (D) porcentaje de PV + SST + y PV - SST-interneuronas obtiene cuando DD17, mCherry sólo expresando las células cultivadas en presencia de SAG (30 nM) DD8-10 y aPKCi (2 μm) de DD8-17 se trasplantan en neocortex neonatal y analizaron 30 días posterior al trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: diagramas de flujo que ilustra los protocolos diferentes PV y SST-enriquecimiento descritos en este estudio. (A) para todos los protocolos, los escalones que conducen hasta el comienzo de la diferenciación entre DD0-5 son idénticos. Todas las células se cultivan como cuerpos embryoid de DD0-3 en N2:KSR (1:1) complementados con el inhibidor de BMP-LDN-193189 y los inhibidores de Wnt XAV-939. En DD3, las células son "aterrizó" en N2:KSR (1:1) que contiene LDN-193189, XAV-939 y el inhibidor Y-27632 de la roca. Enriquecer para los subtipos de SST, SHH se agrega de DD5-12. Por otra parte, SHH se agrega de DD8-12 ya que, en nuestra experiencia, la adición de SHH de DD5 versus DD8 adelante no afectar significativamente la proporción de PV:SST subtipos generados. Las versiones anteriores del Protocolo (ver Tyson et al. 15) no incorpora un paso re-galjanoplastia DD8 y suplido en su lugar los medios de comunicación con SHH exógena en DD5. Este protocolo fue alterado más adelante para incorporar un paso re-galjanoplastia DD8 junto con la introducción de SHH, ninguno de los cuales alterar significativamente la relación PV:SST. En este protocolo de "alto-SHH", Lhx6::GFP + las células cultivadas en presencia de SHH exógeno son FACS aislado en DD12 para su uso en aplicaciones posteriores. (B) para el "low-SHH" PV-protocolo, SHH exógeno, así como el paso re-galjanoplastia DD8 se omite. En cambio, las células Nkx2.1::mCherry+ son FACS aislado en DD17 para su uso en aplicaciones posteriores. (C) para el "+ aPKCi" Protocolo de PV, aPKCi se agrega junto con SAG de DD8-10 y sólo aPKCi se agrega desde DD10 adelante. En DD11 o DD17, las células Nkx2.1::mCherry son FACS aislada para su uso en aplicaciones posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: inmunotinción PV y SST en Lhx6::GFP + células 30 días después del trasplante en neocortex neonatal. (A) imagen de alta potencia de un SST expresar, Lhx6::GFP + 30 días post trasplante de la célula en neocortex neonatal. Dentro de cada columna de cuatro imágenes son imágenes de un canal de expresión Lhx6::GFP, PV y SST con una imagen combinada de 3 canales en la parte inferior. Como se muestra en el panel superior, esta Lhx6::GFP + neurona elabora procesos múltiples sugestivos de una morfología de madura. (B) imagen de alta potencia de dos PV-expresar, Lhx6::GFP + células 30 días después del trasplante. Imagen de alta potencia (C) de un SST / PV doble negativo, Lhx6::GFP + celular. Aunque esta célula elabora múltiples procesos consistentes con la completa diferenciación e integración cortical, este celular no claramente expresa PV o SST. Tenga en cuenta que hay un PV + núcleo adyacente a la celda Lhx6::GFP + pero que no solapen. Barras de escala = 50 μm (A-C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: media y baja potencia imágenes del PV, SST y Lhx6::GFP expresión de la proteína 30 días después del trasplante en neocortex neonatal. (A) imagen de potencia media de una región de la neocorteza de ratón que contiene 30 Lhx6::GFP + células 30 días después del trasplante. Estas células fueron cultivadas mediante el protocolo de PV (+ aPKCi DD8-11; FACS aislar y trasplante Nkx2.1::mCherry+ en DD11). De las 30 células vistas aquí, 16 express PV 4 express SST y 10 express PV ni SST. Imagen de baja potencia (B) de una región del neocortex de ratón que contiene numerosos, bien diferenciadas Lhx6::GFP + células 30 días después del trasplante. Tenga en cuenta la abundancia de Lhx6::GFP + procesos cursando a través de la corteza. También se encuentran las células ocasionales en el hipocampo, donde aparecen integrar y elaborar procesos consistentes con un fenotipo maduro. Barra de escala = 50 μm (A); 550 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: aspecto Normal de la capa de alimentador de fibroblastos embrionarios de ratón y células madre no diferenciadas. (A) se muestra aquí son 4 X y 10 X aumentos brightfield de imágenes mostrando el aspecto típico de nuestro alimentador de fibroblasto embrionario (MEF) ratón capas 24 h después de la galjanoplastia. (B) se muestra aquí está el aspecto típico del ratón embrionarias células madre (troncales) 2 días después de la galjanoplastia en alimentadores MEF. Tenga en cuenta que las colonias tienen un perímetro brillante y son elípticas u ovoides en apariencia. Si las colonias pierden este perímetro brillante o empiecen a enviar proyecciones hacia afuera, estas son señales que las células se pueden diferenciar. (C) se muestra aquí son los troncales 1 y 2 días después de volver a la galjanoplastia en platos de gelatina recubierto para diluir a alimentadores MEF antes de comenzar la diferenciación. Observe que las células madre ampliar considerablemente después de 48 h en gelatina y comienzan a adquirir un aspecto ovoide con un perímetro de brillante. Barra de escala = 100 μm en el 4 X y 10 X fotos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: aspecto de células madre embrionarias de ratón en los días de diferenciación 1 a 7. (A) un día después del flotante, el tallo se observan células formando pequeños embryoid cuerpos (EBs). Por segundo día la EBs han crecido considerablemente. Nota que algunos EBs pegadas y forman grandes racimos de células. No encontramos que esto afecta negativamente la diferenciación. Después de 3 días, el EBs han crecido más y algunos ya no transmiten luz a través de ellos. Es normal ver restos de células en el fondo. (B) se muestra aquí son las células madre 24 h después de la aterrizaje en día de diferenciación 4 (DD4). Tenga en cuenta la densidad de las células. Muchos han comenzado a ampliar pequeños procesos, que se sigue la diferenciación. Nota aquí que las células son de color incluso con pequeños puntos negro en. Si las células son homogéneos o brillante que aparece, es un signo de diferenciación aberrante. (C) por DD5, las células continúan proliferan y forman rosetas de nervios. Muchas células han extendido procesos largos y delgados. (D) por DD7, las células deben ser confluentes. Es normal ver un patrón de "Queso suizo", en donde las células grandes, multinucleadas y planas (posiblemente ependimarias o células gliales) crean islas circulares dentro de una capa de progenitores neuronales. De vez en cuando cuando la densidad celular es superior a la normal, este patrón de "Queso suizo" no no el desarrollo, como se muestra en la imagen central. Dependiendo de la diferenciación, esto puede afectar la inducción neural. 4 x y 10 x indican el aumento. Barra de escala = 100 μm en el 4 X y 10 X fotos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: aspecto de la diferenciación en los días de 9 a 14. (A) las células se pueden visualizar un día después de volver a la galjanoplastia. Tenga en cuenta su aspecto bipolar, que es típico de progenitores neuronales. La cultura es homogénea con algunos otros tipos de célula infiltrante. La densidad es apropiada para esta etapa. (B) por DD11, las células se han convertido en una monocapa. Similar a etapas anteriores en la diferenciación, grandes "huevo" multi-nucleated células pueden verse entremezclados a lo largo. (C) por DD13 que las células continúan proliferando. Ahora pueden verse formando pequeños montículos. Muchas células del "huevo-como" todavía están presentes en todo. Partir de este momento, la cultura mostrará sólo unos pocos cambios, a excepción de los montículos crece más y más. 4 X, 10Xx, y 20 X indica el aumento. Barra de escala = 100 μm en el 4 X y 10 fotos X y barra de escala = 50 μm en fotos X 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: aspecto de una diferenciación sin éxito el día 4. DD4 es importante para evaluar el éxito de una diferenciación porque sigue uno de los pasos más difíciles del Protocolo: el aterrizaje en DD3. Por DD4, las células tienen 24 horas para recuperarse después de ser disociado de embryoid cuerpos. Como puede verse aquí, la mayoría de las células son brillante y homogéneo que aparece. Intercalados a lo largo están las células ocasionales que aparecen normales, tener un aspecto más oscuro con pequeños puntos negro en. Además, grandes células planas (como pueden verse en el panel izquierdo inferior) son indicativas de diferenciación aberrante. En el panel derecho de la parte inferior, por lo menos tres grupos pequeños de células (flechas amarillas) aparecen como pequeños cuerpos embryoid, indicando diferenciación defectuosa, incompleta disociación EB o mala adherencia a la superficie de la placa de cultivo celular. Estas imágenes aparecen en contraste con los que se muestra en la figura 7B, que sana, normal las células DD4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.