Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

Resumen

Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.

Resumen

Las células madre embrionarias (ES) tienen el potencial de diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo o ectodermo) y pueden generar muchos linajes para la medicina regenerativa. ES la célula cultura en vitro ha sido objeto de preocupación generalizada. Clásicamente, se mantienen las células de ratón ES en factor inhibitorio del suero y la leucemia (LIF)-que contiene el medio. Sin embargo, bajo condiciones de suero/LIF, las células muestran heterogeneidad en la morfología y el perfil de expresión de genes relacionados con la pluripotencia y sobre todo en un estado metaestable. Por otra parte, las células cultivadas ES exhiben hipermetilación global, pero ingenuo ES las células de la masa celular interna (ICM) y células de germen primordiales (PGCs) son en un estado de hipometilación global. El estado de hypomethylated de ICM y PGCs está estrechamente relacionado con su pluripotencia. Para mejorar los métodos de cultivo de células de ratón ES, recientemente hemos desarrollado un nuevo método basado en la utilización selectiva combinada de dos compuestos de moléculas pequeñas para mantener el estado de hypomethylated y pluripotentes de ADN. Aquí, presentamos el co tratamiento de vitamina C (Vc) y PD0325901 puede borrar cerca de 90% de 5-METILCITOSINA (5mC) en 5 días en células ES de ratón. El contenido generado 5mC es comparable a la de PGCs. La investigación mecanicista demuestra que PD0325901 para arriba-regula la expresión Prdm14 para suprimir la Dnmt3b (metiltransferasa de ADNde novo ) y Dnmt3l (el cofactor de Dnmt3b), reduciendo la síntesis de novo de 5mC. VC facilita la conversión de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC) catalizado principalmente por Tet1 y Tet2, indicando la participación de demethylations de ADN activos y pasivos. Por otra parte, bajo condiciones de Vc/PD0325901, las células ES de ratón muestran morfología homogénea y estado pluripotente. Colectiva, proponemos una novela y un método de cultura química-sinergia para lograr hypomethylation de la DNA y el mantenimiento de la pluripotencia en las células ES de ratón. El método de química dependiente de molécula pequeña supera las deficiencias principales de la cultura de suero y tiene promesa de generar células de ES homogéneas para más aplicaciones clínicas e investigaciones.

Introducción

Células madre embrionarias se originan del ICM de un blastocisto¹. Las células están en un estado de pluripotencia y pueden formar todos los linajes somáticos y del germline las células². Creación de células madre embrionarias ofrece la oportunidad de investigar el desarrollo de procesos en vitro y puede generar células de importancia médica para la medicina regenerativa basada en su pluripotencia³.

Establecido dos grupos seminally las líneas de células ES de ratón en 1981 y cuando las células derivadas del embrión temprano de ratón fueron cultivadas en suero f....

Protocolo

1. preparaciones

1. Preparar una solución de 1,0 mM PD0325901 (inhibidor de la MEK) y 3,0 mM CHIR99021 (inhibidor GSK3).
   1. Pesar 2 mg de PD0325901 y 4,15 mL de DMSO en un frasco de vidrio ámbar.
   2. Pesar 2 mg de CHIR99021 y 1,43 mL de DMSO en un frasco de vidrio ámbar.
   3. Siguiente reconstitución, almacenar alícuotas (50 μl/tubo en tubos PCR de 200 μL) a-20 ° C y protegido de la luz. Quitar un tubo que contiene el caldo congelado del congelador y descongelar a temperatura ambiente antes de usar.
2. Pesar 0,0176 g de Vc en 1 mL de un tubo de centrífuga y reconstituir con 1 mL de agua estéril a una con....

Resultados

VC/PD0325901 había inducido sinergia global de eliminación de las células ES de ratón. Mouse ES cells en suero exhiben hipermetilación del ADN, mientras que células ICM pluripotentes y PGCs muestran borrado global de metilación del ADN y el estado de hypomethylated está estrechamente relacionado con su pluripotencia^9,10.

Anteriormente, nosotros y otros encontraron que Vc.......

Discusión

En el trabajo, hemos demostrado un nuevo método de la combinación de capital y PD0325901 para mantener las células de ratón ES en un estado indiferenciado y hypomethylated, que fue alcanzada por una acción sinérgica de promover la desmetilación del ADN por Vc y supresión de novo de DNA metilación de PD0325901. Por otra parte, las células ES de ratón demostraron gran morfología bajo el sistema de cultivo de Vc/PD0325901.

Para sustentar mejor el estado de las células de ratón ES en el s.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
suero fetal bovino fuente de Australia	Corning	35-076-CV	Componente del medio de células madre embrionarias de ratón
DMEM/glucosa alta	Hypclona	SH30022	Componente del medio de células madre embrionarias de ratón
LIF	Millipore	ESG1107	Componente de aminoácidos no esenciales del medio de células madre embrionarias de ratón
(NEAA)	Gibco	11140050	Componente del medio
piruvato de sodio	Gibco	11360070	Componente del medio de células madre embrionarias de ratón
L-glutamina	Gibco	25030081	Componente del medio de células madre embrionarias de ratón
Solución de penicilina estreptomicina	Gibco	15140122	Componente del medio celular ES de ratón
PBS	Sigma	P5493	Enjuague de células
tripsina	Hicclona	SH30042	Disociación celular
gelatina	Sigma	48722	Recubrimiento de placas
PD0325901	Stemolecule	04-0006-10	producto químico de molécula pequeña para cultivo celular
CHIR99021	Stemolecule	04-0004	producto químico de molécula pequeña para cultivo celular
vitamina C	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	XW00508171	producto químico de molécula pequeña para cultivo celular
Ultra Bioscience sistema de purificación de agua	Purelab	Ultra	Ultra agua
DMSO	Sigma	D8418	Centrífuga de medio de congelación celular
	Eppendorf	5427R	extracción de ADN y proteínas
	Sigma	P8340	Componente del tampón
PMSF Inhibidor de la proteasa	ThermoFisher Scientific	36978	Componente del tampón
RIPA DTT	Sigma	43815	Componente del tampón RIPA
EGTA	Sigma	E3889	Componente del tampón RIPA
Kit de purificación de ADN genómico	Promega	A1125	Extracción de ADN genómico
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	NanoDrop 2000	Determinación de la concentración de ADN
fosfatasa intestinal de ternero	New England Biolabs	M0290	Digestión de
ADN DNasa I	New England Biolabs	M0303	Digestión de ADN
serpiente fosfodiesterasa I	Sigma	P4506	Digestión de ADN
Nanosep 3K Omega	Pall	OD003C35	filtración de ADN digerido
1290 Sistema UHPLC	Agilent	1290	Separación UHPLC
G6410B espectrómetro de masas de triple cuadrupolo	Agilent	G6410B	Análisis MS/MS
Zorbax Eclipse Plus C18 columna	Agilent	Zorbax Eclipse Plus	colum para separación
de UHPLC 5-metilcitosina	Solarbio Life Sciences	SM8900	estándar 5mC
5-hidroximetilcitosina (estándar)	Toronto Research Chemicals	M295900	estándar 5hmC
Prdm14 anticuerpo	bioworld	BS7634	Western blot analysis-anticuerpo
primario Dnmt3a	anticuerpo bioworld	BS6587	Western blot analysis-anticuerpo primario
Dnmt3b anticuerpo	abcam	ab13604	Western blot analysis-anticuerpo primario
Anticuerpo Dnmt3l	abcam	ab3493	Análisis de Western blot-anticuerpo
primario Dnmt1	anticuerpo abcam	ab13537	Western blot analysis-anticuerpo
primarioβ-tubulina anticuerpo	bioworld	BS1482MH	Western blot analysis-anticuerpo primario
anti-conejo IgG	abcam	ab6721	Western blot analysis-anticuerpo secundario
anti-ratón de cabra IgG	abcam	ab6789	Análisis de Western blot-anticuerpo secundario
Trizol	Invitrogen	15596-026 Sistema de	extracción de ARN
	Promega	A3500	Transcripción inversa de ARN
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001	RT-PCR
StemTAG kit de ensayo de tinción y actividad de fosfatasa alcalina	Células Biolabs, Inc.	CBA-302	análisis de tinción de fosfatasa alcalina
células madre embrionarias de ratón: WT, 129 SvEv	proporcionado por el profesor Guoliang Xu (Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghái, Academia China de Ciencias, Shanghái, China)		cepa celular de células madre
embrionarias de ratón microscopio	Zeiss	LSM510	células
Prisma GraphPad 5.0	Prisma GraphPad Software Inc.	5.0	Análisis estadístico

de células madre embrionarias de ratón Cóctel inhibidor de proteasa de RIPA veneno de cabra transcripción inversa de observación