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Artículo de método

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

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DOI:

10.3791/56411

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9 de noviembre de 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.

Resumen

Quimiotaxis, o migración a un gradiente de quimioatractiva, es el mejor modo de entender de migración dirigida. Estudios social ameba Dictyostelium discoideum reveló que una red de transducción de la señal compleja de caminos paralelos amplifica la respuesta a atrayentes y lleva a la polimerización de la actina sesgada y saliente de un seudópodo en la Dirección de un degradado. En cambio, no se conocen mecanismos moleculares conducir otros tipos de migración dirigida, por ejemplo, debido a la exposición a flujo o campos eléctricos, de cizalla. Muchos reguladores de quimiotaxis exhiben localización en el revestimiento de borde o de una migración de la célula, así como mostraron cambios transitorios en la localización o la activación después del estímulo global con un chemoattractant. Para entender los mecanismos moleculares de otros tipos de migración dirigida se desarrolló un método que permite la examinación de la respuesta celular al estímulo mecánico agudo basado en la exposición breve (2-5 s) a flujo del esquileo. Esta estimulación se puede entregar en un canal mientras que las células con marcada con fluorescencia biosensores para examinar el comportamiento de células individuales de la proyección de imagen. Además, la población celular puede ser estimulado en una placa, lisis y immunoblotted utilizando anticuerpos que reconocen las versiones activadas de proteínas de interés. Mediante la combinación de ambos ensayos, uno puede examinar una amplia gama de moléculas activadas por cambios en la localización subcelular o fosforilación. Con este método determinamos que la estimulación mecánica aguda desencadena la activación de las redes de citoesqueleto de actinia y transducción de señal quimiotáctica. La capacidad de examinar las respuestas celulares a la estimulación mecánica aguda es importante para comprender los eventos Inicio necesarios para motilidad inducida por el flujo del esquileo. Este enfoque también proporciona una herramienta para el estudio de la red de transducción de señal quimiotáctica sin la influencia de la confusión del receptor chemoattractant.

Introducción

Migración de las células eucariotas está sesgada por diversas señales químicas y físicas en el medio ambiente, incluyendo gradientes de atrayentes solubles o sustrato enlazado, rigidez variable de los sustratos, campos eléctricos o flujo del esquileo. Aunque ha habido muchos avances en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares conduce chemotaxis, menos se sabe acerca de otros tipos de migración dirigida y cómo se integran estas diversas señales a nivel celular para producir un migratorias respuesta.

Dirigido la migración hacia un aumento de la concentración de un chemoattractant implica tres componentes conductuales: motilidad, detección direccional y polaridad1. La motilidad se refiere al movimiento aleatorio de las células mediante protrusión de pseudópodos. Es la capacidad de una célula para detectar la fuente de quimioatractiva de detección direccional, que puede ocurrir incluso en inmovilizado células. La polaridad se refiere a la distribución asimétrica más estable de componentes intracelulares entre el líder y el revestimiento de borde de una célula, que conduce a mayor persistencia en movimiento.

Respuesta celular a un chemoattractant depende de la actividad de redes reguladoras expresiones definidas cuatro: receptor / G proteína, transduction de la señal, citoesqueleto de actina y polaridad1. Chemoattractant atascamiento al receptor acoplado a proteínas G transmite la señal vía heterotriméricas G proteínas α y βγ a la red de transducción de la señal descendente, que amplifica la señal direccional. Múltiples vías dentro de la red de transducción de señal actúan en paralelo y alimentan la red del citoesqueleto de actina y polimerización de la actina sesgo, protrusión de seudópodo consecuente, en la dirección del gradiente. Importantes reguladores de la quimiotaxis son Ras GTPase, TorC2, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN) y ciclasa guanylyl. Mecanismos de retroalimentación dentro de la red de transducción de señal y la transducción de señales y redes de citoesqueleto de actina más amplifican la respuesta. Finalmente, la red de polaridad mal definida recibe entrada desde el citoesqueleto de actina y sesgos aún más la red de transducción de señal para promover la migración persistente en la dirección del gradiente.

Gran parte de nuestra comprensión mecanicista de la quimiotaxis fue posible debido al desarrollo de biosensores con etiqueta fluorescente para diversos componentes de las redes reguladoras. Muchos reguladores de quimiotaxis tienen una distribución asimétrica de la molécula reguladora de sí mismo o de su actividad. Por ejemplo, biosensores que reconocen activación versiones de pequeño GTPases Ras y Rap1 – dominios de unión a Ras de Raf1 (denominado RBD aquí) y RalGDS, respectivamente-localizar a la vanguardia de una célula chemotaxing2,3. Del mismo modo, PI3K y su producto fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3), reconocido por un dominio de homología (PH) pleckstrin, también Mostrar localización en el frente de una célula4,5. Por el contrario, una 3-fosfatasa PTEN, que convierte PIP3 a fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato, se localiza en el borde del revestimiento de la célula6. Lo importante, estos biosensores cambian su localización en la respuesta a la estimulación global con un chemoattractant. Marcadores de vanguardia, citosólico o en las extremidades de salientes en una celda de reclinación, relocalizar a la corteza, mientras que quedándose marcadores del borde, localización cortical y están ausentes de las puntas de salientes en una reclinación de la célula, se convierten en citosol después de estimulación. Análisis de la distribución de biosensor en respuesta a la estimulación global con un chemoattractant minimiza la contribución de motilidad y polaridad, que a menudo confundir las observaciones. Estimulación global o uniforme de una suspensión con un chemoattractant también se utiliza como una herramienta para evaluar los cambios de toda la población en la activación de la proteína, a menudo detectada por fosforilación de proteínas7,8,9 . Este análisis bioquímico se utilizan principalmente para obtener información temporal, mientras que la microscopia se utiliza para recopilar información temporal y espacial sobre el comportamiento de los diversos componentes de las redes reguladoras.

La red de transducción de señal incorpora características de un sistema excitable10,11. Respuestas a los estímulos quimiotácticos supra umbral son "escogiendo" y mostrar períodos refractarios. Las respuestas se desencadenan también estocástico y pueden mostrar comportamiento oscilatorio. Eventos de transducción de señal se localizan en las regiones de la corteza que se propagan como ondas12,13,14,15. Frente, detrás, marcadores son reclutados a o disocian de las zonas activas de las ondas de propagación. Debido a la región refractaria que se arrastra la zona activa, las olas opuesto dirigidas aniquilan como se encuentran. Las olas de transducción de señal propagación subyacen las protuberancias celulares que median la migración de la célula10.

Mucha de la información mencionada en la quimiotaxis vino de los estudios sobre la ameba social discoideum de Dictyostelium, aunque mecanismos regulatorios similares también son aplicables a los neutrófilos y otros tipos de células de mamífero16 . Dictyostelium es un organismo modelo bien establecido que cuenta con una robusta respuesta quimiotáctica durante hambre, cuando miles de células migran hacia un centro de agregación, eventualmente formando un cuerpo fructífero multicelular que contiene esporas. Chemotaxis es también esencial durante la etapa de crecimiento de la célula solo de este organismo para la localización de fuentes de alimentación bacteriana. Lo importante, migración de células de Dictyostelium solo es notable similar a la migración de neutrófilos mamíferos o de las células de cáncer metastásico, que sufren migración ameboides tipo muy rápida. De hecho, tanto la topología global de las redes de regulación, así como muchas de las vías de transducción de señal individuales implicadas en la quimiotaxis se conservan entre Dictyostelium y leucocitos mamíferos17. Además, otras células, como fibroblastos, usan quinasas de tirosina del receptor (RTK) en lugar de GPCRs; sin embargo, RTKs pueden alimentar redes similares.

En contraste con la quimiotaxis, carece de comprensión de los mecanismos de señalización que conducen a otros modos de la migración dirigida. De manera similar a las células que migran en un gradiente chemoattractant varios estudios han reportado activación o localización de marcadores típicos de vanguardia, incluyendo la polimerización de la actina, PIP3 o quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2, en el frente de las células que experimentan dirigido migración en respuesta a esfuerzo cortante flujo o cambios en campos eléctricos18,19,20,21. Sin embargo, en estos estudios la exposición continua al estímulo también dio lugar a la migración de la célula, dejando abierta la pregunta si, por ejemplo, los marcadores de punta localización específicamente en respuesta a un estímulo, o si simplemente localiza en el borde de ataque debido a aumento del número de pseudópodos en la parte delantera de una migración de la célula.

Desarrollamos análisis que nos permiten observar la respuesta de las células a perturbación mecánica aguda entregado como esquileo del flujo tanto a nivel poblacional y como células individuales22. Similar a la estimulación global con quimioatractiva, estimulación agudación con esquileo del flujo permite el estudio de la respuesta celular a un estímulo mecánico sin la contribución de la confusión de la motilidad o polaridad. Combinando estos ensayos bioquímicos y microscópicos con perturbaciones genéticas o farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecánicos cómo se perciben y se transmite. Por otra parte, este enfoque también proporciona un método novedoso para aprovechar el sistema aguas abajo del receptor chemoattractant en ausencia de un chemoattractant, aislando así las señal de transducción y de la actinia citoesqueleto redes de receptor/G red de la proteína.

Utilizando las técnicas descritas a continuación recientemente demostró que corte la tensión aguda conduce a la activación de múltiples componentes de la señal quimiotáctica transducción y actinia citoesqueleto redes22. Mediante la aplicación de la estimulación mecánica aguda a intervalos diferentes, demostramos que, semejantemente a atrayentes, respuesta a estímulos mecánicos también exhibe características de un sistema excitable, incluyendo el comportamiento escogiendo de la respuesta en condiciones de saturación y la presencia de un período refractario. Finalmente, mediante la combinación de estimulación mecánica y química mostramos que dos estímulos comparten señal transducción y actinia citoesqueleto redes, que probablemente permitan la integración de múltiples estímulos a la migración de células de sesgo.

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Protocolo

1. preparación de soluciones

  1. HL-5 preparar medios utilizando lo siguiente: 10 g/L dextrosa, peptona Proteosa de 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, 0,965 g/L de Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 PO 4 y salvo indicación en contrario, estreptomicina de 0,03 g/L en agua desionizada. Autoclave el medio y almacenar a temperatura ambiente.
    Nota: Debido a las diferencias entre Proteosa peptona y levadura extracto adquiridos de diferentes proveedores, así como entre lotes individuales, pH de los medios de comunicación puede necesitar ajustarse a la gama típica de 6.4 a 6.7.
  2. Placas SM preparar utilizando lo siguiente: 10 g/L dextrosa, peptona 10 g/L, 1 g/L levadura extracto, 2,31 g/L de KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 y agar 20 g/L en agua desionizada. Autoclave, enfriar y vierta 30 mL de la solución de agar por caja de Petri de 10 cm. Una vez que el agar se solidifica, almacenar las placas a 4 ° C durante 1 mes.
  3. Prepare 10 x Buffer de fosfato (PB) utilizando 13,4 g/L de Na 2 HPO 4 ·7H 2 O y 6,8 g/L KH 2 PO 4 en agua desionizada. Almacenar el stock de 10 x a 4 ° C. Diluya a 1 x con agua desionizada para uso.
  4. Preparar Buffer DB complementando 1 X PB con MgSO 4 de 2 mM y 0,2 mM CaCl 2.
  5. Preparar la cafeína 100 mM en agua desionizada. Almacenar en − 20 ° C.
  6. Preparar 100 mM campo solución disolviendo campo sodio monohidrato de sal en agua desionizada. Preparar un 1 mM trabajando valores en agua desionizada. Almacenar ambas soluciones en − 20 ° C. preparar campo solución final a la concentración deseada en DB en el día del experimento.
    Nota: Soluciones de Stock puede congelar-descongelar varias veces.
  7. Preparar ácido de fólico de 25 mM x 1 PB. Añadir unas gotas de 1 N NaOH hasta que el polvo se disuelva completamente. Almacenar en − 20 ° C.
  8. Prepara el tampón x 3 usando lo siguiente: 187,5 mM Tris-HCl de pH 6.8, 6% (w/v) sodio dodecil sulfato (SDS), 30% glicerol, 126 mM Ditiotreitol y 0.03% (p/v) azul de bromofenol. Alícuota y tienda en − 20 ° C.
    1. Antes de utilizar, descongele en un baño de agua de 37 ° C y proceder a preparar el tampón con inhibidores de la proteasa y fosfatasa diluir 3 x sample buffer 1 x, y agregando 50 mM NaF, pirofosfato de sodio 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4 y 1 x completa libre de EDTA inhibidor de la proteasa en agua desionizada. Añadir los inhibidores inmediatamente antes de iniciar el procedimiento descrito en los pasos 3.1.2-3.1.3.
  9. Prepare 5 mM solución A Latrunculin en DMSO. Alícuota y tienda en − 20 ° C.

2. Preparación de células de D. discoideum

Nota: mantener D. discoideum las células HL-5 medios en placas de cultivo de tejidos o en una suspensión de cultivo como describió anteriormente 23. Cuando sea necesario, transformar las células con marcada con fluorescencia biosensores según protocolos de la electroporación estándar 24. Varias cepas de D. discoideum, como plásmidos codifican biosensores u otros genes de interés se pueden obtener desde el centro de la acción de Dicty (dictybase.org).

  1. Crecimiento y recolección de las células vegetativas de D. discoideum
    1. para el análisis de células vegetativas, crecen las células en presencia de bacterias para reducir el número de macropinosomes, que típicamente se observan en las células axenically cultivadas 25.
      1. Preparar un cultivo de Klebsiella aerogenes por inocular a una pequeña cantidad de células de un stock de glicerol o de una cultura anterior en el volumen deseado de medio de HL-5 sin antibióticos. Incubar el cultivo bacteriano en un agitador orbital a 200 rpm (0.42 x g) a temperatura ambiente (20-22 ° C) para 16-18 h.
        Nota: La K. aerogenes variedad utilizada aquí es no patógenos (ver la Tabla de materiales).
    2. D. discoideum en la fase de crecimiento exponencial de las placas de cultivo de tejidos o de una cultura de suspensión y contar las células usando un hemocitómetro según fabricante ' instrucciones. Extensión 1 x 10 5 D. discoideum las células con suspensión de K. aerogenes de 260 μL en una placa de SM. Gire la placa boca abajo al día siguiente. Cultivar células a temperatura ambiente hasta las células de D. discoideum empiezan a limpiar el césped bacteriano pero antes de que empiecen a agregar (~ 36-48 h).
    3. Recoger D. discoideum las células en 5 mL DB de tampón por raspado con un difusor de vidrio. Transferir las células a un tubo de polipropileno de 50 mL. Enjuagar el plato con otro buffer 5 mL DB y piscina con la suspensión original. Llenar el tubo de 50 mL con buffer DB.
    4. Centrífuga la suspensión de D. discoideum a x 360 g 3-4 min aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 mL Buffer DB. Repita los pasos de lavado hasta que el sobrenadante esté claro (~ 3 a 4 lavados). Resuspender el precipitado final de la célula en buffer DB a una densidad final de ~ 5 x 10 6 células/mL.
  2. Preparación de agregación-competente D. discoideum las células
    1. desarrollo D. discoideum las células por inanición de 1 h seguida de 4 h de hambre y de pulsación con campamento nM 50 cada 6 min según norma protocolos de 23.
    2. Tras desarrollo, medir el volumen final de la suspensión celular.
    3. Basado en el número inicial de células utilizadas para el desarrollo, calcular la densidad celular de la suspensión final.
      Nota: Si el campo se entrega en volúmenes de 100 μl a cada 6 minutos, volumen celular aumenta 1 mL por cada hora de campo pulsante. Así, para las condiciones estándar con 8 x 10 7 células en 4 mL de DB, después de 4 h de desarrollo el volumen final es de 7 mL y la densidad celular final es ~1.1 x 10 7 células/mL.

3. Análisis bioquímicos de la respuesta de la célula mecánica o estimulación química

  1. Aguda mecánica estimulación de células seguida de lisis celular
    1. placa 2 x 10-6 competente agregación de células (del paso 2.2) después de 4 h de desarrollo en platos de 35 mm con 2 mL de DB. Permitir a las células a conectar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar las células dos veces con 1 mL de DB. Incubar las células en DB con cafeína 2,5 mM por 30 min sin ninguna alteración de las placas.
      Nota: Si las células necesitan ser tratados con un inhibidor farmacológico, agregar inhibidor de la concentración o el mismo volumen de vehículo apropiado durante basalation con cafeína.
    2. Para aplicar el estímulo mecánico, coloque el plato (uno a la vez) en un agitador orbital y encender inmediatamente a 150 rpm (0.24 x g) durante 5 s.
      Nota: La placa puede también ser manualmente estimulada por el movimiento de manera transversal durante aproximadamente 5 s.
    3. Aspirado el buffer en el indicado tiempo después del inicio de la estimulación. Inmediatamente lyse las células mediante la adición de 100 μl de tampón de muestra con inhibidores de la proteasa y fosfatasa.
    4. Coloque la placa en el hielo y recoger el lisado en un tubo de 1,5 mL. Para ' momento 0 ', lyse las células sin agitación. Transferir los tubos a un bloque de calor de 95 ° C durante 10 minutos inmediatamente después de la lisis. Proceder con immunoblotting o almacenar lisados de-20 ° C.
  2. Estimulación de las células con un Chemoattractant
    1. Basalate células agregación competentes después de 4 h de desarrollo por agitación rápidamente en presencia de cafeína de 5 mM a 200 rpm (0.42 x g) en un agitador orbital para 30 minutos.
      1. Centrífuga la suspensión celular en x 360 g 3-4 min aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 mL Buffer DB helada. Repetir el lavado.
    2. Resuspender el precipitado final de la célula en helada buffer DB a una densidad final de 4 x 10 7 células/mL en función del número de celular inicial utilizado para el desarrollo de las células (véase el paso 2.2). Mantener la suspensión de células en el hielo antes de stimulación.
      1. Pipeta 50 μl de 10 μm campo o vehículo en un recipiente de poliestireno se colocan en un agitador orbital.
    3. Para estimular las células, añadir 450 μl de la suspensión helada en la misma copa e inmediatamente encienda el agitador a 200 rpm (0.42 x g). En varias ocasiones después del comienzo del estímulo (por ejemplo, 10, 30, 45, 60, 120 s) brevemente dejar la coctelera, sacar 50 alícuotas de μl de suspensión celular y lyse las células mediante la adición a tubos de 1,5 mL conteniendo 25 μl 3 X buffer de la muestra.
      1. Para ' momento 0 ', utiliza las células de la suspensión helada sin estimular.
        Nota: La temperatura final de la suspensión de la célula durante la estimulación es ~ 9 ° C 26. En estas condiciones la respuesta máxima ocurre ligeramente más adelante que el pico observado para la estimulación realizada a temperatura ambiente (por ejemplo, chemoattractant estimulación de células adherentes en el microscopio, o estimulación mecánica de las células adherentes).
    4. Transferir los tubos a un bloque de calor de 95 ° C durante 10 minutos inmediatamente después de la lisis. Proceder con immunoblotting o almacenar lisados de-20 ° C.
  3. Análisis de la respuesta celular por Immunoblotting
    1. Ejecutar lisados (de pasos 3.1.3 o 3.2.4) en un gel de poliacrilamida al 4-15% Tris-HCl, transferencia a una membrana de fluoruro de polivinilideno, bloque y immunoblot con phospho-PKC Ζ Thr410 (para detectar fosfo-PKBR1 y fosfo-PKBA). Detectar la señal por la incubación con rábano conjugado con peroxidasa anti-conejo anticuerpo secundario, seguido por quimioluminiscencia utilizando sustrato de quimioluminescencia realzada.
    2. Para la detección de múltiples proteínas, tira el blot con tampón de extracción y volver a la punta de prueba con un anticuerpo primario contra la fosfo-p42/44 MAPK Thr302/304 (para detectar el phospho-ERK2). Confirmar la proteína igual cargando por la coloración de la membrana de fluoruro de polivinilideno con azul brillante de Coomassie.

4. Aguda la estimulación mecánica y en vivo la proyección de imagen de las células en el microscopio

  1. evaluación de la respuesta a la estimulación mecánica aguda usando un dispositivo de flujo
    1. recoger y diluir vegetativo o agregación competente células de ~ 1 x 10 6 células/mL en DB como se describe en los pasos 2.1 y 2.2, respectivamente. Cargar ~ 600 μL en la diapositiva con un canal (vea la Tabla de los materiales para más detalles). Permiten que las células a conectar para mínimo 10 Asegúrese de que todas las entradas de la diapositiva están completamente llenos. Rellenar con buffer adicional si es necesario.
      Nota: La diapositiva particular utilizada para el análisis tiene tres entradas, que alimentan los canales estrechos, 1 mm, pero luego fusionan a un canal ancho, 3 mm. La altura del canal es de 0,4 mm. Aunque las células son plateadas a lo largo del canal, sólo la parte ancha es imagen.
    2. Pasar una de las líneas que está conectada a un depósito de 50 mL a través de la válvula derecha frontal de la unidad de neumático (véase la Tabla de materiales para más detalles). Usando el software para la bomba, asegúrese de que la válvula está cerrada (es decir, a la izquierda). Llene el depósito con DB.
      1. Ajuste la presión a 50 mbar y enciéndala. Llenar y lavar la línea con DB haciendo clic en la válvula para abrirla. Convertir la presión a 0 y cerrar la válvula después de ~ 30 s.
    3. Conecte la línea a una de las tres entradas en un lado de la diapositiva sin atrapar burbujas de aire. Conecte las entradas de otros dos. Conecte la línea del drenaje a la entrada solo en la segunda parte de la diapositiva.
      Nota: La tubería que se utiliza para las líneas de entrada y desagüe en esta configuración tiene un diámetro interior de 1,6 mm.
    4. Colocar el portaobjetos en el microscopio bajo objetivo de aire de 20 X. Para enjuagar el canal, cambiar la válvula para abrir la línea y haga clic en " en la presión ", partida en una presión más alta (~ 50 mbar o ~ 40 dyn/cm 2) para empujar el líquido por el desagüe.
      1. Una vez que el líquido sale por el drenaje, reducir la presión externa a cero (es decir. gravedad flujo, ~ 15 dyn/cm 2) y continúe enjuagando ~ 30 s. interruptor de la válvula a la posición opuesta para detener el flujo.
    5. Adquirir imágenes con iluminación RFP o GFP en un microscopio de fluorescencia invertido bajo un 40 X objetivo de aceite en intervalos s 3. Con la válvula en posición cerrada, encender la presión a la presión deseada, típicamente entre 15 y 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
    6. Después de adquirir 5 marcos, entregar el estímulo por la conmutación de la válvula de la " abrir " posición. Apaga el flujo s de 2-5 por la válvula de conmutación a la posición contraria.
      Nota: Para algunos biosensores más débiles (por ejemplo, PTEN, CynA y RalGDS) puede ser necesario a las células de la imagen utilizando un microscopio confocal equipado con una de 40 X objetivo aceite.
  2. Pruebas de efectos de los inhibidores farmacológicos en respuesta a la estimulación mecánica aguda usando un dispositivo de flujo de
    1. placa de células en el portaobjetos con un canal como se describe en el paso 4.1.1. Establecer dos líneas: pasar una línea a través de la válvula derecha frontal como en el paso 4.1.2, y el segundo por la parte posterior izquierda válvula. La línea izquierda de la abrazadera y la válvula en el " cerrado " posición (izquierda). Una línea de llenado con DB que contiene el vehículo apropiado y el segundo con la solución que contiene un inhibidor farmacológico de interés (por ejemplo 5 μm Latrunculin A).
      Nota: Es necesario fijar físicamente la línea de izquierda porque el " cerrado " posición izquierda abre la válvula para la línea.
    2. Llenado y enjuague el derecho línea activando la presión a 50 mbar y conmutación de la válvula de la " abrir " posición (derecha). Conectar la válvula a la izquierda después de ~ 30 s. llenado y enjuague la línea izquierda quitando la pinza de conexión s. ~ 30 líneas a dos de las entradas en un lado de la diapositiva con un canal, conecte la entrada restante y conecte el drenaje a la entrada solo en el segundo lado. < / l i >
    3. lavar el portaobjetos con el tampón en la línea correcta y realizar estimulación en el mismo buffer como se describe en los pasos 4.1.3 y 4.1.4 arriba.
      Nota: Aunque la línea de la derecha fue elegida como el primero en esta configuración, el orden podría revertirse.
    4. Tras estimulación, interruptor de la válvula para abrir la línea derecha a presión nula (es decir, flujo por gravedad solamente, ~ 15 dyn/cm 2). Retire la abrazadera de la línea izquierda y cambiar la válvula a la izquierda para abrir esa línea. La primera línea de la abrazadera.
    5. Después de 3 a 5 mL de tampón con inhibidor a través, interruptor de la válvula hacia la derecha para detener el flujo e incubar las células con el inhibidor de la longitud requerida de tiempo (por ejemplo 15 minutos). Encender el flujo por la conmutación de la válvula cada min ~ 10 ~ 15 s para evitar la privación de oxígeno. Repita la estimulación con la segunda línea.
  3. Método alternativo para evaluar la respuesta a la estimulación mecánica aguda utilizando una micropipeta
    1. configurar la micropipeta llenada de DB según protocolo estándar 23. Mantener la presión de compensación a 1.500 psi.
    2. Recoger y diluir las células vegetativas como se describe en el paso 2.1. Gotas de lugar 25 μl de ~7.5 x 10 5 células/mL en un compartimiento del pozo 1, permiten adherirse durante al menos 10 minutos y cubrir con 3 mL DB.
    3. Coloque la cámara en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con objetivo 40 X aceite. Localizar las células. Baje suavemente la micropipeta en el centro del campo de visión hasta que primero toque la parte inferior de la cámara de.
      Nota: Puesto que la presión de la indemnización fue fijada en 1.500 Psi, las células estarán continuamente expuestas a un flujo muy lento de DB de la micropipeta.
    4. Comenzar adquirir imágenes con iluminación RFP o GFP en intervalos s 3. Aplicar la ' limpiar ' función para liberar un bolo de líquido de la micropipeta. Continuar con la proyección de imagenn la presencia de flujo debido a la presión de compensación solo.
  4. Un método alternativo para evaluar la respuesta a la estimulación mecánica aguda mediante la adición de tampón a granel
    1. recoger y diluir las células vegetativas como se describe en el paso 2.1. Colocar gotas de 20 μl de células en ~ 1 x 10 6 células/mL en DB en medio de un pozo de una cámara de 8 pozos. Permitir que las células se adhieran durante al menos 10 min
    2. Comenzar adquirir imágenes con iluminación específica RFP o GFP en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con objetivo 40 X en intervalos s 3. Centrarse en un área cerca del borde de la caída de.
    3. Rápidamente añadir 430 μl de DB a un lado del pozo. Continuar la proyección de imagen de.
    4. Para el análisis de la interacción entre estímulos mecánicos y químicos, 12 o 45 s después del estímulo mecánico, suavemente añadir 50 μl de ácido fólico (concentración final 20 nM) o vehículo (DB) sin la inducción de una respuesta mecánica. Continuar la proyección de imagen de.
  5. Cuantificación de la respuesta
    1. abrir la imagen TIFF de 32 bits en el Software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales para más detalles) 27.
    2. En el ' analizar ' pestaña, ir a la " establecer medidas ". Marque la casilla para ' valor de gris medio '. Asegúrese de que no se comprueban los otros cuadros. Haga clic en " OK ".
    3. En el ' proceso ' ficha, haga clic en " restar fondo ". Mantener el radio de la bola rodante en 50 píxeles y hacer no Compruebe cualquiera de las opciones enumerada en el menú. Zoom a una celda usando la ' lupa ' herramienta.
    4. Con el ' rectángulo ' herramientas, dibujar un cuadro (~2.5 x 2,5 μm 2) en el citosol, asegurándose de no dibujarlo sobre el núcleo o la membrana plasmática. Prensa " Ctrl " + " M " las llaves o ir a la ' analizar ' ficha y haga clic en " medida " para determinar el valor medio de gris de la caja. Avance a Marcos posterior y mida otra vez, asegurándose de que la caja permanece en el citosol.
      Nota: Puesto que D. discoideum las células se mueven muy rápidamente la caja se puede mover de un marco al siguiente en el citosol.
    5. Después de todo de los marcos han sido analizados, copiar los valores en una hoja de cálculo. Para tener en cuenta variación de célula a célula en los niveles de expresión de diversos biosensores, normalizar los valores para el valor de gris medio observado a tiempo 0. Calcular la inversa de los valores que reflejan la acumulación de la señal en la corteza.

5. Continua estimulación mecánica y en vivo la proyección de imagen de las células en el microscopio

  1. configurar las células exactamente como se describe anteriormente para el análisis de la estimulación mecánica aguda en pasos 4.1.1 - 4.1.3. Abrir el tapón que cubre el depósito con el buffer por lo que el volumen puede ser coronado si respuesta es analizada por más de unos minutos a la vez.
    Nota: Porque el depósito permanece abierto durante la duración del experimento, este ensayo se lleva a cabo en ausencia de presión externa y se basa en flujo por gravedad solamente. Para aumentar la velocidad de flujo por gravedad, el drenaje se puede colocar sobre una mesa debajo del microscopio.
  2. Comienzan las células con iluminación específica RFP o GFP en un microscopio invertido de fluorescencia equipado con objetivo 40 X en 3 intervalos de s para el análisis de las respuestas de biosensor la proyección de imagen. Por otra parte, la imagen con contraste de fases con objetivo 20 X en 10 intervalos de s para el análisis de la migración de la célula general.
  3. Activar el flujo después de varios marcos en el ajuste de presión de cero (es decir, el flujo es debido a la gravedad sola o ~ 15 dyn/cm 2) por la válvula de conmutación a la posición abierta. Cuando el nivel del líquido baja a 5-10 mL en el tanque, se recarga con el almacenador intermediario más. No se olvide de añadir el líquido con cuidado para que las burbujas de aire no quede atrapadas en las líneas de.
    Nota: Es importante agregar el líquido de la misma temperatura para evitar una respuesta de choque en las células.
  4. Cuantificar células velocidad y persistencia usando software de análisis de la migración (véase la Tabla de materiales para más detalles) según el fabricante ' instrucciones s.

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Resultados

Respuesta temporal de los reguladores de quimiotaxis a estimulación mecánica aguda

Para evaluar la respuesta de D. discoideum las células al estímulo mecánico, células adherentes de agregación competentes fueron expuestas a un breve pulso de esquileo del flujo. Agregación-competente D. discoideum células secretan cAMP, que puede ser detectado por vecinos células. Para superar la contribución de la señalización de ...

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Discusión

Los métodos descritos aquí ofrecen una manera conveniente de evaluar población y comportamiento individuales de la célula en respuesta a flujo del esquileo. Lo importante, mientras que estudios previos analizan localización de los principales y marcadores del borde del revestimiento durante la migración, el enfoque actual permite investigación de efectos inmediatos aplicando el flujo de corte agudo. Con este método hemos demostrado que, de hecho, la respuesta inicial de las células para flujo del esquileo no obliga a mig...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de donación de salud GM118177 R35 para PND.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FisherD16-1Úselo para preparar medios HL-5 y placas SM (pasos 1.1, 1.2)
Proteosa peptonaFisherDF0120-17-6Úselo para preparar medios HL-5 (paso 1.1)
Extracto de levaduraFisher50-550-445Úselo para preparar medios HL-5 y placas SM (pasos 1.1, 1.2)
Na2HPO4· 7H2OFisherS373-500Úselo para preparar medios HL-5 y tampón de fosfato 10X (pasos 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500Úselo para preparar medios HL-5, placas SM y tampón de fosfato 10X (pasos 1.1-1.3)
Estreptomicina (sulfato de dihidroestreptomicina)FisherICN10040525Úselo para preparar medios HL-5 (paso 1.1)
Peptona (Bacto)FisherDF0118-17-0Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)
K2HPO4FisherP288-100Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)
AgarFisherBP1423-500Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)
MgSO4FisherM65-500Úselo para preparar DB Buffer (paso 1.4)
CaCl2FisherC79-500Úselo para preparar DB Buffer (paso 1.4)
CafeínaFisherO1728-500Úselo para preparar cafeína (paso 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 pies, 5 pies-monofosfato cíclico, sal de sodio)Fisher11-680-1100MGÚselo para preparar cAMP (paso 1.6)
Ácido fólicoSigmaF7876Úselo para preparar fólico ácido (paso 1.7)
Tris baseFisherBP152-500Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)
Dodecil sulfato de sodio (SDS)FisherBP166-500Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)
GlicerolFisherG33-500Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)
Ditiothreitol (DTT)Bio-Rad1610610Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)
Azul de bromofenolBio-Rad1610404Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)
NaFFisherS299-100Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)
Pirofosfato de sodio decahidratadoFisherS390-500Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)
Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche)Sigma11873580001Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)
Latrunculina AEnzo Life SciencesBML-T119-0100Úselo para preparar latrunculina A (paso 1.9)
4-15% Tris-HCl gel de poliacrilamidaBio-Rad3450029Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)
Membrana de fluoruro de polivinilidenoBio-Rad1620177Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticuerpo de conejoCell Signaling2060Anticuerpo primario para uso en inmunotransferencia (paso 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticuerpo XPCell Signaling4370Anticuerpo primario para uso en inmunotransferencia (paso 3.3)
Conejo IgG HRP Linked Whole Ab (de Burro)GE HealthcareNA934-100ULAnticuerpo secundario para uso en inmunotransferencia (paso 3.3)
Sustrato de quimioluminiscencia mejorada (Clarity Western ECL Substrate)Bio-Rad1705060Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)
Tampón de extracción (Restore Plus tampón de eliminación de Western blot)PiercePI46430Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)
Cepa de K. aerogenes (no patógena)Dicty Stock Center (dictybase.org)
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Materials and Equipment
Orbital shaker (modelo G-33, o una alternativa comparable)New Brunswick Scientific Usopara cultivar K. aerogenes (paso 2.1.1), y para basalar y estimular células D. discoideum (paso 3). El radio de giro de este agitador es de 9,5 mm.
Placa de Petri de 10 cmFisher FB0875712Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)
HemocitómetroFisher02-671-51BÚselo para contar células D. discoideum (paso 2.1.2)
Plato de 35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)Fisher08-772AÚselo para colocar células D. discoideumcells para la estimulación mecánica seguida de lisis celular (paso 3.1.1)
Vaso de poliestireno (5 ml)VWR13915-985Úselo para estimular la suspensión de células D. discoideum con un quimioatrayente (paso 3.2.2)
Unidad de fluidos con bomba (ibidi Pump System)Ibidi10902Úselo para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5)
Portaobjetos con canal (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 cubreobjetos de polímero, tratados con cultivo de tejidos, esterilizados)Ibidi80316Úselo para colocar células D. discoideum para la estimulación mecánica administrada por un dispositivo fluídico (pasos 4.1, 4.2 y 5)
Depósitos de 50 mL (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)Ibidi10978Utilícelo para configurar el dispositivo fluídico para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5)
Líneas para la unidad fluídica (Juego de perfusión AMARILLO-y-VERDE)Ibidi10964Utilícelo para configurar el dispositivo fluídico para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5). Nota: las dos líneas también se pueden cortar del tubo de 1,6 mm (número de catálogo 10842).
Línea para el drenaje (tubo de 1,6 mm de diámetro interior)Ibidi10842Utilícelo para configurar el dispositivo fluídico para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5).
Microscopio invertido Zeiss Observer.Z1 equipado con un objetivo de aceite de 40X/1.3 y un objetivo de aire de 20X/0.3 (o una alternativa comparable)ZeissSe utiliza para obtener imágenes de células D. discoideum con iluminación de contraste de fase o fluorescencia (pasos 4 y 5)
Microscopio confocal de disco giratorio UltraView equipado con un microscopio confocal de disco giratorio 40×/1.25– 0,75 objetivo de aceite (o una alternativa comparable)Perkin-ElmerDM 16000Una alternativa utilizada para obtener imágenes de células D. discoideum (paso 4.1.4)
Microinyector FemtoJet (Eppendorf; modelo 5247, o una alternativa comparable) con Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D y 5192000027Se utiliza para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum mediante una micropipeta (paso 4.3). Nota: el número de catálogo corresponde a la versión más reciente del equipo (4i).
Micropipeta (Femtotip; 1 μ m diámetro exterior, 0,5 μ m de diámetro interior )Eppendorf930000035Úselo para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum mediante una micropipeta (paso 4.3)
Puntas de microcargador (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)Eppendorf5242956.003Úselo para llenar la micropipeta (femtotip) con tampón (paso 4.3.1)
Cámara de 1 pocillo (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)Fisher12-565-472Úselo para colocar células D. discoideum para la estimulación mecánica administrada por una micropipeta (paso 4.3.2)
Cámara de 8 pocillos (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)Fisher12-565-338Úselo para colocar células D. discoideum para la estimulación mecánica administrada por adición masiva de tampón (paso 4.4.1)
NameCompanyNúmero de catálogo>Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji)NIHhttps://fiji.sc/Uso para cuantificar la respuesta a la estimulación mecánica (paso 4.5)
Software de análisis de migración (Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/Úselo para cuantificar la velocidad y la persistencia de la celda (paso 5.4)

Referencias

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