Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.
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Artículo de método
Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Preparación de la matriz extracelular acelular es útiles para estudiar las interacciones célula-matriz y facilitar las aplicaciones de la terapia celular regenerativa. Varios productos comerciales matriz extracelular están disponibles como hidrogeles o membranas, pero estas no poseen actividad biológica específica de tejido. Porque descelularización de perfusión no es generalmente posible con tejido cardíaco humano, desarrollamos un proceso de descelularización de inmersión de 3 pasos. Rebanadas miocardio humanos adquiridos durante la cirugía se tratan primero con tampón de lisis hiperosmolar libre de detergente, seguido por la incubación con lo iónicos detergente, dodecil sulfato de sodio, y el proceso se completa mediante la explotación de la actividad de la ADNasa intrínseca de suero bovino fetal. Esta técnica resulta en hojas sin células de la matriz extracelular cardiaca con conserva en gran parte tejido fibroso arquitectura y Biopolímeros composición, que fueron demostradas para proporcionar señales ambientales específicos a poblaciones de la célula cardiaca y vástago de pluripotent células. Hojas de matriz extracelular cardiaca pueden entonces más procesadas en un polvo de micropartículas sin mayor modificación química, o, mediante digestión de pepsina a corto plazo, en un hidrogel uno mismo-montaje de la matriz extracelular cardiaca con conserva bioactividad.
Introducción
La matriz extracelular (ECM) proporciona no sólo estructural de apoyo pero también es importante para la célula biológica y función de tejidos1. En el corazón, el ECM participa en la regulación de las respuestas fisiopatológicas tales como fibrosis, inflamación, angiogénesis, función contráctil del cardiomiocito y viabilidad y destino de la célula del progenitor residente. Además de sus principales componentes fibrosos glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos - contiene una serie de vesículas membranosas que contienen ácidos nucleicos y proteínas2,3, secretadas factores de c....
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Protocolo
El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética y Junta de revisión institucional de la Charité Medical University. Todos los pacientes siempre por escrito, consentimiento informado para el uso de tejido cardíaco para estudios experimentales.
1. preparación del miocardio humano para seccionamiento
- Obtener el miocardio ventricular izquierdo (el tamaño varía dependiendo del tipo de cirugía) directamente desde la sala de operaciones y transporte en PBS frío en un recipiente estéril.
- Eliminar todo el tejido graso con un bisturí estéril co....
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Resultados
El protocolo de 3 pasos de descelularización de miocardio humano presentamos resultados en la eliminación casi total de material celular, conservando los componentes clave del ECM y la estructura fibrilar del ECM. Después de descelularización, la extracción bruta de las células de los tejidos es evidente por el cambio de color (figura 1A). El análisis histológico con manchas de H & E y TRICROMICA de Masson reveló la ausencia completa de células intactas r.......
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Discusión
Al preparar el ECM miocardio humano, el objetivo es lograr lo siguiente: retiro de material celular inmunógenos relevante, preservación de la integridad de la ECM y bioactividad, esterilidad, no toxicidad del producto final, compatibilidad de procesos GMP, y idoneidad del producto para una aplicación determinada en términos de manejo. Combinando nuestro protocolo de descelularización de 3 pasos con tratamiento posterior en micropartículas o uno mismo-montaje de hidrogel, material humano de ECM cardiaca se obtiene que pos.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki. Pacientes siempre el consentimiento informado para el uso del tejido para fines de investigación, y el proceso de recogida de tejido fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética de Charité - Universitätsmedizin Berlín (EA4/028/12).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Balanza | DR Precisa, Dietikon, Suiza | Cuchillas Precisa XR 205SM | |
| Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Alemania | SK-10-004 | |
| Placas de cultivo celular (6 pocillos) | Greiner, Frickenhausen, Alemania | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Alemania | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | 8043.3 | |
| Tubos de reacción Eppendorf (1,5 o 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Alemania | 616201, 623201 | |
| Falcon 15 ml, 50 ml | Greiner, Frickenhausen, Alemania | 188271, 227270 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Biochrome, Berlín, Alemania | S 0115 | |
| Sistema de liofilización | Labconco, Kansas City, EE. UU | 7670520 | |
| Congelador (-80 ° C; C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | 281.1 | |
| Cuchillas de micrótomo tipo 819 | Leica, Wetzlar, Alemania | 14035838925 | |
| Homogeneizador de minilys | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemania | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | K021.1 | |
| Nistatina | PAN Biotech, Aidenbach, Alemania | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | 14190-094 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1,4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Alemania | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Agitador de placas | Heidolph, Schwabach, Alemania | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | CN30.3 | |
| Microscopio estereoscópico | Leica, Wetzlar, Alemania | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µ m | Merck Millipore, Darmstadt, Alemania | SCGP00525 | |
| Stuart mezcladores analógicos de balancín y rodillos | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Würzburg, Alemania | TTEK | |
| Set de transfusión 200µ m | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, estándar, 125 mm | Aspectos médicos destacados, Rohrdorf, Alemania | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, Nueva York, EE. UU | SI-0256 |
Referencias
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse En....
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