Artículo de método

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

DOI:

10.3791/56419

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4 de diciembre de 2017

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1Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), 4Deutsches Herzzentrum Berlin (DHZB), 5Department of Cardiovascular Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.

Resumen

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Preparación de la matriz extracelular acelular es útiles para estudiar las interacciones célula-matriz y facilitar las aplicaciones de la terapia celular regenerativa. Varios productos comerciales matriz extracelular están disponibles como hidrogeles o membranas, pero estas no poseen actividad biológica específica de tejido. Porque descelularización de perfusión no es generalmente posible con tejido cardíaco humano, desarrollamos un proceso de descelularización de inmersión de 3 pasos. Rebanadas miocardio humanos adquiridos durante la cirugía se tratan primero con tampón de lisis hiperosmolar libre de detergente, seguido por la incubación con lo iónicos detergente, dodecil sulfato de sodio, y el proceso se completa mediante la explotación de la actividad de la ADNasa intrínseca de suero bovino fetal. Esta técnica resulta en hojas sin células de la matriz extracelular cardiaca con conserva en gran parte tejido fibroso arquitectura y Biopolímeros composición, que fueron demostradas para proporcionar señales ambientales específicos a poblaciones de la célula cardiaca y vástago de pluripotent células. Hojas de matriz extracelular cardiaca pueden entonces más procesadas en un polvo de micropartículas sin mayor modificación química, o, mediante digestión de pepsina a corto plazo, en un hidrogel uno mismo-montaje de la matriz extracelular cardiaca con conserva bioactividad.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La matriz extracelular (ECM) proporciona no sólo estructural de apoyo pero también es importante para la célula biológica y función de tejidos1. En el corazón, el ECM participa en la regulación de las respuestas fisiopatológicas tales como fibrosis, inflamación, angiogénesis, función contráctil del cardiomiocito y viabilidad y destino de la célula del progenitor residente. Además de sus principales componentes fibrosos glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos - contiene una serie de vesículas membranosas que contienen ácidos nucleicos y proteínas2,3, secretadas factores de crecimiento y citoquinas.

Recientemente ha quedado claro que preparados acelulares de ECM no sólo son inestimables para el estudio de las interacciones célula-matriz, sino también para posibles aplicaciones terapéuticas basadas en células. Ahora es ampliamente reconocida la importancia de proporcionar un entorno adecuado para productos celulares terapéuticos o ingeniería de tejidos. Ha habido intentos para combinar suspensiones celulares o compuestos activos con hidrogeles biopolímeros definido4,5,6 o con cócteles de proteína secretadas por las células del sarcoma murino (es decir, Matrigel, Geltrex) 7. sin embargo, los primeros son limitadas bioactividad, estos últimos son problemáticos en los procesos de calidad GMP y ambos carecen de la bioactividad específica de tejido cardiaco ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Descelularización del miocardio se ha realizado previamente por la perfusión del corazón entero a través de la vasculatura coronaria14,15. Mientras que esto es posible en animales corazones, corazones humanos intactos están raramente disponibles. Por lo tanto, fue favorecido un proceso de inmersión que permite la manipulación de las muestras de tejido obtenidas en la sala de operaciones. Nuestro protocolo "3 pasos" contiene 3 separado incubación pasos a saber: lisis, solubilización y extracción de ADN. Produce la ECM miocardio humana con en gran parte conservadas proteínas y glicosaminoglicanos composición16,17. Estas rebanadas cECM permiten estudios en vitro de las interacciones célula-matriz pero están mal adaptados para posibles aplicaciones terapéuticas de la escala humana. El proceso de fabricación se amplió entonces para producir micropartículas cECM liofilizado o un hidrogel cECM del18.

Este protocolo permite la descelularización de miocardio humano Obtenido de muestras quirúrgicas, preservación de los componentes principales de la matriz extracelular miocárdica (ECM) y su actividad biológica. Este protocolo se recomienda cuando ECM cardiaca humana con bioactividad específica de tejido conservada se requiere para estudios experimentales de las interacciones célula-matriz, o cuando se necesita un ambiente adecuado para regeneración miocárdica celular enfoques. En principio, también es posible adaptar este protocolo a las condiciones GMP-grado, para que el uso del cECM procesado debería ser factibles aplicaciones terapéuticas en el futuro.

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Protocolo

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El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética y Junta de revisión institucional de la Charité Medical University. Todos los pacientes siempre por escrito, consentimiento informado para el uso de tejido cardíaco para estudios experimentales.

1. preparación del miocardio humano para seccionamiento

  1. Obtener el miocardio ventricular izquierdo (el tamaño varía dependiendo del tipo de cirugía) directamente desde la sala de operaciones y transporte en PBS frío en un recipiente estéril.
  2. Eliminar todo el tejido graso con un bisturí estéril con cuchilla Nº 10 bajo condiciones estériles.
  3. Corte del miocardio en cubos de aproximadamente 1 x 1 x 1 cm con un bisturí.
  4. Coloque los cubos en tubos estériles de 50 mL.
    Nota: Para hacer una pausa, ejecutar el paso 1.5, de lo contrario continúe con el paso 2.2. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida para evitar la degradación de las proteínas y una disminución en la calidad del tejido.
  5. Almacenar los tubos que contienen los cubos a-80 ° C. Los tejidos pueden guardarse por varios meses.

2. secciones de los cubos de miocardio en rodajas

  1. Tome los tubos que contienen los cubos preparados fuera del congelador.
  2. Transporte en hielo al criostato.
  3. Ajustar la temperatura del objeto y la cámara de-15 ° C.
    Nota: La temperatura adecuada es crucial para garantizar el seccionamiento perfecto.
  4. Tubos de vacío frío 50 mL y sellos en la cámara o en hielo seco.
  5. Añadir una capa (aproximadamente 0.5 - 1.0 mL) de criosección medio sobre el sello frío y deje que congele hasta que esté blanca y sólida.
  6. Añadir una segunda capa de criosección mediano y coloque un cubo de miocardio en esta capa.
  7. Asegúrese de que el medio de criosección y miocardio se congelan completamente antes de continuar.
    Nota: Cuando el medio muestra y criosección no se congelan el seccionamiento se deteriorará. Medio de criosección completamente congelado da vuelta de fluida y transparente sólido, blanco y no transparente. Los cubos miocardio necesitan por lo menos 30 min hasta 1 h para congelar completamente si continuar inmediatamente en el paso 1.4. Cuando se congela el tejido no debe deformarse cuando tocó/manipulado con pinzas.
  8. Insertar sello con miocardio congelado en el soporte y apriete todos los tornillos.
  9. Recorte la superficie del tejido hasta obtener una superficie incluso seccionamiento.
  10. Sistema de seccionamiento a 300 μm de espesor.
  11. Sección del miocardio congelado con el seccionamiento automático. Esto garantiza que las secciones de corte uniforme. Pueden rebanar aproximadamente 30-40 secciones de un cubo.
  12. Coloque cada rebanada después de seccionar libremente en un tubo de 50 mL preenfriada.
    Nota: No presione el rodajas o el paquete firmemente. Aproximadamente 40 rebanadas pueden caber en un tubo.
  13. Cierre los tubos de llenado y coloque en hielo.
    Nota: Para poner en pausa ir con paso 2.14, de lo contrario continúe con el paso 3.2.
  14. Segmentos de miocardio tienda a-80 ° C. Las rebanadas se pueden almacenar durante varios meses.

3. descelularización de miocardio humano rebanadas

  1. Tomar el número necesario de tubos de 50 mL que contiene secciones de miocardio en el congelador de-80 ° C y el transporte en hielo.
  2. Transferencia de las secciones congeladas de todos los tubos de 50 mL del paso 3.1 en un vaso estéril. Aproximadamente 40 rebanadas se agregan en el vaso por el tubo de 50 mL. El vaso debe ser tres veces el volumen de los tubos de 50 mL; por ejemplo, de descelularización de un tubo de 50 mL, utilizar un vaso de precipitados de 150 mL.
  3. Añadir 50 mL de solución de lisis (10 mM de Tris, 0.1% peso/volumen de EDTA, pH 7,4 en H2O) por el tubo de 50 mL con divisiones de miocardio.
  4. Sacuda las rebanadas del miocardio en un vaso estéril de 100-150 RPM continuamente por 2 h a temperatura ambiente.
  5. Colar el líquido con las rebanadas de tejido a través de un colador grueso. Transferir los trozos de tejido con una pinza Roma a un vaso de precipitados estéril nuevo. Añadir 50 mL de SDS 0,5% en PBS por el tubo de 50 mL iniciales de rebanadas del miocardio (p. ej., 100 mL SDS solución cuando son ser decellularized dos tubos de 50 mL de secciones miocardio).
  6. Agitar continuamente durante 6 h a 100-150 rpm a temperatura ambiente.
  7. Colar el líquido con las rebanadas de tejido a través de un colador grueso. Transferir los trozos de tejido con una pinza Roma un nuevo vaso de precipitados estéril y lavar 3 veces con 50 mL de PBS durante 10 minutos agitando a 150 rpm. A continuación, Lave toda la noche en PBS con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% nistatina (PBS-P/S-N) a 100-150 rpm y 4 º C agitando.
    Nota: Lavar bien es crucial para eliminar por completo cualquier SDS residual. Resto de SDS es tóxico cuando el ECM se utiliza en combinación con las células.
  8. Eliminar la solución de lavado y añadir 25 mL precalentado FBS (37 ° C) y 1% de penicilina/estreptomicina 1% nistatina a las rodajas de decellularized por el tubo de 50 mL iniciales de rebanadas de miocardio.
  9. Incubar durante 3 h a 37 ° C. En este paso, se elimina cualquier ADN restante de la matriz debido a la intrínseca actividad DNasa de la FBS.
  10. Transferir las rebanadas en un nuevo vaso estéril y lavar 3 veces con 50 mL de PBS durante 10 minutos agitando a 150 rpm.
    Nota: Las rodajas de ECM pueden guardarse en PBS-P/S-N a 4 ° C por varios días. Sin embargo, se recomienda proceder inmediatamente.

4. procesamiento del cECM Decellularized a un polvo

  1. Coloque las rebanadas de ECM libremente en una placa de 6 pozos estéril nuevo. Congelar el ECM a-80 ° C y liofilizar durante 2 días en un liofilizador.
    Nota: se puede colocar más de una rebanada por pozo. Arregle las rebanadas para cubrir totalmente la superficie del pozo. Superposición de las rebanadas no afecta el éxito de la posterior pulverización.
  2. Para la pulverización de la rebanada de ECM, fresado específicos uso tubos (véase Tabla de materiales) que contienen granos de 1,4 mm de cerámica. Llene los tubos libremente con ECM liofilizado con estériles pinzas embotadas. Para obtener resultados óptimos, se recomienda un peso total de ECM entre 10-20 mg.
    Nota: Si el ECM está lleno apretadamente en los tubos de fresado el proceso de pulverización se verán negativamente afectado.
  3. Rápido-congele los tubos en nitrógeno líquido.
    PRECAUCIÓN: nitrógeno líquido es extremadamente baja temperatura, utilice protección personal adecuada.
  4. Inserte los tubos congelados en la máquina de moler y pulverizar el ECM.
    1. Establecer una duración de 30 s y un máximo de la velocidad e iniciar el dispositivo.
    2. Después de terminar, saque los tubos y snap-congelar de nuevo en nitrógeno líquido.
    3. Repita cinco veces.
  5. Lave las micropartículas de los tubos mediante la adición de 1 mL ddH2O por el tubo y agitar o vórtice de solubilización completa. Filtrar la solución heterogénea a través de una malla de 200 μm en un tubo de 50 mL.
  6. Congelar el tubo de nitrógeno-80 ° C o líquido.
  7. Vuelva a colocar la tapa estándar del tubo con un filtro de 0,22 μm. Esta tapa de filtro evita que el polvo fluya fuera del tubo pero permite circulación de aire para la evaporación del agua.
  8. Insertar los tubos en el liofilizador y liofilizar otra vez para quitar el agua del paso (paso 4.5)
    Nota: Liofilización en este paso puede tardar hasta 3 días.
  9. Almacenar el polvo a-80 ° C hasta el procesamiento posterior o continúe con el paso 5.1.

5. enzima basado homogeneización del cECM Micro-partículas

  1. Disolver la pepsina porcina en 0.01 M HCl (pH 2.0) a una concentración de 1 mg/mL. Colocar en un agitador rotatorio a temperatura ambiente hasta que esté completamente disuelta.
  2. Disolver el polvo liofilizado de ECM humano (paso 4.8) en la solución de pepsina a una concentración final de 10 mg/mL. Mezclar bien mediante pipeteo. El volumen total depende de la cantidad de solución de ECM que necesita. Por ejemplo, disolver 10 mg de polvo de ECM en 1 mL de solución de pepsina.
    Nota: Disolución de las partículas puede apoyar a través de Vortex suave (1.000-1.500 RPM). Quedan grumos de micropartículas afectará negativamente la digestión.
  3. Transferir la solución a tubos de 2 mL con un volumen de 1 mL por tubo.
  4. Colocar los tubos en un agitador de tubos por 48 h a 27 ° C y 1.200 rpm.
  5. Sacar los tubos de la coctelera y coloque en hielo o en un soporte de tubo previamente enfriado.
  6. Mezcla 1/9 del volumen de la solución ECM de frío 10 x PBS (pH 7.4) con 1/10 del volumen de la solución ECM de frío 0,1 M NaOH en un lugar en el hielo y el tubo preenfriada. Esta mezcla se neutraliza la solución ECM digerida e inactivar irreversiblemente la pepsina.
  7. Añadir la solución de ECM a la neutralización mezcla y mezcla bien mediante pipeteo o vórtex.
  8. Establezca el ECM en la concentración deseada de 1 x PBS (pH 7.4). El pH de la solución puede comprobarse con papel pH.
    Nota: Ejemplo de cálculo para 10 mL había digerida solución ECM:
    Añadir 10 mg de pepsina porcina a 10 mL de HCl (pH 2.0).
    Añadir 100 mg ECM de polvo para solución de pepsina.
    Nota: Ejemplo de cálculo para neutralizar 10 mL había digerida solución ECM y ajustar la concentración a 8 mg/mL:
    VolFinal = cstart x Volstart / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
    Vol10xPBS = VolInicio / 9 = 1/9 de 10 mL = 1,11 mL 10 x PBS
    Vol deNaOH = VolInicio / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL
    Vol1xPBS = Vol VolFinal - Volstart -10xPBS - Vol deNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL

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Resultados

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El protocolo de 3 pasos de descelularización de miocardio humano presentamos resultados en la eliminación casi total de material celular, conservando los componentes clave del ECM y la estructura fibrilar del ECM. Después de descelularización, la extracción bruta de las células de los tejidos es evidente por el cambio de color (figura 1A). El análisis histológico con manchas de H & E y TRICROMICA de Masson reveló la ausencia completa de células intactas r...

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Discusión

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Al preparar el ECM miocardio humano, el objetivo es lograr lo siguiente: retiro de material celular inmunógenos relevante, preservación de la integridad de la ECM y bioactividad, esterilidad, no toxicidad del producto final, compatibilidad de procesos GMP, y idoneidad del producto para una aplicación determinada en términos de manejo. Combinando nuestro protocolo de descelularización de 3 pasos con tratamiento posterior en micropartículas o uno mismo-montaje de hidrogel, material humano de ECM cardiaca se obtiene que pos...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki. Pacientes siempre el consentimiento informado para el uso del tejido para fines de investigación, y el proceso de recogida de tejido fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética de Charité - Universitätsmedizin Berlín (EA4/028/12).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BalanzaDR Precisa, Dietikon, SuizaCuchillas Precisa XR 205SM
Nr.10 Skalpell Nr.3InstrumenteNRW, Erftstadt, AlemaniaSK-10-004
Placas de cultivo celular (6 pocillos)Greiner, Frickenhausen, Alemania657160
Cryostat CMLeica, Wetzlar, Alemania3050S
EDTACarl Roth, Karlsruhe, Alemania8043.3
Tubos de reacción Eppendorf (1,5 o 2 ml)Greiner, Frickenhausen, Alemania616201, 623201
Falcon 15 ml, 50 mlGreiner, Frickenhausen, Alemania188271, 227270
Suero fetal bovino (FBS)Biochrome, Berlín, AlemaniaS 0115
Sistema de liofilizaciónLabconco, Kansas City, EE. UU7670520
Congelador (-80 ° C; C)Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UUForma 900 Series
HClCarl Roth, Karlsruhe, Alemania281.1
Cuchillas de micrótomo tipo 819Leica, Wetzlar, Alemania14035838925
Homogeneizador de minilysPEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemania91-PCSM
NaOHCarl Roth, Karlsruhe, AlemaniaK021.1
NistatinaPAN Biotech, Aidenbach, AlemaniaP06-07800
PBSThermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.14190-094
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies, Darmstadt, Alemania15140122
PepsinSigma-Aldrich, Taufkirchen, AlemaniaP6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1,4 mmPeqlab Biotechnolgie, Erlangen, Alemania91-PCS-CK14
Rotamax 120 Agitador de placasHeidolph, Schwabach, Alemania544-41200-00
SDSCarl Roth, Karlsruhe, AlemaniaCN30.3
Microscopio estereoscópicoLeica, Wetzlar, AlemaniaM125
Steriflip-GP, 0,22 µ mMerck Millipore, Darmstadt, AlemaniaSCGP00525
Stuart mezcladores analógicos de balancín y rodillosSigma-Aldrich, Taufkirchen, AlemaniaZ675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compoundHartenstein, Würzburg, AlemaniaTTEK
Set de transfusión 200µ mSarstedt, Nü mbrecht, Alemania798.200.500
TRISCarl Roth, Karlsruhe, Alemania5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, estándar, 125 mmAspectos médicos destacados, Rohrdorf, AlemaniaCV102-003
Vortex-Genie2Scientific Industry, Nueva York, EE. UUSI-0256
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Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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