Una población altamente pura de megacariocitos puede obtenerse de cable derivadas de sangre CD34+ las células. Un método para CD34+ aislamiento y del megakaryocyte diferenciación se describe aquí.
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Artículo de método
Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células
En este artículo
Resumen
Resumen
Producción de plaquetas se produce principalmente en la médula ósea en un proceso denominado Trombopoyesis. En la Trombopoyesis, células progenitoras hematopoyéticas distinguen a precursores de plaquetas de forma llamados megacariocitos, que terminal para liberar las plaquetas de procesos citoplásmicos largo denominados proplatelets. Megacariocitos son las células raras que limitan a la médula ósea y por lo tanto son difíciles de cosechar en número suficiente para uso en laboratorio. Producción eficiente de megakaryocytes humanos puede ser alcanzado en vitro por cultivo CD34+ de las células bajo condiciones convenientes. El protocolo detallado aquí describe el aislamiento de CD34 de las células+ por célula magnética clasificación de muestras de sangre de cordón umbilical. Se describen los pasos necesarios para producir los megakaryocytes altamente puros y maduros en condiciones libres de suero. También se proporcionan detalles de análisis fenotípico de la diferenciación de megacariocitos y determinación de la producción proplatelet de formación y de la plaqueta. Determinantes que influyen en la diferenciación de megacariocitos o formación de proplatelet, tales como anticuerpos antiplaquetarios o miméticos de la trombopoyetina, se pueden agregar a las células cultivadas para examinar la función biológica.
Introducción
Aislamiento de suficiente número de megacariocitos primarias humanas (MK) para uso en laboratorio regular no es factible debido a su baja frecuencia en la médula ósea, donde representan el ~0.01% de las células nucleadas1. Una alternativa conveniente es la expansión ex vivo y diferenciación de vástago de hematopoietic y células progenitoras en la presencia de factores de crecimiento específicos. Un número de citoquinas como factor de la célula de vástago (SCF; ligando c-kit) y el interleukin (IL) -3 y IL-11 ha sido empleadas en sistemas de cultivo para producir MKs. Thrombopoietin (TPO) es el factor más eficaz de crecimiento y la difer....
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por el Sur Oriental Sydney humano investigación Comité de ética y ratificado por el Comité de ética de investigación humana de la Universidad de New South Wales. Sangre del cordón umbilical obtenida de donantes sanos fue proporcionada por el Sydney cable de banco de sangre (Sydney, NSW, Australia). Se utilizaron volúmenes de 100 mL aproximadamente para este procedimiento.
Nota: Trabajo en un gabinete utilizando una técnica aséptica de bioseguridad clase II. Descontaminar el exterior de la bolsa de sangre de cordón con etanol al 70%. Utilizar instrumentos estériles (tijeras, pinzas) para este procedimiento.
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Resultados
Este protocolo permite la preparación de cultivos altamente puros de MK de cable derivadas de sangre CD34+ las células. El porcentaje de CD34+ las células de cordón de sangre es de aproximadamente 1,3%15 (figura 1A) y el número total de las gamas de células mononucleares (paso 1.8) de 90-300 x 106 por unidad UCB. La pureza de CD34 + / CD45 + células después de rangos aislamiento de 90 a 99% (
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Discusión
El protocolo descrito aquí es conveniente para la producción constante de MK y plaquetas en la cultura de la sangre del cordón umbilical. Estas células se pueden utilizar para estudiar varios procesos tales como el efecto de drogas o actividades biológicas sobre la proliferación de MK, diferenciación, formación proplatelet y producción de plaquetas.
Una variedad de medios de cultivo y combinaciones de citoquinas se han presentado en la literatura. Además de las citoquinas como el factor de cél.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen el apoyo de la salud australiano y el Consejo de investigación médica (proyecto grant 1012409 ligado a CSF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cultivo celular fuerte | |||
| recombinante TPO humano | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Medios sin suero para células CD34+ |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| aislamiento >strongCD34 | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapuro | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | Este kit incluye el reactivo bloqueante de IgG humana FcR y microperlas CD34. Estas perlas contienen el clon de anticuerpos anti-CD34 QBEND/10. Utilice un clon anti-CD34 diferente para comprobar la pureza (por ejemplo, el clon 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Medio de separación de linfocitos (densidad 1,077 g/mL) |
| Tampón de separación estéril (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | Este tampón contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2 que contiene 0,5% de albúmina sérica bovina y 2 mM de EDTA. Se puede preparar utilizando componentes estériles de grado de cultivo celular. Desgasifique antes de usar porque las burbujas de aire pueden bloquear la columna. |
| Name | Company | >Número de catálogo | Comments |
| Citometría de flujo y reactivos de tinción celular | |||
| PE Ratón anti-humano CD34 | BD Biosciences | 340669 Clon 8G12. Esto se puede utilizar para la verificación de pureza de CD34. Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10. | |
| Ratón PerCP anti-humano CD45 BD | Biosciences | 347464 | dilución 1:10 |
| Control de isotipo PerCP | BD Biosciences | 349044 | dilución 1:10 |
| FITC Ratón anti-humano CD41a | BD Biosciences | 340929 | Concentración final de anticuerpos dilución 1:5. |
| Ratón APC anti-humano CD42b | BD Biosciences | 551061 | Este anticuerpo también se puede utilizar para detectar MK maduras (el porcentaje de células positivas suele ser menor que con el anti CD42a). Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10. |
| Alexa Fluor 647 Ratón anti-humano CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Actualmente distribuido por Bio-Rad. Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Actualmente distribuido por Bio-Rad. Anticuerpo de control de isotipo |
| Anti factor de Willebrand policlonal de conejo | Abcam | AB6994 | dilución 1:200 |
| ratón V450 anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | dilución 1:20 |
| V450 control de isotipo | BD Biosciences | 580373 | dilución 1:20 |
| anticuerpo PAC1-FITC | BD Biosciences | 340507 | dilución 1:10 |
| Ratón anti CD62p monoclonal | Abcam | AB6632 | dilución 1:200 |
| Alexa Fluor 488 cabra anti conejo IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 |
| Alexa Fluor 594 cabra anti ratón IgG | Invitrogen | A11020 | dilución 1:100 |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Anticuerpo de control de isotipos |
| Yoduro de propidio | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Cuentas de conteo absolutas | Sondas moleculares, Invitrogen | C36950 | Cuentas de conteo |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| <>fuerte>Materiales | |||
| LS | columnasMiltenyi Biotec | 130-042-401 | También hay columnas más pequeñas y más grandes disponibles en el mercado |
| MidiMACS Imán separador | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL tubos de polipropileno FACS de fondo redondo, con tapón a presión, | tecnologías in vitro | 352063 | |
| portaobjetos de | vidrioMenzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Medios de montaje con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Medio de montaje antidecoloración con DAPI |
| strong>Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Equipment | |||
| Microscopio invertido Microscopio | Leica | DMIRB | |
| Microscopio fluorescente | Zeiss | Vert.A1 | |
| Analizador de células | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Centrífuga Cytospin | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catálogo Número | Comentarios |
| Software | |||
| Biosciences | FACS Diva Software | ||
| Software de análisis de células individuales | Tree Star | FlowJo | |
| Software de microscopio fluorescente | Zeiss | Zen 2 edición azul |
Referencias
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-m....
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Reimpresiones y permisos
