Stereotactically dirigido la ablación de la corteza auditiva de ratas y la localización de la lesión en el cerebro

Summary

Se describe un método para la ubicación stereotactically-dirigida, la exposición y la ablación de la corteza auditiva de ratas. La localización de la ablación se evaluó mediante post mortem de un mapa de coordenadas.

Abstract

La corteza auditiva de ratas (AC) se está convirtiendo en popular entre los investigadores de Neurociencia auditiva que están interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia y procesos perceptivos auditivos cortical control de procesamiento en los núcleos auditivos subcorticales de sonido. Para hacer frente a nuevos retos, un procedimiento para localizar con precisión y quirúrgico exponer la corteza auditiva agilizaría este esfuerzo de investigación. Neurocirugía estereotáxica se utiliza rutinariamente en la investigación preclínica en modelos animales al engraft una aguja o electrodo en un lugar previamente definido dentro de la corteza auditiva. En el siguiente protocolo, utilizamos métodos estereotácticos de una forma novedosa. Identificamos cuatro puntos de coordenadas sobre la superficie de la temporal bone de la rata para definir una ventana que, una vez abierto, expone con precisión tanto el principal (A1) y secundaria (Dorsal y Ventral) cortezas de la A.C. con este método, entonces realizamos una cirugía ablación de la CA. Después de realiza dicha manipulación, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Así, describimos un método para localizar fácilmente la autopsia de la ablación de la AC utilizando un mapa de coordenadas construido mediante la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a la superficie del cerebro. La combinación de la localización stereotactically dirigido y ablación de la CA con la localización de la zona lesionada en post mortem de un mapa de coordenadas facilita la validación de la información obtenida de los animales y conduce a un mejor análisis y comprensión de los datos.

Introduction

La rata es uno de los modelos animales más utilizados en Neurología auditiva. La robustez de su comportamiento, es capaz de trabajar a cientos de ensayos por día. Su sensibilidad y agudeza espectral audiencia^1,2, y la organización anatómica y funcional de su sistema central, comparable de otros mamíferos³, hacen la rata en un modelo animal adecuado para el análisis de una amplia gama de temas de investigación en Neurociencia auditiva. La corteza auditiva de ratas (AC), en particular, ha sido objeto de varios estudios anatómicos y fisiológicos que han tratado de comprender su estructura, organización y papel en el procesamiento de sonido³. Hoy en día, la AC se ha vuelto popular entre los neurólogos interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia, percepción auditiva, la base sináptica de la organización del campo receptivo y el control cortical del procesamiento del sonido en el subcortical auditivo ^5,4,6,7,de núcleos de^8,9. Para abordar los desafíos que plantean estos nuevos enfoques, procedimientos que se pueden localizar con precisión y exponer quirúrgicamente la CA acelerará los esfuerzos de investigación. Técnicas estereotácticas permiten localizar regiones específicas en el cerebro sin pruebas de Fisiología. Aunque el tamaño del cerebro varía ligeramente entre los animales, la ubicación de cualquier área del cerebro puede ser determinada utilizando coordenadas stereotactic conjunto de hitos en el cráneo del cerebro de rata.

La ablación restringida de la AC es la extirpación quirúrgica de la región sensorial de la corteza más directamente relacionada con la audiencia. En contraste con otros métodos utilizados para bloquear la actividad de AC, tales como refrigeración o local lidocaína inyecciones^10,11,12, la ablación quirúrgica de los resultados de AC en la pérdida crónica de la función. Así, ablaciones de AC son más adecuados para estudiar los efectos a largo plazo de privación cortical, así como los posteriores fenómenos de plasticidad de la lesión. La combinación de métodos estereotácticas con ablación quirúrgica de la CA se ha utilizado con éxito para estudiar los efectos fisiológicos, conductuales y moleculares de control cortical privación^{13,14,15 ,16,17,18,19}. Por ejemplo, un modelo de rata con ablaciones bilaterales de AC se ha utilizado para estudiar los efectos de la ablación cortical en el reflejo de sobresalto auditivo y auditivas del médula oblonga (ABR) de respuestas¹⁶. Recientemente, hemos comparado los efectos que unilateral versus bilaterales ablaciones de los productos de rata AC en los umbrales de la ABR, amplitudes y latencias en diferentes momentos después de la lesión¹⁸. Además, el modelo de la rata de ablación AC restrictiva también se ha utilizado para estudiar el efecto de la degeneración vía corticofugal en la inferior collicus^13,14,15 y el oído interno^{17 ,19}. Después de que tal manipulación se realiza en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Aunque muy útiles, la principal limitación de tonotópica mapas basados en las respuestas neuronales^20,21 son las técnicas electrofisiológicas necesarias para localizar los campos auditivos en el cerebro de la rata. Puesto que no todos los laboratorios tienen el equipo necesario o conocimientos para hacer tales grabaciones, se construyó un mapa de coordenadas basado en la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a una imagen de la superficie del cerebro¹⁸. Este mapa puede ser muy útil para localizar la CA sin pruebas de Fisiología.

El presente Protocolo describe un método para la ubicación stereotactically guiada, exposición quirúrgica y ablación de la CA en ratas. También describe cómo utilizar nuestro mapa coordenadas¹⁸ para fácilmente localizar la extensión de la lesión sobre una imagen de la superficie de los cerebros seccionados.

Protocol

este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con ambas normativa española (Real Decreto 53/2013 - Ley 32/2007) y las directrices de la Unión Europea (Directiva 2010/63/EU) en el cuidado y uso de animales en investigación biomédica.

1. Preparación de la rata

Nota: realizamos los experimentos en ratas machos para evitar los cambios hormonales.

1. El animal con una mezcla de clorhidrato de ketamina (30 mg/kg) y el clorhidrato de xilacina (5 mg/kg) inyectados por vía intramuscular, con esta dosis, la rata debe profundamente anestesiar para alrededor 1 h. de Anesthetize
Pizca de
2. la rata ' toe s; ausencia de un retiro reflejo indica que el animal es totalmente inconsciente. Si la rata responde a la pizca, dar anestesia suplementaria en un tercio de la dosis inicial.
3. Afeitado del cuero cabelludo y desinfectar el área quirúrgico con povidona-yodo.
4. Colocar el animal sobre una almohadilla de calefacción para mantener una temperatura de 38 ° C y estabilizar el animal ' cabeza en un marco estereotáctica usando dos barras de oreja y una barra de bocado. Tenga cuidado para evitar la perforación de la membrana del tímpano con las barras oído.
5. Proteger los ojos aplicando una gota de gel oftálmico o suero salino a cada ojo.

2. Ubicación de la CA en el hueso Temporal de la rata

1. con un bisturí, hacer una incisión a lo largo de la línea media para exponer el cráneo y retraiga el periostio que cubre la superficie del cráneo.
2. Utilizar una punta de algodón estéril para eliminar suavemente la sangre que cubre la superficie del cráneo para visualizar bregma, lambda y interaural 0 según el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro ²².
3. Hacer una incisión en el músculo temporal cerca de su inserción dorsal sobre el cráneo con un bisturí. Tirar el músculo utilizando una aguja y sutura material y fijar el material de sutura para el marco estereotáctico; Esto expondrá el hueso temporal. Si se presenta sangrado, lavar con solución salina estéril fría.
4. Colocar una aguja recta estéril en el micromanipulador stereotactic, asegurándose de que está plenamente asegurado.
5. Baje lentamente la aguja hasta que quede justo encima de la superficie del cráneo, por lo que la punta de la aguja se establece en 0 interaural. Definir este punto como cero y determinar las coordenadas de este punto.
6. Dependiendo del área cerebral de interés, varían las coordenadas stereotactic. Determinar las coordenadas utilizando el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro ²². Una vez determinadas las coordenadas, mueva la aguja para que coincida con esas coordenadas.
7. Blanco la CA utilizando las coordenadas de los siguientes cuatro puntos: A: A / P =-5,80 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +-8,67 mm. Baje la aguja hasta justo encima del hueso temporal para visualizar cada uno de estos cuatro puntos. Utilizando un rotulador, marca los puntos en el hueso temporal y conectarlos con el fin de dibujar un rectángulo; el rectángulo servirá como una guía para abrir de una ventana en el hueso ( figura 1).

3. Exposición quirúrgica de la CA

1. abrir la ventana utilizando un taladro eléctrico y una broca pequeña broca (0.6 mm Ø). Perfore el perímetro del rectángulo a 8.000 rpm hasta que el hueso da lejos. Enfriar la superficie de perforación por lavado con solución salina estéril frío para evitar daños a estructuras subcorticales. El hueso que da forma, puede detectarse una caída en la resistencia. Tenga cuidado de no perforar el cerebro.
2. Cuando las fronteras están flojas, tire hacia arriba del hueso de cubierta con pinzas finas y almacenarlo en solución salina estéril fría.

4. Ablación de la CA

1. utilizando un microscopio quirúrgico (10 X), con cuidado corte las meninges con una cuchilla microquirúrgica y eliminarlos usando dos pinzas de punta fina. Si se presenta sangrado, lavar con solución salina estéril fría.
2. Aspire suavemente la CA usando un dispositivo de succión quirúrgico (presión -0,24 bar) acoplado a una aguja estéril de punta Roma de 20 G. Este punto es fundamental y debe realizarse con mucho cuidado: aspirar sólo las seis capas corticales y no la materia blanca subyacente.
3. Aspirar hasta detener la hemorragia de las arterias perforantes.
4. Una vez terminada la aspiración, cubra el área lesionada con el hueso extraído y aplicar una gasa hemostática absorbible.
5. Dejar que el músculo temporal recupera su posición original y luego sutura la piel con herida clips (9 mm). Aplique un ungüento antibiótico (véase la Tabla de materiales). Seguir aplicar el ungüento sobre la herida dos veces al día durante tres días.
   Nota: Cada aplicación consiste en una capa delgada aplicada sobre la herida.
6. Buprenorfina de inyectar por vía subcutánea en la parte posterior de la rata (0,05 mg/kg) como un analgésico 1 h después de la cirugía y luego cada 8 h durante 72 h.
7. Mantener el animal en la almohada hasta que se despierta y volver a su jaula de alojamiento recuperar.
8. Casa animales individualmente para evitar que los compañeros de jaula tocando el área suturado y proporcionar algunos elementos de enriquecimiento. Cambiar el aserrín diariamente para prevenir infecciones y revise cuidadosamente que el animal se recupera correctamente y no muestra signos de malestar.

5. Colección de tejido

PRECAUCIÓN: al manipular el paraformaldehido (PFA), sólida y acuosa, usar equipo de protección personal (EPP) y utilizar un gabinete de seguridad.

Nota: preparar 750 mL de solución de formaldehído disolviendo 4% (w/v) PFA en 1 x solución de tampón fosfato (PBS) con calor (55 º C). Filtrar la solución de formaldehído con papel de filtro. Preparar el timbre ' s solución al disolver 8,5 g de NaCl, 0,25 g de KCl, 0.2 g NaHCO ₃ en 1.000 mL de agua (pH solución = 6.9).

1. Permite al animal sobrevivir como sea necesario para el estudio. Cuando se haya completado la investigación con la rata seccionada AC, terminal anestesiar por inyección intraperitoneal de 0,1 mL de pentobarbital sódico (60 mg/kg). Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la ausencia del reflejo de retirada.
2. Cuando el animal está anestesiado profundamente, realizar una perfusión intracardiaca ²³ de 125 mL de Ringer ' s solución seguido de 750 mL de solución de formaldehído mediante el uso de una aguja de calibre de 1,8 mm de diámetro interior.
3. Una vez terminada la perfusión, decapita a la rata en la primera vértebra cervical.
4. Tijeras de uso para quitar la piel y el músculo de la cabeza y exponer el cráneo. Utilice tijeras para cortar y abrir el foramen magnum y retire la parte posterior del cráneo.
5. Haga un transversal corte en el hueso orbital usando tijeras Spencer y usar gubias para cortar a lo largo de los bordes superiores del cráneo para exponer el cerebro. Tenga cuidado de no dañar el cerebro.
6. Una vez que el cerebro es expuesto, retire con cuidado la duramadre con unas pinzas de punta fina. Utilice un dedo suavemente saque bajo y elevar el cerebro. Levante el cerebro y corte la unt de nerviosIl es gratuito. Sumergir el cerebro en solución de formaldehído y almacenar a 4 ° C por 24 h.

6. Localización de las lesiones AC

1. después de la fijación posterior, coloque con cuidado el cerebro en una matriz de cerebro de rata sagital exponiendo la superficie lateral del cerebro.
2. Colocar una cámara arriba de 21 cm la superficie de la corteza mediante un soporte de cámara, seleccione la " disparo super macro " modo y tomar una fotografía de la superficie del cerebro.
3. Ponga el cerebro en una matriz de cerebro de rata coronal exponiendo la superficie dorsal del cerebro y tome otra foto.
4. Utilizando un programa editor de imagen, abra las imágenes y escala abajo de 50% para que sea más fácil trabajar con ellos. Identificar el bregma, lambda y referencias 0 interaural en la fotografía según Paxinos y Watson coordenadas ¹⁹ y marque su posición en las imágenes ( figura 2). Dibujar el contorno de la ablación en la imagen lateral del cerebro. Calcular el perímetro de.
5. Importación las coordenadas del mapa donde la primaria (A1) y las regiones secundarias (Dorsal y Ventral cortezas) de la CA son ubicada ¹⁸ en el archivo del programa editor donde se trabaja con las imágenes. Haga clic en el mapa y arrástrelo para superponerlo a la fotografía lateral del cerebro seccionado.
   1. Hacer el bregma y referencias de la lambda del mapa coordenado coinciden con el bregma y lambda referencias identificadas en la imagen del lateral cerebro.
   2. Usar el nebulizador nasal fisura como referencia para ajustar la imagen del cerebro para el mapa y hacer que coinciden ( figura 2B).
6. Calcular el porcentaje de la lesión en relación con el área ocupada por la A.C.

Results

Se realizan una ubicación stereotactically guiada, exposición quirúrgica y la ablación unilateral de la CA en tres ratas de Wistar. La localización de la lesión confirmó que ablaciones en las tres ratas usurpó las subdivisiones principales de la CA (cortezas primarias dorsales y ventrales) y abarca un rango de 80 a 100% de la superficie total de AC (figura 2B).

El protocolo aquí descrito para realizar ablaciones AC restrictivas se ha utilizado previamente en nuestro laboratorio para estudiar los efectos a largo plazo de la privación del control cortical en los núcleos auditivos subcorticales, así como los posteriores fenómenos de plasticidad. En estos estudios, se validó el protocolo de ablaciones AC aplicando fisiológica (ABR), comportamiento (respuestas de sobresalto, prepulso inhibición; PPI) y molecular (DNA microarrays, qPCR y Western Blot) métodos^{13,14,15,16,17,18,19}. Aquí, para demostrar la eficacia de nuestro protocolo, dejamos las tres ratas de AC por ablación sobrevivir durante una semana, y las cócleas durante la colección de tejidos recogidos paso a estudiar los cambios en la expresión de las subunidades AMPA más relevantes presentes en la cóclea adulta , GluA2 y GluA3, por qPCR. La comparación entre las transcripciones de AC ablación ratas y animales de control simulado donde se realizó todo el proceso de la cirugía pero no la ablación cortical mostraron una abajo-regulación de GluA2 y una para arriba-regulación de GluA3 en ambas cócleas (figura 3) , que está de acuerdo con nuestro anterior estudio¹⁹.

Figura 1: imágenes del rata del hueso temporal en tres pasos quirúrgicos diferentes. (A) transferencia de las coordenadas estereotáxicas de la CA en el hueso temporal. Las coordenadas de los cuatro puntos son: A: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +-8,67 mm. (B) las coordenadas se utilizan como referencia para dibujar un rectángulo en la superficie del hueso temporal que guiarán la apertura de una ventana. (C) muestra la ventana que se abre en el hueso después de la perforación. Las meninges con los vasos sanguíneos se observan en la superficie del cerebro. R: rostral, D: dorsal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: procedimiento para la localización de las lesiones en el cerebro de la rata. (A) fotografía de la superficie dorsal de un cerebro AC ablación con agujas stereotactically implantados en Lambda y Bregma (según coordenadas Paxinos y Watson,¹⁹). Las líneas punteadas marcan la posición de Bregma y Interaural 0 en la cuadrícula de 9 x 9 cm, así como en la superficie dorsal del cerebro. (B) fotografía de la superficie lateral del cerebro seccionado superpuesto al mapa de coordenadas de la CA. El perímetro de la lesión es marcado en rojo en la imagen. El perímetro de la zona de AC está marcado en negro en el mapa. En este ejemplo, el porcentaje de la ablación de AC con respecto al área total ocupado por el AC es 84.79%. AC: corteza auditiva, IA: inter aural, FR: fisura Nebulizador nasal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: cambios en los niveles de ARNm de las subunidades del receptor AMPA GluA2 y GluA3 después de la unilateral lesión tras ablaciones AC de 7 días. Resultados se presentan como la media ± desviación estándar del cambio doble. Cambios para GluA2 las transcripciones se representan en azul. En rojo se presentan cambios para las transcripciones de GluA3. Se observaron una disminución significativa en GluA2 y un aumento de GluA3 en ambas cócleas (ipsi - y contralateral a la ablación) en relación con controles del impostor con no ablaciones corticales en 7 días después de la cirugía; Esto está de acuerdo con nuestros anteriores resultados¹⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Una cirugía exitosa depende dos factores: mantener vivo al animal durante y después del procedimiento y localizar con precisión el área de interés. Asegurar que la rata es profundamente anestesiada durante la cirugía (prueba el reflejo de retirada) y recibe suficientes analgésicos y antibióticos no ototóxicos deben ayudar a la supervivencia. Además, la rata se debe mantener sobre una almohada hasta que despierta de la anestesia para evitar la hipotermia. Sutura se reduce la susceptibilidad a la infección, y la técnica adecuada es de vital importancia: animales elegirá a sus clips de herida, por lo que debería ser implantados lo suficientemente apretado para evitar la remoción sin poner demasiada tensión en la herida.

Para localizar con precisión el AC (o cualquier otra área cortical), es importante determinar la posición de bregma y lambda 0 interaural para utilizarlos como referencias para el cálculo de los límites de la región específica. Cualquier error en el cálculo de las coordenadas resultará en la ablación parcial de la CA o la aspiración no deseada de otras zonas aledañas. Así, la punta de la aguja debe solamente toque el hueso 0 interaural y luego traducir las coordenadas anteroposterior y mediolateral según lo que se describe en el presente Protocolo.

En este manuscrito, también hemos descrito cómo exponer quirúrgicamente y ablar de la CA. Hay tres pasos fundamentales: el proceso de perforación, la apertura y el retiro de las meninges y la ablación por aspiración. Perforación se debe realizar a una velocidad baja con la presión mínima, como una perforación de alta velocidad genera calor que puede afectar a cerca de las estructuras subcorticales. Sin embargo, mantener una velocidad baja y el área de perforación con solución salina estéril fría de refrigeración deben prevenir cualquier daño. Además, la presión mínima es esencial para evitar una rotura repentina del cráneo y lesiones posteriores a la corteza subyacente. La apertura y el retiro de las meninges que cubren el AC deben realizarse con cuidado para no romper los vasos sanguíneos. Si se presenta sangrado, es generalmente desfavorable el pronóstico temprano y tardío y es cuestionable si tal animal cumple los criterios de inclusión de un estudio confiable. Se recomienda la eutanasia en este caso. Por último, la aspiración (probablemente el aspecto más difícil en la realización de una efectiva lesión), debe limitarse a la materia gris. Hay dos indicadores que pueden ayudar a detectar la presencia de la sustancia blanca: (1) un cambio en el contraste de color, como la materia blanca es más brillante que la materia gris; y (2) el cese del sangrado de las arterias perforantes.

Después de cualquier manipulación realizada en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión del procedimiento en la corteza para el posterior análisis y validación de los datos obtenidos del animal. En este manuscrito, detallamos cómo localizar la ablación realizada en la corteza, utilizando un mapa de coordenadas descrito previamente por nuestro grupo¹⁸. Este mapa fue construido usando referencias anatómicas obtenidas de reconstrucciones de la sección serie de secciones histológicas, correlacionadas con el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro²². En consecuencia, el mapa distingue entre la primaria (A1) y cortezas secundarias (Dorsal y Ventral) de la CA. La principal ventaja de este mapa de coordenadas es que permite la rápida localización de la lesión mediante la superposición de una fotografía tomada desde la superficie lateral del cerebro en una matriz de cerebro sagital. Otra ventaja es que los laboratorios con menos experiencia en anatomía pueden utilizar el mapa adaptándolo a sus modelos animales. Sólo es necesario establecer las distancias entre bregma y lambda referencias 0 interaural en un cerebro de control perfundido y escala el mapa arriba o hacia abajo en consecuencia. Usar el nebulizador nasal fisura como referencia para ajustar la imagen del cerebro para el mapa. La profundidad de la ablación no puede determinarse en este mapa de coordenadas, por lo que debe ser determinado en las secciones histológicas del cerebro.

La combinación de métodos estereotácticas con la exposición quirúrgica de la CA son métodos básicos que podrían adaptarse fácilmente por cualquier investigador que desee a la CA en la rata. Esto puede ser para un experimento agudo o uno que requiere la implantación de dispositivos permanentes. Además, la ablación quirúrgica de la AC se ha previamente utilizada como modelo para estudiar los efectos de privación crónica cortical en audiencia. Ablaciones AC podrían utilizarse también para estudiar los efectos que ablaciones AC unilaterales ejercen en otras áreas corticales, o servir como un modelo de movimiento. Así, los diseños experimentales que se describen aquí son métodos útiles que se pueden aplicar individualmente o en combinación con una amplia gama de diseños experimentales.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Marco estereotáxico	David Kopf Ins.	900
Microscopio quirúrgico	WILD M650 Heerbrugg
Almohadilla térmica	DAGA
Micromotor dental	W& H elco	5118
Fresa de diamante	B Braun	GD021R	0,6 mm
Aspirador quirúrgico	Atmos	Atmoforte E2
Ketamina	Merial		30 mg/kg
Xilacina	Bayer		5 mg/kg
Micromanipulador	Narishige	SM-11
Bisturí	Lawton
Povidona yodada	Meda	Betadine
suero salino estéril	B.Braun
20G aguja estéril	Terumo Neolus Puntas
Material de sutura	B.Braun
Pomada antibiótica	Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough
Pinzas	dimeda	10.331.12
Agujas quirúrgicas	World Precision Instruments	501940
Buprenorphine	Indivior UK	Buprex	0.05 mg/kg
Tijera	dimeda	08.120.15
Tijera Spencer	dimeda	08.804.14
Rongeurs	Lawton
Bisturí microquirúrgico	MSP	7503
Gasa hemostática absorbible	Surgicel
Saggital rat Brain Matrix	Activational systems Inc.	RBM-1000DV / RBM 4000C
Pentobarbital sódico	Vetoquinol		60 mg/kg
Cámara	Olympus 5.1 MP	C-5060 lente zoom gran angular	F2.8-4.8
Pinzas enrolladas	Reflex 9		9 mm
Canvas 12	ACD Systems calibre
aguja			diámetro 1,8 mm
Embudo separador	labbox	11409	500 mL
cebador GluA2 Forward	GeneBank	NM_017261	CGGCAGCTCAGCTAAAAACT
Cebador GluA2 Selecto	GeneBank	NM_017261	TTGTAGCTGGGGCTGTGTGTGTGTGTGA
Cebador GluA3 Forward	GeneBank	NM_032990	ATTGCTGATGGTGCAATGAC
GluA3 GeneBank Inverso		NM_032990	TTTGCATTGTCGCAAGTCTC