Anticuerpos neutralizantes de la gripe se correlacionan con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización medir anticuerpos neutralizantes en sueros humanos y se utilizan a menudo para serología humana de influenza. Se describe un ensayo de microneutralización con células MDCK-SIAT1 para medir títulos de anticuerpos neutralizantes a contemporáneos 3C.2a 3C.3a a (H3N2) virus y después de la vacunación contra la influenza o infección.
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Artículo de método
Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1
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Resumen
Resumen
Anticuerpos neutralizantes contra la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe se consideran el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización (MN) se utilizan a menudo para medir respuestas de anticuerpos neutralizantes en sueros humanos después de la vacunación contra la influenza o infección. Células de riñón canino Madine Darby (MDCK) son el sustrato de células utilizadas para los ensayos de MN. Sin embargo, circula la influenza a (H3N2) 3C.2a y 3C.3a han adquirido el virus alterado especificidad de unión del receptor. La línea de células MDCK-SIAT1 con fracciones mayor α-2,6 galactosa siálicos en la superficie ha demostrado para proporcionar la mayor infectividad y repeticiones más fieles que las células MDCK convencionales para estos virus a (H3N2) contemporáneos. Aquí, describimos un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 que ha sido optimizado para cuantificar los títulos de anticuerpos neutralizantes a estos virus (H3N2) contemporáneos. En este protocolo, suero inactivado por calor que contiene anticuerpos neutralizantes es primero en serie diluido, luego se incubó con 100 TCID50/de virus de la influenza a (H3N2) para permitir que los anticuerpos en los sueros para enlazar a los virus. Células MDCK-SIAT1 se añade a la mezcla de anticuerpo del virus y se incuba durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir a (H3N2) virus infectar las células MDCK-SIAT1. Después de la incubación durante la noche, se fijan las placas y la cantidad de virus en cada bien es cuantificada por un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) utilizando anti-influenza A anticuerpos monoclonales de nucleoproteína (NP). Título de anticuerpos de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero más alta que proporciona ≥50% de inhibición de la infectividad del virus.
Introducción
Virus de la influenza siguen causan morbilidad y mortalidad en la población cada año. HA es la principal glicoproteína superficial del virus de la gripe. Anticuerpos neutralizantes contra HA son el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de la gripe infección1,2. Ensayos de hemoaglutinación inhibición (HI) y ensayos de MN son dos métodos ampliamente utilizados para medir las respuestas del anticuerpo en el suero humano después de la infección o la vacunación de la gripe3. El ensayo HI mide inhibición de anticuerpos de la hemoaglutinación virus de glóbulos ....
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Protocolo
Todos los virus de la gripe deben ser manejados según los requerimientos de nivel de bioseguridad apropiado (BSL-2 o superior) como se define en la bioseguridad en Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)12.
1. preparación de reactivos y Material de partida
-
Preparar las células MDCK-SIAT1 y medio de cultivo celular estéril
- Preparar el medio de cultivo de células MDCK-SIAT1 con 500 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) de glucosa alta, calor de 10% v/v inactivo 2 mM L-glutamina, suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1 m m, sulfato d....
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Resultados
Determinación de la infectividad de las cepas de virus es el primer paso en el ensayo de MN. La figura 2 ilustra el diseño de la placa para determinar el TCID50 de las cepas de virus. De las poblaciones de virus con infectividad desconocido, el virus puede titularse de múltiples diluciones previas, por ejemplo tanto 10-2 y 10-3, para capturar la mejor curva de valoración para calcular la capacidad infectiva del virus. La canti.......
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Discusión
El ensayo de MN es uno de los principales análisis utilizados para serología influenza para detectar respuestas de anticuerpos después de la infección por influenza o vacunación. Títulos generados a partir de ensayos de MN se utilizan a menudo como el resultado primario de muchos estudios de seroepidemiología de la influenza. Análisis de MN son también ampliamente utilizados para sero diagnóstico y la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna. Se han realizado estudios internacionales inter-laboratorio para comparar .......
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Divulgaciones
Los autores no divulgan ningún conflicto de interés. Los resultados y conclusiones en esta publicación son las de los autores y no representan necesariamente las opiniones de los centros para el Control y prevención y la Agencia de financiación.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu y Sra. Ashley Burroughs de la división de Influenza de los CDC para su revisión crítica y la asistencia en la preparación de este manuscrito. Agradecemos al Dr. Adrian Reber de la división de Influenza de los CDC para su asistencia en la preparación de los gráficos de la figura 3. Por último, agradecemos a Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemania para proporcionar las células MDCK-SIAT1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM) con alta glucosa Life | Science | 11965 | Un componente crítico de cultivo de células estériles, propagación de virus y medios diluyentes de virus |
| Suero fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción V, libre de protasa | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamina | Ciencias de la vida | 25030-081 | |
| Piruvato de sodio | Ciencias de la vida | 11360-070 | |
| Genética G-418 sal de disulfato | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Life Science | 15140-122 | |
| Acetona | VWR | 67-64-1 | Utilizado a una concentración del 80% |
| Tampón de fosfato-citrato con perborato de sodio | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-fenilendiamina Dihidrocloruro tableta | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V 1 tableta por 100 ml de agua de grado de cultivo celular | |
| Ácido sulfúrico | Fisher Scientific | A510-P500 | Usado Concentración final de 0,5 M |
| Etanol, desnaturalizado, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Utilizado a una concentración del 70% |
| Tripsina-EDTA | Ciencias de la Vida | ||
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP ratón monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-ratón IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| Placas de fondo plano de 96 pocillos | Thermo Scientific | 3455 | |
| Lector de placas | Dispositivo molecular | Spectromax 384 plus | |
| Matraz de cultivo celular 162 cm2/Vent Cap Corning | /VWR | 3151 |
Referencias
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....
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Reimpresiones y permisos
