Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Resumen

Migración celular es esencial para el desarrollo, mantenimiento de tejidos y reparación y tumorigenesis y está regulada por factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas. Este protocolo describe el ensayo de punto, un análisis de la migración de dos dimensiones, sin restricciones para evaluar el fenotipo migratorio de hojas adjunta, cohesivo de la célula en respuesta a señales microambiental.

Resumen

Aunque organismos complejos aparecen estáticos, sus tejidos están bajo una rotación continua. Como las células de edad, mueren y son reemplazados por nuevas células, las células se mueven dentro de los tejidos de una manera bien orquestada. Durante el desarrollo del tumor, este equilibrio es perturbado, y salir de las células del tumor del epitelio de origen, para invadir el microambiente local, viajar a sitios distantes y en última instancia formar tumores metastásicos en sitios distantes. El punto es un análisis simple, de dos dimensiones de la migración sin restricciones, para evaluar el movimiento neto de las hojas de la célula en una zona libre de células y para analizar parámetros de migración de la célula usando proyección de imagen de Time-lapse. Aquí, el análisis de punto se demuestra con un humano invasor, línea de células de cáncer de mama, MCF10CA1a, formadoras de pulmón para analizar migratorias ante las células factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se sabe para aumentar el potencial maligno de las células de cáncer de mama y para alterar el fenotipo migratorio de las células.

Introducción

Ensayos de migración son ampliamente utilizados para evaluar el potencial invasivo y metastásico de las células de tumor en vitro. Por lo general, la herida o rasguño de análisis se utilizan para evaluar la migración de hojas epiteliales en un celular autorizado zona^1,2,3. Para realizar el ensayo de rayado, las células se platean en una monocapa y se crea un "cero" o zona libre de células con una punta de pipeta. El ensayo de rayado es fácil de configurar con suministros de cultivo de tejidos comúnmente disponibles y puede ser realizado en placas de varios pocillos, ....

Protocolo

1. capa de platos (día 1)

Nota: Asegúrese de no dejar huellas dactilares o suciedad en la parte inferior de la placa al manejarla.

1. Descongelar el colágeno de ratón IV en el hielo y diluir con 50 mM HCl (pH 1.3) para preparar 3 mL de solución 10 μg/mL colágeno IV.
   Nota: Colágeno precipitará a 37 ° C. Por lo tanto es importante mantener la solución de colágeno a baja temperatura descongelamiento y trabajando con él. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida mediante la preparación de alícuotas de tamaños adecuado y almacenamiento a-80 ° C.
2. Añadir solución de colágeno IV de 250 μl a cada pocillo de las placas de fondo de cristal....

Resultados

El ensayo de punto presentado (figura 1) se realizó con invasor, Colonia de pulmón formando las células de cáncer de mama (MCF10CA1a) como modelo. El ensayo de punto cede puntos celular altamente reproducibles en manos de principiantes, lo que es un conveniente y fácil de ejecutar el ensayo (figura 1D). El ensayo de punto combinado con la coloración, o proyección de imagen de Time-lapse y partícula posterior imag.......

Discusión

En las células de la progresión del tumor migran fuera del tejido de origen, para invadir el tejido circundante y metastatizar a sitios distantes¹⁵. Migración de células de una colonia de células se observan en el análisis del punto. Aquí, el análisis de punto se ilustra mediante el análisis del fenotipo migratorio de las células de cáncer de mama humano en respuesta al EGF.

Para obtener resultados precisos y reproducibles en varios pasos en la configuración del punto e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células MCF10CA1a	Investigación Karmanos	/A	células utilizadas para el ensayo
de colágeno de ratón IV	BD Biosciences	354233	utilizadas para recubrir placas de
tripsina / EDTA	Thermo Fisher	25300054	utilizadas para eliminar células de placas de cultivo de tejidos
DPBS	Mediatech	21-031-CV	utilizado para lavar células
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	utilizado como medio de cultivo
suero de caballo	Thermo Fisher	26050088	utilizado para complementar el medio de cultivo
Placa inferior de vidrio de 12 pocillos	MatTek	P12G-1.5-14-F	utilizado para cultivar células para la obtención de imágenes
EGF (factor de crecimiento epidérmico, recombinante humano)	Peprotech	AF-100-15	utilizado para estimular las células
libre de ácidos grasos, BSA	Sigma	A8806-1G	utilizado para hacer tampón para EGF
hematoxilina	Sigma	, HHS32	utilizado para teñir colonias
eosina	Electrónica Microscopy Sciences	26051-10	utilizado para teñir colonias
37 ° C, 5% CO2 incubadora	Sanyo	modelo MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver con cámara de incubadora y platina motorizada	Zeiss	modelo Axio Observer.Z1	utilizado para imágenes de lapso de tiempo
Cámara ORCA Flash LT sCMOS	BioVision	C11440-42U-KIT	utilizado para imágenes de lapso de tiempo en combinación con Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software utilizado para la obtención de imágenes de lapso
de tiempo microscopio invertido	Olympus	modelo IX70	utilizado para contar células y verificar colonias en
caja de plástico	Lock& Cerradura	N/A	utilizada como cámara húmeda (se puede utilizar cualquier caja de plástico de cierre hermético que se ajuste a las placas)

Instituto de N, , , cultivo de tejidos