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Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

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DOI:

10.3791/56451

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5 de diciembre de 2017

1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Migración celular es esencial para el desarrollo, mantenimiento de tejidos y reparación y tumorigenesis y está regulada por factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas. Este protocolo describe el ensayo de punto, un análisis de la migración de dos dimensiones, sin restricciones para evaluar el fenotipo migratorio de hojas adjunta, cohesivo de la célula en respuesta a señales microambiental.

Resumen

Aunque organismos complejos aparecen estáticos, sus tejidos están bajo una rotación continua. Como las células de edad, mueren y son reemplazados por nuevas células, las células se mueven dentro de los tejidos de una manera bien orquestada. Durante el desarrollo del tumor, este equilibrio es perturbado, y salir de las células del tumor del epitelio de origen, para invadir el microambiente local, viajar a sitios distantes y en última instancia formar tumores metastásicos en sitios distantes. El punto es un análisis simple, de dos dimensiones de la migración sin restricciones, para evaluar el movimiento neto de las hojas de la célula en una zona libre de células y para analizar parámetros de migración de la célula usando proyección de imagen de Time-lapse. Aquí, el análisis de punto se demuestra con un humano invasor, línea de células de cáncer de mama, MCF10CA1a, formadoras de pulmón para analizar migratorias ante las células factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se sabe para aumentar el potencial maligno de las células de cáncer de mama y para alterar el fenotipo migratorio de las células.

Introducción

Ensayos de migración son ampliamente utilizados para evaluar el potencial invasivo y metastásico de las células de tumor en vitro. Por lo general, la herida o rasguño de análisis se utilizan para evaluar la migración de hojas epiteliales en un celular autorizado zona1,2,3. Para realizar el ensayo de rayado, las células se platean en una monocapa y se crea un "cero" o zona libre de células con una punta de pipeta. El ensayo de rayado es fácil de configurar con suministros de cultivo de tejidos comúnmente disponibles y puede ser realizado en placas de varios pocillos, permitiendo para el procesamiento de muestras múltiples. Sin embargo, mientras se hace la raya, las células se quitan físicamente de la monocapa y someterse a menudo a la muerte celular. Además, matriz extracelular, conectada a la placa a menudo se daña durante el proceso de raspado. Asimismo, el uso de silicona rellenos (tales como Ibidi cámaras4) o de plantillas de5,6,7 puede conducir a la interrupción mecánica de las células y la eliminación parcial de las proteínas de la matriz utilizada para el recubrimiento de la placas. Otra desventaja de ensayos de control de cierre de las heridas o rasguños es su curso de tiempo limitado, como la migración de la célula sólo puede ser analizada hasta que se cierre el cero.

Al realizar el ensayo de punto, las células se platean como Colonia circular en una placa cubierta o sin recubrimiento8. La razón fundamental de esta estrategia de la galjanoplastia es obtener hojas de células con bordes definidos, que pueden migrar o invadir en los alrededores libres de células sin molestar a la cultura por la eliminación de las células o partes movibles. El objetivo general de la prueba de dot es observar la migración de hojas de celular medida por el desplazamiento del borde o diámetro de Colonia, así como para realizar Time-lapse de imágenes para analizar el fenotipo migratorio de las células en mayor resolución espacio-temporal.

Migración de la célula puede verse afectada por una variedad de señales microambiental como quimiocinas, citoquinas y factores de crecimiento como el EGF. EGF es un factor de crecimiento que ejerce sus efectos biológicos por Unión a su receptor, del receptor de EGF9y aumenta el comportamiento invasivo y metastásico de tumor las células4,9,10. Aquí, el ensayo del punto se utiliza para el estudio de EGF estimula la migración de la célula en un humano invasor, pulmón formadoras mama cáncer célula línea (MCF10CA1a)8,11,12.

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Protocolo

1. capa de platos (día 1)

Nota: Asegúrese de no dejar huellas dactilares o suciedad en la parte inferior de la placa al manejarla.

  1. Descongelar el colágeno de ratón IV en el hielo y diluir con 50 mM HCl (pH 1.3) para preparar 3 mL de solución 10 μg/mL colágeno IV.
    Nota: Colágeno precipitará a 37 ° C. Por lo tanto es importante mantener la solución de colágeno a baja temperatura descongelamiento y trabajando con él. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida mediante la preparación de alícuotas de tamaños adecuado y almacenamiento a-80 ° C.
  2. Añadir solución de colágeno IV de 250 μl a cada pocillo de las placas de fondo de cristal 12-bien y colocarlos en una caja de plástico de tamaño adecuado, cierre firmemente. Coloque toalla de papel húmeda sobre y alrededor de las placas para la fabricación de una cámara húmeda y cerrar el cuadro. Incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente.
    Nota: Como sólo el área de crecimiento necesita ser cubierto, es suficiente para cubrir solamente la hoja de cubierta, que se une a la parte inferior de la placa, con la solución de colágeno (ver figura 1A, B para un esquema de la placa).
  3. A la mañana siguiente, enjuagar las placas con desionizada de H2O dos veces para quitar el tampón y colágeno no absorbido. Dirigir el agua hasta el borde de la placa de la pozo, no hasta el borde formado por la placa inferior y el cubreobjetos (si agua se pipetea en esta área que salpicará). Deje secar al aire los platos en la campana de flujo laminar. Utilizar las placas inmediatamente o guardar a 4 ° C durante 5 días.
    Nota: Diferentes líneas celulares pueden requerir diferentes capa, como la fibronectina o colágeno I.

2. galjanoplastia el ensayo de punto (día 2)

  1. Preparación de la suspensión de células
    1. Para preparar la suspensión celular, utilizar las células que se han cultivado en una placa de cultivo de tejido de 60 milímetros en medio DMEM/F12 suplementado con suero de caballo de 5% a 80% de confluencia
    2. Lavar las células con solución salina amortiguada de fosfatos de calcio y magnesio libres Dulbecco (DPBS) una vez, Añadir 500 μl de tripsina-EDTA (temperatura ambiente) e Incube las células 3-5 minutos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado.
    3. Suspender las células separadas 4,5 mL medio de cultivo para parar la actividad de tripsina y contar 20 alícuota μl de la suspensión de células en un hemocitómetro.
    4. Sedimenten las células restantes en un tubo cónico de 15 mL por centrifugación a 200 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo a 3 x 106 células/mL.
      Nota: Para otros sustratos de capa o líneas celulares, la densidad celular óptima debe establecerse en una serie de diluciones. 3 x 106 células/mL se recomienda como punto de partida.
  2. Las células de la galjanoplastia
    1. Lugar un descenso de 10 μl de la suspensión celular en el centro de cada tapa del colágeno IV 12-bien vidrio inferior Placa revestida sin tocar ni rayar el recubrimiento (figura 1A, B). Incube la placa durante 30 min a 37 ° C, atmósfera humidificada, para permitir que las células a conectar. Ver en un microscopio invertido que se unen las células.
      Nota: Esto puede ser ve mejor en el borde de la gota, donde puede observarse la formación de una monocapa (figura 1C). Si es necesario, Incube la placa hasta 3 h. Asegúrese de que la humedad en la incubadora es lo suficientemente alta como las gotas pueden secar rápidamente. Si se observa una reducción del volumen de gota durante este paso, añadir PBS a los espacios entre los pozos para aumentar la humedad.
    2. Lave suavemente los pocillos con 1 mL de medio de cultivo dos veces para eliminar las células no inscritos. Añadir 1 mL medio de cultivo a cada pocillo. Ver en un microscopio invertido que ningunas células flotantes mantienen, de lo contrario lavar los pozos otra vez. Incube las células durante la noche a 37 ° C, 5% CO2, atmósfera humidificada, para obtener hojas de celda bien definida.
      Nota: Celdas de flotación están probable que vuelva a acoplar a la placa y formar colonias de células no deseadas.

3. estimulando a las células (día 3)

  1. Compruebe todos los pozos utilizando un microscopio inverso para ese celular colonias han crecido adecuadamente. Si es necesario, marcar pozos inadecuados y no los utilice.
  2. Etiqueta de cada pocillo de la placa adecuada para cada condición de investigado. Ejecute cada condición en duplicado o triplicado.
  3. Cambiar el medio para matar de hambre las células en DMEM/F12 que contiene 0.1% de suero equino (medio muerto de hambre) 3 h antes de que las células son estimuladas.
  4. Estimular las células por adición de EGF (concentración final de 5 ng/mL) o por otros mediadores deseadas y mezcle suavemente el medio utilizando una micropipeta de 1 mL o agitando la placa.
  5. Incube la placa durante 1-4 días observar el desplazamiento de borde y contorno de borde tal como se describe en la sección 4.1 o realizar proyección de imagen de Time-lapse como se describe en la sección 4.2.

4. visualización de colonias de células y la migración celular

  1. Hematoxilina-eosina (HE) tinción para medir el crecimiento de la Colonia (día 4-7)
    1. Fijar las células en etanol al 70% (1 mL/pocillo) durante 2 minutos.
    2. Tinción con hematoxilina (1 mL/pocillo), min ~ 2 núcleos.
    3. Células de lavado con agua del grifo (1 mL/pocillo) hasta los núcleos son de color azules, 5-10 minutos.
    4. Citoplasma de tinción con eosina (1 mL/pocillo), ~ 2 min.
    5. Enjuague con agua desionizada (1 mL/pocillo).
      Nota: Soluciones de hematoxilina y eosina pueden ser recogidas y utilizadas varias veces hasta que la coloración se convierte en débil.
    6. Placa de secado al aire.
    7. Dé vuelta la placa y medir el diámetro del punto con una regla. Alternativamente, tomar fotos de la placa con una cámara y analizar el punto de diámetro en ImageJ.
  2. Time-lapse microscopia (día 3)
    1. Encienda el microscopio de la incubadora y ajustar la temperatura a 37 ° C. Llene el humidificador con dH2O. ajustar el CO2 al 5%. Asegúrese de que la cámara de la incubadora es humidificada y que la etapa motorizada puede moverse libremente. Cierre la cámara incubadora y permita que el microscopio a 37 ° C.
      Nota: El microscopio (véase la tabla de materiales) utilizado aquí se debe calentar a 37 ° C durante al menos 3 horas antes de que las células son imágenes para evitar la deriva de la atención.
    2. Coloque la placa en la etapa del microscopio incubadora y configurar la lista de la etapa. Imagen dos bordes opuestos y el centro de cada punto de la célula (figura 1A).
    3. Tomar imágenes cada 3 minutos, para 15-24 h con el objetivo de X 10. Descargar los datos y proceder a su análisis de la imagen en un programa de elección, por ejemplo, ImageJ o Matlab.

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Resultados

El ensayo de punto presentado (figura 1) se realizó con invasor, Colonia de pulmón formando las células de cáncer de mama (MCF10CA1a) como modelo. El ensayo de punto cede puntos celular altamente reproducibles en manos de principiantes, lo que es un conveniente y fácil de ejecutar el ensayo (figura 1D). El ensayo de punto combinado con la coloración, o proyección de imagen de Time-lapse y partícula posterior imag...

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Discusión

En las células de la progresión del tumor migran fuera del tejido de origen, para invadir el tejido circundante y metastatizar a sitios distantes15. Migración de células de una colonia de células se observan en el análisis del punto. Aquí, el análisis de punto se ilustra mediante el análisis del fenotipo migratorio de las células de cáncer de mama humano en respuesta al EGF.

Para obtener resultados precisos y reproducibles en varios pasos en la configuración del punto e...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

El autor desea agradecer Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo y Carole Parent para leer y comentar el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células MCF10CA1aInvestigación Karmanos/Acélulas utilizadas para el ensayo
de colágeno de ratón IVBD Biosciences354233utilizadas para recubrir placas de
tripsina / EDTAThermo Fisher25300054utilizadas para eliminar células de placas de cultivo de tejidos
DPBS Mediatech21-031-CVutilizado para lavar células
DMEM / F12Thermo Fisher11320082utilizado como medio de cultivo
suero de caballoThermo Fisher26050088utilizado para complementar el medio de cultivo
Placa inferior de vidrio de 12 pocillosMatTekP12G-1.5-14-Futilizado para cultivar células para la obtención de imágenes
EGF (factor de crecimiento epidérmico, recombinante humano)PeprotechAF-100-15utilizado para estimular las células
libre de ácidos grasos, BSASigmaA8806-1Gutilizado para hacer tampón para EGF
hematoxilinaSigma, HHS32utilizado para teñir colonias
eosinaElectrónica Microscopy Sciences26051-10utilizado para teñir colonias
37 ° C, 5% CO2 incubadoraSanyomodelo MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver con cámara de incubadora y platina motorizadaZeissmodelo Axio Observer.Z1utilizado para imágenes de lapso de tiempo
Cámara ORCA Flash LT sCMOSBioVisionC11440-42U-KITutilizado para imágenes de lapso de tiempo en combinación con Zeiss AxioObserver
MetamorphBioVisionMMACQMICsoftware utilizado para la obtención de imágenes de lapso
de tiempo microscopio invertidoOlympusmodelo IX70utilizado para contar células y verificar colonias en
caja de plásticoLock& CerraduraN/Autilizada como cámara húmeda (se puede utilizar cualquier caja de plástico de cierre hermético que se ajuste a las placas)
Instituto de N, , , cultivo de tejidos

Referencias

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