Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula

Summary

Este protocolo proporciona información acerca de reactivos, equipos y herramientas de análisis y medidas experimentales para los investigadores que están interesados en llevar a cabo análisis de hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos de todo el genoma variaciones número de copia de plantas.

Abstract

Mutantes son recursos genéticos inestimable para estudios de la función génica. Para generar colecciones mutantes, pueden utilizarse tres tipos de mutágenos, incluyendo biológicos como el T-ADN o transposon, químicas como Metanosulfonato de etilo (EMS) o físicos como la radiación de ionización. El tipo de mutación observada varía dependiendo el mutágeno utilizado. Para mutantes inducidos por la radiación de ionización, mutaciones incluyen la deleción, duplicación o cambio. Mientras que el T-DNA o la mutagénesis de transposon se limita a especies que son susceptibles de transformación, mutagénesis química o física puede aplicarse a una amplia gama de especies. Sin embargo, la caracterización de las mutaciones derivadas de mutagénesis química o física tradicionalmente se basa en un enfoque clonación basada en mapas, que es el trabajo intensivo y consume mucho tiempo. Aquí, mostramos que una plataforma de Hibridación Genómica Comparativa (aCGH, en inglés) en arreglos de discos de alta densidad del genoma puede ser aplicada para eficientemente detectar y caracterizar variaciones número de copia (CNVs) en mutantes derivados de mutagénesis de bombardeo (FNB) neutrón rápido en Medicago truncatula, una especie de leguminosa. Análisis de la secuencia de genoma muestra que hay más de 50.000 genes o genes modelos en M. truncatula. En el presente, inducida por la FNB mutantes de M. truncatula se derivan más de 150.000 líneas de M1, que representan recursos genéticos inestimable para estudios funcionales de los genes en el genoma. La plataforma de la aCGH, en inglés que se describe aquí es una eficaz herramienta para la caracterización de mutantes de FNB-inducida en M. truncatula.

Introduction

Leguminosas (Fabaceae) son la tercera familia de plantas con flores, con muchas especies económicamente importantes como la soja (Glycine max) y alfalfa (Medicago sativa). Las plantas leguminosas pueden interactuar con bacterias del suelo fijadoras de nitrógeno, generalmente llamado Rhizobium para desarrollar nódulos de la raíz en que dinitrogen atmosférico es reducido a amoníaco para uso por la planta huésped. Como tal, cultivos de leguminosas requiere pocas aportaciones de fertilizantes nitrogenados y así contribuyen a la agricultura sostenible. Cultivos de leguminosas producen hojas y las semillas con alto contenido de proteína, ....

Protocol

Nota: la figura 1 muestra los cinco pasos de la matriz, el protocolo CGH. Son: 1) preparación de materiales de planta; 2) aislamiento de muestras de ADN de alta calidad; Etiquetado 3) y purificación de muestras de ADN; 4) hibridación, lavado y barrido de arreglos de discos de todo el genoma; y 5) análisis de datos CGH. Arreglos de discos alicatado todo el genoma de M. truncatula contienen un total de 971.041 sondas de oligo único dirigido a más de 50.000 genes o modelos de gene en el genoma (véase tabla de materiales). Las únicas sondas están espaciadas aproximadamente cada 150 pares de bases (PB) en las region....

Results

La figura 2 muestra la distribución de los ratios de₂ registro normalizado de mutante versus peso señales a través de todo el genoma. Análisis de datos CGH reveló un aproximado 22 kb canceladura en el cromosoma 4 que abarca el entero SUNN gen³³ y varios otros anotados genes en mutante FN6191 (figura 2, figura 3). La región suprimida del candidato fue cubier.......

Discussion

Hemos desarrollado una plataforma CGH en arreglos de discos para la detección y caracterización de bombardeo del neutrón rápido (FNB)-inducida por mutantes de M. truncatula CV Jemalong A17. Para demostrar el uso de la matriz método CGH en la detección de mutaciones en el gen, se realizó análisis de aCGH del mutante FN6191, que exhibieron un fenotipo hiper-nodulación en contraste con las plantas de tipo silvestre, cuando se inoculó con S. meliloti Sm1021. Para el análisis de segmentación, un segmento se .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula matriz genómica, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutante)	Internamente	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (referencia)	Planta interna	A17
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Mini Kit	Qiagen	69104
Espectrofotómetro Nanodrop	Thermo Scientific	1000D
SureTag Kit de etiquetado de ADN	Agilent	5190-3400
Imprimación aleatoria	Agilent	5190-3399
Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	271004-1L
Termociclador	MJ research	PTC-200
Centrífuga	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Solución de estabilización y secado	Agilent	5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit de hibridación	Agilent	5188-5380
Correderas de junta de cámara de hibridación	Agilent	G2505
Human Cot-1 DNA	Agilent	5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Tampón de lavado 1 y 2	Agilent	5188-5221
Cámara de hibridación, inoxidable	Agilent	G2534A
Horno de hibridación	Agilent	G2545A
Columnas de purificación	Agilent	5190-3391
Escáner láser	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Mapa de señales de Nimblegen	5225035001
1.9	de Roche Nimblegen1.9