Method Article

Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula

DOI:

10.3791/56470

⸱

November 8th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo proporciona información acerca de reactivos, equipos y herramientas de análisis y medidas experimentales para los investigadores que están interesados en llevar a cabo análisis de hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos de todo el genoma variaciones número de copia de plantas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutantes son recursos genéticos inestimable para estudios de la función génica. Para generar colecciones mutantes, pueden utilizarse tres tipos de mutágenos, incluyendo biológicos como el T-ADN o transposon, químicas como Metanosulfonato de etilo (EMS) o físicos como la radiación de ionización. El tipo de mutación observada varía dependiendo el mutágeno utilizado. Para mutantes inducidos por la radiación de ionización, mutaciones incluyen la deleción, duplicación o cambio. Mientras que el T-DNA o la mutagénesis de transposon se limita a especies que son susceptibles de transformación, mutagénesis química o física puede aplicarse a una amplia gama de especies. Sin embargo, la caracterización de las mutaciones derivadas de mutagénesis química o física tradicionalmente se basa en un enfoque clonación basada en mapas, que es el trabajo intensivo y consume mucho tiempo. Aquí, mostramos que una plataforma de Hibridación Genómica Comparativa (aCGH, en inglés) en arreglos de discos de alta densidad del genoma puede ser aplicada para eficientemente detectar y caracterizar variaciones número de copia (CNVs) en mutantes derivados de mutagénesis de bombardeo (FNB) neutrón rápido en Medicago truncatula, una especie de leguminosa. Análisis de la secuencia de genoma muestra que hay más de 50.000 genes o genes modelos en M. truncatula. En el presente, inducida por la FNB mutantes de M. truncatula se derivan más de 150.000 líneas de M1, que representan recursos genéticos inestimable para estudios funcionales de los genes en el genoma. La plataforma de la aCGH, en inglés que se describe aquí es una eficaz herramienta para la caracterización de mutantes de FNB-inducida en M. truncatula.

Introduction

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Leguminosas (Fabaceae) son la tercera familia de plantas con flores, con muchas especies económicamente importantes como la soja (Glycine max) y alfalfa (Medicago sativa). Las plantas leguminosas pueden interactuar con bacterias del suelo fijadoras de nitrógeno, generalmente llamado Rhizobium para desarrollar nódulos de la raíz en que dinitrogen atmosférico es reducido a amoníaco para uso por la planta huésped. Como tal, cultivos de leguminosas requiere pocas aportaciones de fertilizantes nitrogenados y así contribuyen a la agricultura sostenible. Cultivos de leguminosas producen hojas y las semillas con alto contenido de proteína, que sirve como excelente forraje y cereales. Sin embargo, especies de leguminosas cultivadas generalmente tienen estructuras de genoma complejo, haciendo estudios funcionales de genes que desempeñan un papel clave en procesos específicos de leguminosas engorrosos. Medicago truncatula ha sido adoptado ampliamente como una especie de modelo para estudios de leguminosas principalmente porque (1) tiene un genoma diploide con un tamaño de genoma haploide relativamente pequeña (~ 550 Mbp); (2) las plantas pueden transformar estable para estudios funcionales del gene; y (3) se está estrechamente relacionado con alfalfa (M. sativa), la reina de las forrajeras y muchos otros cultivos económicamente importantes para los estudios traslacionales. Recientemente, la secuenciación del genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 ha sido lanzado1,2. Anotación del genoma muestra que hay más de 50.000 genes predichos o modelos de gene en el genoma. Para determinar la función de la mayoría de los genes en M. truncatula genoma es una tarea difícil. Para facilitar los estudios funcionales de genes, se ha generado una amplia colección de mutantes en la gama de más de 150.000 líneas de1 M utilizando mutagénesis de bombardeo (FNB) neutrón rápido en M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutrón rápido, un mutágeno de ionización de alta energía, se ha utilizado en la generación de mutantes en muchas especies de plantas como Arabidopsis5,6,7de arroz (Oryza sativa), tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. max)8,9, cebada (Hordeum vulgare) y Lotus japonicus10. Una gran parte de las mutaciones derivadas de mutagénesis FNB son debido a supresiones de ADN varían en tamaño desde unos pocos pares de bases a mega pares9,11. Muchos genes fenotipo asociado han sido correctamente identificados y caracterizados de4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, reproducción molecular de los genes subyacentes de mutantes FNB dependía de un enfoque basado en el mapa, que es lento y limita el número de mutantes caracterizados a nivel molecular. Recientemente, varios enfoques gratuito incluyendo métodos basados en la transcripción, genoma alicatados hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos para la detección de variación número de copia de ADN y la secuenciación del genoma entero, ha sido empleado para facilitar la caracterización de mutantes de deleción en diversos organismos, incluyendo animales y plantas20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

Para facilitar la caracterización de mutantes de la FNB en M. truncatula, un genoma completo basado en el arreglo hibridación genomic comparativo (CGH) plataforma ha sido desarrollada y validado. Como se informó en los sistemas animales, el array-CGH plataforma permite la detección de variaciones de número de copia (CNVs) en el nivel de todo el genoma en mutantes de M. truncatula FNB. Además, las lesiones se pueden confirmar por PCR y fronteras de eliminación pueden ser identificadas por la secuencia. En general, la plataforma CGH array es una herramienta eficiente y eficaz en la identificación de lesiones en mutantes de M. truncatula FNB. Aquí, se ilustran el procedimiento CGH array y PCR caracterización de las fronteras de la canceladura en un mutante de M. truncatula FNB.

El siguiente protocolo proporciona información acerca de reactivos, equipos y herramientas de análisis y medidas experimentales para los investigadores que están interesados en llevar a cabo análisis de hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos de todo el genoma de número de copia variaciones en las plantas. Por ejemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante se utilizó para identificar regiones de eliminación y genes candidatos asociados con fenotipos mutantes. Mutante de M. truncatula FN6191, aislado originalmente de un neutrón rápido supresión inducida por el bombardeo mutante colección32 (véase Tabla de materiales), exhibió un fenotipo hiper-nodulación después de la inoculación con el suelo bacteria, Sm1021 Sihorhizobium meliloti , en contraste con las plantas de tipo silvestre.

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Protocol

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Nota: la figura 1 muestra los cinco pasos de la matriz, el protocolo CGH. Son: 1) preparación de materiales de planta; 2) aislamiento de muestras de ADN de alta calidad; Etiquetado 3) y purificación de muestras de ADN; 4) hibridación, lavado y barrido de arreglos de discos de todo el genoma; y 5) análisis de datos CGH. Arreglos de discos alicatado todo el genoma de M. truncatula contienen un total de 971.041 sondas de oligo único dirigido a más de 50.000 genes o modelos de gene en el genoma (véase tabla de materiales). Las únicas sondas están espaciadas aproximadamente cada 150 pares de bases (PB) en las regiones exonic y 261 bp en regiones intronic del genoma de M. truncatula.

1. preparación de materiales de planta

  1. Scarify tipo salvaje (WT; Cv de M. truncatula Jemalong A17) y semillas mutantes FN6191 con ácido sulfúrico concentrado durante 8 min (véase Tabla de materiales). Retire y deseche el ácido sulfúrico a un recipiente de desechos líquidos.
  2. Enjuagar las semillas con agua desionizada autoclave tres veces.
  3. Superficie de esterilizar las semillas con solución de cloro de 20% durante 10 minutos
  4. Enjuagar las semillas con agua desionizada autoclave tres veces.
  5. Semillas de almacén a 4 ° C por 3 días. Tras la vernalización, transferencia y germinar las semillas en el suelo para una semana en una cámara de crecimiento con 16 h/8 h luz/oscuridad y 150 µE/m 2/s la intensidad de la luz.
  6. Trasplante de las plántulas a macetas de 1 galón y crecer en un invernadero con ciclo de luz/oscuridad de 16 h a 8 h, 150 µE/m 2 /s intensidad de luz para tres a cuatro semanas. Recoger las muestras de hojas jóvenes de las plantas para la extracción de ADN.

2. Aislamiento de muestras de ADN de alta calidad

  1. 1 g de tejido foliar joven de una sola planta y congelar en nitrógeno líquido inmediatamente.
  2. Moler tejidos hojas congeladas en nitrógeno líquido con un mortero y mortero a polvo fino.
  3. Aislar ADN genómico con un aislamiento de DNA kit (véase Tabla de materiales).
  4. Resuspenda cuidadosamente purificada muestras de ADN en 50 μl de autoclave doble desionizada H 2 O (ddH 2 O) o 1 x buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0).
  5. Las concentraciones de DNA medida con un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales).
  6. Evaluar 260 nm/280 nm y 260 nm/230 nm proporciones de muestras de ADN.
    Nota: Las muestras de ADN de alta calidad deben tener una proporción de 260 nm/280 nm ≥ 1.8 y un cociente de 260 nm/230 nm ≥ 2.0.
  7. Más evaluar muestras de ADN mediante la ejecución de ellos en el 1% geles de agarosa.
    Nota: Las muestras de ADN de alta calidad deben tener alto peso molecular y no deben ser contaminadas por el ARN. Idealmente, la concentración final de ADN debería ser ~ 150 ng/μl.

3. Etiquetado ADN y purificación

  1. diluir 1 μg de DNA genómico de muestras con ddH 2 O hasta un volumen final de 20 μl en un tubo de centrífuga 500 μl.
  2. Añadir 5 μl de una cartilla al azar (véase Tabla de materiales) al tubo de.
  3. Vortex brevemente el tubo y colocarlo en un termociclador para incubar y desnaturalizar la DNA a 98 ° C durante 10 minutos
  4. Tomar el tubo en el termociclador y ponerla inmediatamente en agua con hielo para enfriar durante 5 minutos
  5. Etiquetado de preparar dos mezclas como se muestra en la tabla 1.
  6. Tubos de añadir 25 μl de etiquetado de mezclas 1 y 2 para referencia ADN y ADN de la muestra, respectivamente.
  7. Mezclar el etiquetado mezcla ADN mediante pipeteo tres veces y girar los tubos brevemente.
  8. Poner los tubos en un termociclador a incubar a 37 ° C por 2 h y luego a 65 ° C por 20 min inactivar la enzima exo-Klenow (véase Tabla de materiales).
  9. 430 añadir μl de 1 x de buffer TE a cada tubo.
  10. El contenido de la mezcla y girar los tubos brevemente.
  11. Transferencia de la solución en el tubo en una columna de purificación con una colección de 2 mL del tubo (véase Tabla de materiales).
  12. Centrifugar la columna de purificación a 14.000 x g durante 10 minutos
  13. Descartar el paso a través de la solución.
  14. Añadir 480 μL 1 x buffer TE a cada columna.
  15. Centrifugar la columna en 14.000 x g durante 10 minutos
  16. Eliminar la solución paso.
  17. Transferencia de la etiqueta muestra de ADN que queda en la parte inferior de la columna a un tubo de centrífuga nueva.
  18. Medir el volumen de la muestra de ADN marcada con una pipeta y llevar el volumen final a 80 μl con 1 x buffer TE.
  19. Medir la concentración de la muestra marcada de ADN utilizando un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales).
  20. Mezclar una cantidad igual de etiquetado de la muestra de ADN y ADN de referencia y el volumen final 160 μl con 1 x buffer TE.
  21. 256 añadir μl de 2 x de tampón de hibridación, 50 μl de ADN Cot-1 humano y 50 μl del agente bloqueador de la aCGH × 10 (véase Tabla de materiales) y mezclar bien mediante pipeteo para tres veces.
  22. Girar los tubos brevemente y ponerlos en un termociclador a incubar a 98 ° C por 10 min.
  23. Incubar los tubos a 37 ° C por 20 min.

4. Hibridación, lavado y análisis de las matrices de genoma

  1. caliente previamente el horno de hibridación a 67 ° C por lo menos 4 h antes del comienzo del hibridación.
  2. Colocar una diapositiva de la Junta sobre la base de una cámara de hibridación.
  3. Carga 490 μl de solución de hibridación de paso 3.23 en la diapositiva de la Junta de.
  4. Cubrir el portaobjetos de la junta con un chip de microarray de genoma de Medicago truncatula para formar una cámara de hibridación.
  5. Poner en las tapas de cámara de hibridación y apriete la cámara firmemente con las abrazaderas de.
  6. Poner la cámara de hibridación montado en el horno de hibridación e incubar a 67 ° C por 40-48 h.
  7. Prepare tres diapositivas lavar platos: dos con 250 mL de tampón de lavado guardar a temperatura ambiente, y uno con lavado Tampón II mantuvo a 37 ° C.
  8. Diapositiva de preparar dos frascos de lavado: uno con 70 mL acetonitrilo y una solución de secado y estabilización de 70 mL, guardar en una campana de humos a temperatura ambiente (véase Tabla de materiales).
  9. Sacar la cámara de hibridación del horno y quite las abrazaderas de cámara y cubierta.
  10. Mover el chip de microarray y el empaque deslizar a un plato de lavado de portaobjetos con tampón de lavado I y separan la viruta de la diapositiva de cubierta.
  11. Mover el microarray de la viruta para el segundo lavado diapositiva plato de tampón de lavado y circular suavemente la solución con una barra de agitación en una placa de agitación magnética a temperatura ambiente durante 5 min.
  12. Transferencia del microarray de la viruta a la tercera diapositiva lavado plato con tampón de lavado precalentado II y lávelo suavemente con una barra de agitación en una placa de agitación magnética a 37 ° C durante 1 minuto
  13. El chip de microarray de transferencia a una diapositiva lavado frasco con acetonitrilo en una campana de humos y lavar por 30 s.
  14. El chip de microarray de transferencia a una diapositiva lavado frasco con estabilización y secado solución y lavar por 30 s.
  15. Saque el chip poco a poco y secar durante 1 minuto
  16. Escanear el chip de microarray utilizando un escáner (véase Tabla de materiales) menores de 2 μm de resolución. Establecer los parámetros para guardar varias imágenes y deslice todo análisis. Establece canales 1 y 2 ganancias al 100% y cancelar el auto aumento.

5. Análisis de datos de CGH

  1. Extracto de la fluorescencia Cy3 y Cy5 intensidades para cada sondeo en la matriz utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales).
  2. Análisis de segmentación de uso del software para detectar variaciones de número de copia (CNVs) entre la muestra de ADN y ADN de referencia. Usar un umbral de segmento medio Registro 2 referencia muestra relación ± 2.5 desviaciones del estándar para la determinación de CNVs.
  3. Inspeccionar la distribución de los ratios de referencia muestra 2 registro a través de todo el genoma, mediante un software de mapeo de señal (véase Tabla de materiales).

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Results

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La figura 2 muestra la distribución de los ratios de2 registro normalizado de mutante versus peso señales a través de todo el genoma. Análisis de datos CGH reveló un aproximado 22 kb canceladura en el cromosoma 4 que abarca el entero SUNN gen33 y varios otros anotados genes en mutante FN6191 (figura 2, figura 3). La región suprimida del candidato fue cubier...

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Discussion

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Hemos desarrollado una plataforma CGH en arreglos de discos para la detección y caracterización de bombardeo del neutrón rápido (FNB)-inducida por mutantes de M. truncatula CV Jemalong A17. Para demostrar el uso de la matriz método CGH en la detección de mutaciones en el gen, se realizó análisis de aCGH del mutante FN6191, que exhibieron un fenotipo hiper-nodulación en contraste con las plantas de tipo silvestre, cuando se inoculó con S. meliloti Sm1021. Para el análisis de segmentación, un segmento se ...

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Disclosures

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Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

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Financiación de este trabajo se proporciona en parte por una subvención de NSF planta Genome Research (IOS-1127155).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatula matriz genómica, 1 x 1 MAgilentG4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutante)InternamenteFN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (referencia)Planta internaA17
Ácido sulfúricoSigma-Aldrich320501
DNeasy Mini KitQiagen69104
Espectrofotómetro NanodropThermo Scientific1000D
SureTag Kit de etiquetado de ADNAgilent5190-3400
Imprimación aleatoriaAgilent5190-3399
AcetonitriloSigma-Aldrich271004-1L
TermocicladorMJ researchPTC-200
CentrífugaLabnet international IncSpectrafuge 24D
Solución de estabilización y secadoAgilent5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit de hibridaciónAgilent5188-5380
Correderas de junta de cámara de hibridaciónAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Tampón de lavado 1 y 2Agilent5188-5221
Cámara de hibridación, inoxidableAgilentG2534A
Horno de hibridaciónAgilentG2545A
Columnas de purificaciónAgilent5190-3391
Escáner láserRocheMS200
NimbleScan 2.6Roche Mapa de señales de Nimblegen5225035001
1.9de Roche Nimblegen1.9
Mapa de señales

References

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