Este manuscrito describe el procedimiento para fabricar y caracterizar fibras de electrospun modificado Griffithsin poli (ácido láctico-co-glicólico) que muestran potente actividad adhesiva y antiviral contra la infección por virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 en vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar superficie, caracterizar la morfología resultante, Conjugación, y se describen desorción de Griffithsin de fibras de superficie modificada.
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Artículo de método
Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Electrospun fibras (EFs) han sido ampliamente utilizadas en una variedad de aplicaciones terapéuticas; sin embargo, sólo recientemente aplicados como una tecnología para prevenir y tratar sexualmente transmitidas (ETS). Además, muchas tecnologías EF se centran en encapsular al agente activo, en relación con la utilización de la superficie para impartir biofunctionality. Aquí se describe un método para fabricar y superficie-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, con las lectinas antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA es un polímero aprobado por la FDA que ha sido ampliamente utilizado en la administración de fármacos debido a sus excelentes propiedades químicas y biocompatibles. GRFT es un natural, potente y seguro lectina que posee actividad amplia contra numerosos virus incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Cuando se combinan, las fibras modificadas GRFT han demostrado potente inactivación del VIH-1 en la vitro. Este manuscrito describe los métodos para fabricar y caracterizar EFs GRFT modificado. En primer lugar, PLGA es electrospun crear un andamio de fibra. Las fibras son posteriormente modificado de superficie con GRFT usando 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y la química de N-hydroxysuccinimide (NHS). Microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó para evaluar el tamaño y la morfología de las formulaciones de superficie modificada. Además, un gp120 o hemaglutinina (HA)-ELISA de base puede utilizarse para cuantificar la cantidad de GRFT conjugada, así como desorción GRFT desde la superficie de la fibra. Este protocolo puede aplicarse más ampliamente para fabricar fibras que son modificados por la superficie con una variedad de proteínas diferentes.
Introducción
El uso de EFs como una plataforma de entrega tópica tiene el potencial para reducir significativamente las ITS. Actualmente, hay más 36 millones personas que viven con el VIH, con sobre 2 millones de nuevos casos reportados en 2015 solo1,2. Además, el virus herpes simple tipo 2 (HSV-2) la infección afecta cientos de millones de personas en todo el mundo y se ha demostrado para mejorar la adquisición del VIH por 2-5 veces3. Debido a esta relación entre infección por VHS-2 y la infección por el VIH, existe gran interés en el desarrollo de nuevos agentes activos que proporcionan la protecc....
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Protocolo
1. preparación y fabricación de andamio de fibra Electrospun
PRECAUCIÓN: todo el trabajo con solventes o soluciones de polímeros debe realizarse en una campana de humos químicos . Consulte la hoja de datos material de seguridad de cada reactivo antes de iniciar el protocolo de.
- Para electrospin una solución de polímero del EGLP 3 mL de 15% w/w, peso 720 mg de 50: 50 poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA; 0.55 a 0.75 dL/g, 31-57 kDa) en un vial de centelleo de 10 mL. El volumen de la solución se basa en el tamaño de lote típico utilizado en los estudios actuales.
Nota: Debe calcularse la masa de polímero para ag....
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Resultados
Morfología de la fibra tiene un efecto significativo en la capacidad de la EFs de superficie modificada para proporcionar protección contra virus. Aunque electrospinning es un procedimiento conveniente y sencillo, formulaciones de polímeros no optimizado pueden resultar en la morfología de la fibra irregular (figura 5B-C). Alteraciones en la condiciones de electrospinning que resultan en la formación de morfologías de estera-como cuentas o am.......
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Discusión
Debido a sus estructuras porosas y superficies grandes, EFs han encontrado una variedad de aplicaciones en la salud, uno de los cuales incluye servir como vectores terapéuticos. Drogas y otros agentes activos pueden ser incorporados dentro de EFs para entrega regulable, mientras que los productos biológicos y químicos ligandos pueden ser conjugados con la superficie de la fibra para celular específica dirigida a52 o biosensores53. Aquí la fabricación de GRFT superficie modi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al fondo de la judíos patrimonio por excelencia para la financiación de esta investigación. Agradecemos al Dr. Stuart Williams II para ofrecer generosamente el uso del sistema de centrifugado eléctrico. También agradecemos el Dr. Kenneth Palmer nos proporciona Griffithsin. Además agradecemos a Dr. Nobuyuki Matoba y su laboratorio para el entrenamiento en el ELISA GRFT trabajar.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Poli(Lactide-co-glicólido) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Thermo Scientific | ||
| Aguja dispensadora roma 18g x 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
| BD 3mL Jeringa Luer-lok | VWR | 309657 | |
| Parafilm (película de plástico) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (tampón MES) | Sigma Aldrich | M3671 | |
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Cloruro de potasio | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Hidroxisuccinimida (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| 2-Mercaptoetanol | Fisher | BP176 | |
| Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | hecho a medida, sin número |
| de producto Dimethyl Sulfoxide | Milipore | 317275 | |
| Polietilenglicol sorbitán monolaurato (Polisorbato, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tampón Tris EDTA | Sigma Aldrich | 93283 | |
| Placas inmuno no estériles de 96 pocillos de fondo plano | Thermo Scientific | 3355 | |
| Influenza Hemaglutinina (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | hecho a medida, sin número |
| de producto Cabra Anti-GRFT (Anticuerpo primario) | Kentucky Bioprocessing | NA | hecho a medida, sin número de producto |
| Conejo anti-cabra IgG-HRP (Anticuerpo secundario) | Santa Cruz | 2056 | |
| Sure Blue TMB Microwell Peroxidasa Sustrato | KPL | 52-00-00 |
Referencias
- Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
- Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
- Freeman, E. E., et al.
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Etiquetas
Fabricación de fibras por electrohiladoelectrohilado de PLGAquímica de modificación de superficiesinactivación del VIH-1 mediante Griffithsinaanálisis por microscopía electrónica de barridocuantificación de proteínas mediante ELISAconjugación EDC-NHScaracterización de la morfología de las fibrasadministración de fármacos antivirales
