Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Resumen

Las corrientes sinápticas pueden grabarse focal de visualizadas botones sinápticos en la Drosophila tercer instar larvas Unión neuromuscular. Esta técnica permite la monitorización de la actividad de una sola bouton sináptico.

Resumen

Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) es un sistema modelo excelente para estudiar la transmisión sináptica glutamatérgica. Describimos la técnica de las grabaciones de macropatch focal de corrientes sinápticas de botones visualizados en la NMJ de Drosophila larvas. Esta técnica requiere fabricación modificada para requisitos particulares de grabación micropipetas, así como un microscopio compuesto equipado con un gran aumento, objetivo de inmersión de agua de larga distancia, óptica de interferencia diferencial (DIC) de contraste y un fluorescente accesorio. El electrodo de registro se coloca en la parte superior de un seleccionado bouton sináptico visualizado con DIC óptica, epi-fluorescencia o ambos. La ventaja de esta técnica es que permite seguimiento de la actividad sináptica de un número limitado de sitios de liberación. El electrodo de la grabación tiene un diámetro de varias micras, y los sitios de liberación colocados fuera del borde del electrodo no afectar significativamente las corrientes registradas. Las corrientes sinápticas grabadas tienen cinética rápida y pueden ser fácilmente resuelto. Estas ventajas son especialmente importantes para los estudios de líneas de mosca mutantes con mayor actividad sináptica espontánea o asincrónica.

Introducción

Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar los mecanismos moleculares de control de la transmisión sináptica. El sistema neuromuscular de Drosophila es glutamatérgica, y por lo tanto, la Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) puede utilizarse para estudiar las características conservadas de liberación glutamatérgica. Desde Jan y de Jan estudio¹, las larvas de tercer estadio se ha utilizado ampliamente para estudiar la transmisión sináptica espontánea y evocada mediante el control de los potenciales excitatorios cruce (EJPs) o corrientes (EJCs). EJPs comúnmente se registran intracelular con un micro-elect....

Protocolo

1. fabricación de electrodos de grabación

1. tira de los electrodos de vidrio
   1. uso el siguiente protocolo para el tirador de microelectrodo (véase Tabla de materiales):
      1. línea 1: calor Tire de 510 - velocidad 30 tiempo 250; Línea 2: Calor tire 490 - velocidad 30 tiempo 250.
         Nota: Unidades de tiempo corresponden a 0,5 m por unidad; las otras unidades son relativas. El valor del calor debe ajustarse para cada filamento, después de realiza la prueba de rampa.
   2. Uso de un microscopio (35 aumentos) para que el diámetro interior del electrodo tirado está en la gama de 7-10 μm (

Resultados

Grabaciones de macropatch focal permiten monitoreo actividad sináptica de las botones sinápticos (figura 5). Cuando el electrodo se coloca en la parte superior un bouton sináptico (figura 5A, sitio 1), el grabado mEJCs (figura 5, Página 1) tienen una amplitud significativamente superior al nivel de ruido y sostenido aumento de las fases (en un rango de los milisegundos). Cuando el electrodo de la gra.......

Discusión

Drosophila representa un organismo modelo ventajoso para el estudio de la transmisión sináptica. Varias configuraciones de grabación se han utilizado en el NMJ larvas, incluyendo grabaciones intracelulares de potenciales sinápticos, grabaciones de corrientes sinápticas y voltaje de dos electrodos abrazadera^33,34, macropatch focal grabaciones de corrientes sinápticas que se describe aquí. La última técnica permite la cuantificación precisa de la transmisi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sutter P-97	Instrumento Sutter	P-97	Extractor de microelectrodos
Narishige MF-830	Narishige	MF-830	Microforge
WPI MF200	WPI	MF200	Microforge
Capilares de vidrio	WPI	B150-86-10	Capilares de vidrio
Microtorch 1WG61	Grainer	1WG61
Microtorch Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Dow Corning	SYLGARD 184	Silicona para la preparación de placas de disección
Clavijas de disección	Amazon	B00J5PMPJA	Pines para el posicionamiento de larvas
Pinzas	WPIINC	500342	Pinzas para colocar alfileres, quitar las tripas y las tráqueas.
Tijeras	WPIINC	501778	Tijeras para cortar la cutícula de las larvas y los nervios.
Olympus BX61WI	Olympus	BX61WI	Microscopio vertical
Olympus Lumplan FL N 60x	Olympus	UPLFLN 60X	Objetivo de microscopio 60X
Olympus UPlan FL N 10x	Olympus	Uplanfl N 10X	Objetivo de microscopio 10X
Narishige Micromanipulador	Narishige	MHW-3	Micromanipulador hidráulico de agua de tres ejes
npi Electronic GmbH ELC-03XS	npi Electronic GmbH	ELC-03XS	Amplificador electrofisiológico
A.M.P.I Master 8	A.M.P.I.	Master 8	Estimulador eléctrico
A.M.P.I Iso-Flex	A.M.P.I.	Iso-Flex	Estimulador Aislador
TMC mesa antivibratoria	TMC	63-9090	Mesa antivibratoria
TMC Jaula de Faraday	TMC	81-333-90 Jaula de	Faraday
Digidata 1322A	Axon Instruments	Digidata 1322A	Digidata
	Dell	Dell Dimension 5150	Computadora con sistema operativo Win XP
Portaelectrodos	WPI	MEH3SW	Portaelectrodos
Filtro óptico	Omega optical	XF 115-2	Cubo de filtro para la detección de proteínas fluorescentes verdes (GFP)
pCLAMP 8	Axon Instruments	8.0.0.81	Software para el registro de señales
Quantan	Software	interno-Software	para el procesamiento de señales
Canton-S (Wildtype)	Bloomington Stock Center	64349	Línea de mosca de control
cpx SH1	Generoso regalo de J.T. Littleton-Complexin		de moscas knock-out con aumento de la exocitosis espontánea
CD8-GFP	Bloomington Stock Center	5137	Línea de mosca con fluorescente neuronal (GFP) Tag

Computadora línea