Artículo de método

Un ensayo Geotaxis negativa iterativo rápido automatizado para analizar comportamiento escalar adulto en un modelo de Drosophila de la neurodegeneración

DOI:

10.3791/56507

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12 de septiembre de 2017

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1Research Center for Translational Medicine, Tongji University School of Medicine, 2Key Laboratory of Arrhythmias of the Ministry of Education of China, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Neurobiology, Tongji University School of Medicine, 4Shanghai Advanced Research Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, 5Sino-Danish College, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo paso a paso analiza el comportamiento de geotaxis negativa de Drosophila mediante un sistema automatizado de varios cilindro que aloja cientos de moscas y sincroniza su acción por un motor eléctrico. Sobre sincronización, es analizar comportamiento mosca geotaxis negativa, grabados digitalmente y analizados usando el software RflyDetection diseñado.

Resumen

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Las enfermedades neurodegenerativas se asocia frecuentemente a una progresiva pérdida de capacidad de movimiento, menor vida útil y neurodegeneración dependiente de la edad. Para entender el mecanismo de estos celulares eventos y sus relaciones causales con otros, Drosophila melanogaster, con sus sofisticadas herramientas genéticas y características conductuales diversas, se utilizan como modelos de enfermedades para evaluar fenotipos de neurodegenerativas. Aquí describimos un método de alto rendimiento para analizar el comportamiento de adultos geotaxis negativa de Drosophila , como una indicación de posibles defectos motor asociado a la neurodegeneración. Una máquina automatizada es diseñado y desarrollado para sincronización de mosca en coche mediante un impulso eléctrico inicial, más adelante lo que permite la grabación de comportamiento geotaxis negativa en un transcurso de segundos a minutos. Imágenes de la video grabado digitalmente luego son procesadas con el software de RflyDetection diseñado para la manipulación de datos estadísticos. A diferencia del ensayo manualmente controlados geotaxis negativa basado en volar sola, este protocolo precisa, rápida y de alto rendimiento permite la adquisición de datos más que centenares de moscas al mismo tiempo, proporcionando un enfoque eficiente para avanzar en nuestra comprensión en el mecanismo subyacente del aparato locomotor déficit asociado a la neurodegeneración.

Introducción

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Una variedad de protocolos y métodos han sido desarrollados para analizar comportamiento de escalada adultos de Drosophila . Bastante laborioso, el análisis tradicional sobre todo poner una sola mosca en un frasco individual y utiliza una fuerza manual para moscas abajo de sincronización1,2,3,4. Es tedioso y lento, inadecuado para grandes estudios de alto rendimiento y tiene posibles variaciones de la fuerza manual utilizada para golpear ligeramente las moscas así como otras limitaciones. Para mejorar el análisis, se desarrolló un ensayo rápido iterativo Geotaxis negativa (anillo) que permite el análisis de alto rendimiento en numerosas moscas en el mismo tiempo5. Sin embargo, el ensayo requiere todavía una fuerza ejercer manualmente para sincronizar la acción de volar. Nuestra versión de la prueba de anillo, revisada en el ensayo anterior, incluye una base metálica que aloja múltiples frascos que contienen la mosca controlados automáticamente por un motor eléctrico para conducir sincronización mosca6. A grabación, la mosca sube inmediatamente después de sincronización se graba entonces analizado usando un software de diseño propio. Nuestro análisis automatizado del anillo ha eliminado el proceso tedioso y requiere mucho trabajo en la recogida de datos de una sola mosca, uno a la vez y permitió el proceso de adquisición de datos ser más eficientes. Además, se ha empleado el análisis automatizado del anillo en un número de estudios para aclarar el mecanismo subyacente enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, validar el enfoque con eficacia alta7,8,9 .

En este artículo, se demuestra el ensayo de anillo automatizado usando el DDC-Gal4 impulsado por moscas de RNAi. DDC-Gal4 es una línea de Gal4 expresando específicamente en dopaminérgicas (DA) y de neuronas serotoninérgicas, lo que representa una gran herramienta para el análisis de los efectos de gen de destino asociados a déficit locomotor acompañando a neurodegeneración10. Además, incorporamos Dicer2 UAS, una línea de mosca que mejora la eficacia de ARNi, para generar el UAS-Dicer2; DDC-Gal4 línea de la herramienta. Las moscas de RNAi que decide usar es auxilin (aux) v16182 de RNAi (auxR16182), un gen que previamente hemos identificado para exhibir un efecto de volar locomotor actividad8. auxGFP moscas también están preparados para analizar los efectos sobre la sobreexpresión de aux . Mostraremos cómo utilizar el análisis automatizado de anillo para medir fly geotaxis negativos, presentar los resultados y discutir cualquier implicación de los resultados.

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Protocolo

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1. colección de la mosca

  1. mantener las moscas en la comida mosca estándar a 25 ° C, humedad 70% y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
  2. Recoger UAS-Dicer2; DDC-GAL4 volar virginsunder anestesia de dióxido de carbono (CO 2).
  3. Cruz estas vírgenes a las moscas macho adulto 2 días de edad con los siguientes genotipos: UAS-mCD8GFP (control), auxR 16182 (aux ARNi) auxGFP (sobreexpresión de aux), y auxR 16182; auxGFP (de rescate), con un varón: cociente femenino de 1:2.
  4. Por separado recientemente recoger eclosed machos y hembras en 3 frascos para cada grupo por experimento, colocando 10 moscas en cada frasco mosca regular con alimentos estándar a 25 ° C.
  5. Según el experimento, mantenga la recogida vuela hasta 35 días y utilizarlos para el análisis automatizado de anillo en el día 5, 15, 25 y 35.

2. Automatizado de ensayo de anillo

  1. transferencia 10 moscas (unisex) recogidos por genotipo en cada frasco, luego fije el frasco con un tornillo. Analizar el control de moscas y moscas llevar diferentes genotipos para cada conjunto de experimentos (hasta 10 simultáneamente, frascos 10 moscas en cada frasco).
  2. Encender la cámara digital situada en frente del aparato, e inicie la grabación una vez moscas es todo cargado y listo.
  3. Después de permitir 1 minuto para moscas en frascos, encienda el regulador de paso que controla el conductor paso; esto conduce el pequeño motor eléctrico para el control de la palanca para que consecutivamente se levanta y golpea el aparato 4 veces en 2 s. Vea la figura 1.
    1. Después de golpear ligeramente, tenga en cuenta que las moscas comienzan a ascender a la pared. Asegurarse de que grabación.
  4. Repita la sincronización como se describe en el paso 2.3 intervalo 60-s en ensayos consecutivos de 3 a 5.
  5. Repetir el experimento para 5, 15, 25 y 35 días de edad moscas. Realizar al menos 3 experimentos independientes para cada grupo, cada experimento con al menos 30 recogidos vuela (3 frascos).

3. Análisis de datos

  1. importar el vídeo grabado en el ordenador.
  2. Tomar una instantánea del vídeo en 6 s después de golpear ligeramente, para cada juicio.
  3. Importar la imagen instantánea en el software de RflyDetection (ver figura 2), usando el ' archivo ' menú.
  4. Establecer las líneas de base superiores e inferiores del frasco, precisamente usando el icono de referencia en la barra de herramientas y luego utilizando el cursor para marcar las líneas de base superiores e inferiores en la imagen.
  5. De entrada el número de moscas por frasco (p. ej., 10 aquí) en el ' vuela en rect ' campo y vial longitud (p. ej., 14 cm aquí) en el ' altura tubo ' campo dentro de la barra de opciones.
    1. Nota que las posiciones individuales de la mosca son detectadas y marcadas con puntos sobre la pantalla para cada frasco de.
      Nota: La figura 2 indica las posiciones de los clics de botón de menú.
  6. Nota que el software automáticamente determina la distancia escalada para cada mosca y muestra los valores promedio de 10 moscas en cada frasco en una tabla en el panel derecho. (Ver figura 2)
  7. El número sube con programas estadísticos (por ejemplo, prisma) para su posterior análisis estadístico del proceso.
  8. Presente los datos como promedio ± SEM.
  9. Calcular la p-valores de importancia (señalados con asteriscos, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001) con una vía ANOVA Bonferroni test de comparación múltiple

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Resultados

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Este artículo muestra el uso de un ensayo de anillo automatizado en la evaluación de comportamiento mosca geotaxis negativa. A diferencia del anterior ensayo de anillo, nuestro análisis incluyen un aparato automatizado que proporciona una fuerza eléctrica para sincronizar la acción de moscas y analiza cientos de moscas al mismo tiempo (figura 1). Análisis de Dicer2; DDC > auxR16182 moscas demostraron una disminución dependiente de la ...

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Discusión

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El análisis automatizado de anillo descrito aquí permite un análisis de alto rendimiento del comportamiento de la mosca geotaxis negativa por cientos de moscas al mismo tiempo. Previamente las estrategias existentes para el análisis de escalada adulto implican observaciones de una sola mosca en un frasco individual y posición de volar manualmente es detectado por el ojo. Este proceso algo tedioso a veces puede causar mala interpretación o mala interpretación de los datos, así como trabajos que requieren mucho trabajo. Nu...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos al centro de Stock de Bloomington y el centro de Viena Drosophila RNAi para las poblaciones de mosca. La patente para el aparato de anillo pertenece a Instituto de investigación de avanzada de Shanghai, Academia China de Ciencias. Las solicitudes para el software de RflyDetection debe hacerse a Huang Fu-de (ver lista de autor). Este trabajo fue financiado por becas del programa nacional de investigación básica de China (973 programa 2013CB945602) y la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31270825 y 31171043). Agradecemos a los miembros de laboratorio de Ho para discusión y comentarios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Forma Environmental ChamberThermo3949
Cilindros de dióxido de carbonoFuLian GAS TechnologyGB/T6052
Videocámara HDRSONYHDR-CX220E
Estereomicroscopio binocularXin ZhenSMZ-168BL
Básculas electrónicasMinQiaoSL1002N
RefrigeradorHaierSC-350
Polvo de agar-agarSinopharm10000561
GlucosaSinopharm10010518
Harina de maízSinopharm5464654
Azúcar morenoLiuCaiYuan45467936
Levadura seca instantáneaAB MAURI20886
AuxR16182VDRC7187
UAS-Dicer2Bloomington24650
UAS-mCD8GFPBloomington32185
DDC-Gal4Un regalo de Fude Huang
AuxGFPUn regalo de Henry Chang

Referencias

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  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741(2015).
  4. Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
  7. Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
  8. Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

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