Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.
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Artículo de método
Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre
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Resumen
Resumen
Anticuerpos monoclonales (mAbs) son poderosas herramientas útiles para tanto investigación fundamental y en biomedicina. Su alta especificidad es indispensable cuando el anticuerpo tiene que distinguir entre estructuras muy relacionadas (por ejemplo, una proteína normal y su una versión mutada). La actual forma de generar estos mAbs discriminativa implica investigación extensa de múltiples células B productoras de AC, que es costosa y consume tiempo. Proponemos aquí un método rápido y rentable para la generación de discriminativo, mAbs plenamente humana a partir de linfocitos B circulantes de sangre humana. La originalidad de esta estrategia es debido a la selección de antígeno específico células de Unión B combinada con la selección contra de todas las otras células, usando disponible periféricos sanguíneos mononucleares células (PBMC). Una vez que las células B específicas aisladas, secuencias de ADNc (complementario ácido desoxirribonucleico) que codifica para el mAb correspondiente se obtienen utilizando la tecnología de reacción en cadena de la transcripción-polimerasa reversa (RT-PCR) unicelular y expresado posteriormente en humanos células. Dentro de tan poco como 1 mes, es posible producir miligramos de mAbs humano altamente discriminativo contra prácticamente cualquier antígeno deseado naturalmente detectado por el repertorio de células B.
Introducción
El método aquí descrito permite la producción rápida y versátil de anticuerpos monoclonales completamente humanos (mAbs) contra un antígeno deseado (Ag). mAbs son herramientas esenciales en muchas aplicaciones de investigación básica in vitro e in vivo: flujo cytometry, histología, experimentos de western-blotting y bloqueo, por ejemplo. Además, mAbs se utilizan más en medicina para tratar enfermedades autoinmunes, cáncer y para el control de rechazo de trasplante1. Por ejemplo, mAbs anti-CTLA-4 y anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recientemente fueron utilizados como inhibidores de control inmune en cáncer tratamientos
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Protocolo
Todas las muestras de sangre periférica fueron obtenidas de donantes adultos anónimos después de consentimiento informado, según el Comité de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimiento Sampler NTS-2016-08).
1. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica
Nota: Material de partida puede ser sangre total periférica o cytapheresis muestras. Las muestras no deben ser mayores de 8 h y complementan con los anticoagulantes (p. ej., heparina).
- Diluir la sangre con 2 volúmenes (sangre periférica) o 5 volúmenes (cytapheresis muestra) del Medio RPMI (Roswell Park ....
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Resultados
A partir de PBMC procedentes de donantes sanos, presenta proyecto la generación de mAbs humana, que reconocen el péptido Pp65495 (Pp65, de citomegalovirus humano) presentado por la clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula (HLA - A * 0201 HLA-A2). Estos mAbs pueden discriminar entre este complejo y complejos que representan otros péptidos cargados en el mismo MHC-I molécula.
PBMC fueron manchados .......
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Discusión
El protocolo propuesto es un método eficaz para la generación de mAbs humana directamente de las células B Ag específicos circulantes en la sangre. Combina tres aspectos importantes: (i) el uso de un enriquecimiento magnético asociado de tetrámero, que permite un aislamiento ex vivo incluso raras Unión Ag de células de B; (ii) una estrategia bloquea que utiliza tres tetrámeros Ag (dos relevantes y uno irrelevante) etiquetados con tres fluorocromos diferentes para aislar, mediante citometría de flujo, sólo las cé.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos el servicio de citometría "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) asistencia técnica experta. Agradecemos también todo el personal de producción de proteína recombinante (P2R) y de plataformas de impacto (INSERM 1232 Santé SFR, Biogenouest, Nantes) por su apoyo técnico. Agradecemos Emmanuel Scotet y Richard Breathnach comentarios constructivos sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado financieramente por el proyecto IHU-Cesti financiado por el programa de gobierno francés «Investissements Avenir», administrado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Línea celular HEK 293A | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco de life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucosa 0,11g/L Piruvato de sodio (-) L-Glutmina |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,5M pH = 8 | Invitrogen de Life Technologies | 15575-020 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - separación de linfocitos medio | EuroBio | CMSMSL01-01 | densidad 1,0777+/-0,001 |
| estreptavidina R-ficoeritrina conjugado | Invitrogen de Life Technologies | S21388 | premiun grado 1mg/ml contiene 5mM azida sódica |
| Estreptavidina, aloficocianina conjugada | Invitrogen de thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azida de grado premium |
| Violeta brillante 421 estreptavidina | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| MicroBeads magnéticos conjugados Anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| MicroBeads magnéticos conjugados Anti-APC | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs o separador QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columnas | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizonte | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Dilución utilizada 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Dilución utilizada 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Dilución utilizada 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Dilución utilizada 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Dilución usada 1:1000 |
| Citómetro clasificador de células FACS ARIA III Tubos | BD Biosciences | ||
| Axygen | 321-10-061 | ||
| Gradillas para 96 microtubos | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Inhibidor de la ribonucleasa (recombinante) | Invitrogen de thermoFisher scientific | 10777-019 | cantidad:5000U (40U/ul) |
| Agua destilada Libre de dnasa/rnasa | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Hexámeros aleatorios | Invitrogen de thermoFisher scientific | N8080127 | cantidad: 50uM, 5nmoles |
| Superíndice III Transcriptasa inversa | Invitrogen de thermoFisher scientific | 18080-044 | cantidad : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polimerasa | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, grado de biología molecular | Thermo Scientific | R0182 | 4 * 100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimadores exteriores - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores - Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores - Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimadores exteriores - Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas para Ig humana- Detección de bacterias por PCR |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas para Ig humano |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGGAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTGTTGGAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Cebadores delanteros |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Cebadores delanteros |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Cebadores delanteros |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones inversas |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones inversas |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGGACCGTG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Imprimaciones inversas |
| 5' LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Cebadores |
| delanteros 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTGTGC TCTGGATCTCTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas- Cribado de PCR de bacterias |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas |
| 5'AgeIVk1_9_1– 13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Cebadores interiores -Cebadores delanteros |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Cebadores interiores -Cebadores delanteros |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTGTGACACAGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimadores internos -Imprimadores delanteros |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTGACGCAGTCTCT | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimadores internos -Cebadores delanteros |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Cebadores delanteros |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Forward cebadores |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Cebadores delanteros |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Cebadores delanteros |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG | Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Adelante cebadores |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTGTGTGCTGACKCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones interiores -cebadores delanteros |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTATGCTGACTCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG | Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -Imprimaciones inversas - Detección de PCR |
| de bacterias Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC | Detección de PCR de bacterias |
| QA Agarose-TM, Grado de Biología Molecular | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 Placa de PCR | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzima Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzima SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzima Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzima BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Número de acceso al Genbank FJ475055) | |||
| LCk (Número de acceso del Genbank FJ475056 ) | |||
| LCl (Accesión del Genbank número FJ517647) | |||
| T4 ADN ligasa | Invitrogen de thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medio | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicilina | Sigma Aldrich 10835242001 | ||
| LB (Luria Bertani) Caldo (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospina Plásmido ADN, ARN y purificación de proteínas | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI Reactivo de transfección de ADN | PolyPlus | 101-40 | |
| Fondo planoPlaca de 96 pocillos | Falcon | 353072 | |
| fondo en V Placa de 96 pocillos | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 | Frascos Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT tampón de recubrimiento | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp fondo plano 96 pocillos placas ELISA Nunc | /Thermofisher | 44-2404-21 | alta unión |
| a proteínas Anti-humano IgG Ab conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| Sustrato TMB | BD Biosciences | 555214 | |
| Estreptavidina | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap proteína A columna HP | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| Ä Columna KTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL | Healthcare | ||
| NGC Quest 10 Plus Sistema de cromatografía | BioRad | 7880003 |
Referencias
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 ....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
