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Artículo de método

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

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DOI:

10.3791/56508

⸱

6 de febrero de 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

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Resumen

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Resumen

Anticuerpos monoclonales (mAbs) son poderosas herramientas útiles para tanto investigación fundamental y en biomedicina. Su alta especificidad es indispensable cuando el anticuerpo tiene que distinguir entre estructuras muy relacionadas (por ejemplo, una proteína normal y su una versión mutada). La actual forma de generar estos mAbs discriminativa implica investigación extensa de múltiples células B productoras de AC, que es costosa y consume tiempo. Proponemos aquí un método rápido y rentable para la generación de discriminativo, mAbs plenamente humana a partir de linfocitos B circulantes de sangre humana. La originalidad de esta estrategia es debido a la selección de antígeno específico células de Unión B combinada con la selección contra de todas las otras células, usando disponible periféricos sanguíneos mononucleares células (PBMC). Una vez que las células B específicas aisladas, secuencias de ADNc (complementario ácido desoxirribonucleico) que codifica para el mAb correspondiente se obtienen utilizando la tecnología de reacción en cadena de la transcripción-polimerasa reversa (RT-PCR) unicelular y expresado posteriormente en humanos células. Dentro de tan poco como 1 mes, es posible producir miligramos de mAbs humano altamente discriminativo contra prácticamente cualquier antígeno deseado naturalmente detectado por el repertorio de células B.

Introducción

El método aquí descrito permite la producción rápida y versátil de anticuerpos monoclonales completamente humanos (mAbs) contra un antígeno deseado (Ag). mAbs son herramientas esenciales en muchas aplicaciones de investigación básica in vitro e in vivo: flujo cytometry, histología, experimentos de western-blotting y bloqueo, por ejemplo. Además, mAbs se utilizan más en medicina para tratar enfermedades autoinmunes, cáncer y para el control de rechazo de trasplante1. Por ejemplo, mAbs anti-CTLA-4 y anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recientemente fueron utilizados como inhibidores de control inmune en cáncer tratamientos2.

Los mAbs primeros fueron producidos por inmunoglobulina (Ig)-secretoras de hibridomas obtienen de las células esplénicas de ratones inmunizados o ratas. Sin embargo, la fuerte respuesta inmune contra mAbs murino o rata impide su uso terapéutico en humanos, debido a su rápida separación y el probable inducción de reacciones de hipersensibilidad3. Para abordar este problema, secuencias de la proteína animal de mAbs han sido parcialmente reemplazadas por los humanos para generar anticuerpos de ratón-humano o humanizados quiméricos llamados. Sin embargo, esta estrategia sólo parcialmente disminuye la inmunogenicidad, aumentando substancialmente el costo y la escala de tiempo de producción. Hay varias estrategias para esto y una mejor solución es generar mAbs humana directamente de las células B humanas. Uno de ellos es el uso de la visualización de fagos o levadura. Se trata de mostrar los dominios variables de una biblioteca combinatoria de Ig humana al azar pesado y luz cadenas en fagos o levaduras y llevar a cabo un paso de selección utilizando el antígeno específico de interés. Un gran inconveniente de esta estrategia es que las cadenas pesadas y ligeras están aleatoriamente asociadas, llevando a un incremento muy grande en la diversidad de los anticuerpos generados. Anticuerpos obtenidos no corresponden a las que surgirían de una respuesta inmune natural contra un Ag particular. Por otra parte, plegamiento de la proteína humana y modificaciones postraduccionales no son sistemáticamente reproducidas en procariotas o en levaduras. Un segundo método de producción humana mAb es la inmortalización de células B humanas naturales, por infección del virus Epstein - Barr o expresión de los factores anti-apoptótica BCL-6 y BCL-XL4. Sin embargo, este método sólo es aplicable a las células de memoria B y es ineficiente, que requieren la proyección de numerosos mAb inmortalizado B células productoras para identificar los clones de mAb pocos (si cualquier) con la especificidad antigénica deseada. El método es costoso y desperdiciador de tiempo.

Un nuevo protocolo recientemente se ha descrito para la producción de mAbs humano aislado solo de células B5. Se basa en un optimizado unicelular revertir la transcripción-polimerasa reacción en cadena (RT-PCR) para la amplificación de ambos la pesada luz cadena y codificación de segmentos de una sola célula B ordenado. Esto es seguido por la clonación y expresión de estos segmentos en un sistema de expresión eucariotas, lo que permite la reconstrucción de un mAb plenamente humana. Este protocolo se ha utilizado con éxito a partir de las células de B de donantes vacunados. Las células se cosecharon varias semanas después de la vacunación para obtener frecuencias más altas de las células B contra el Ag deseado y así limitar el tiempo requerido para la detección del6. También se han producido otros mAbs plenamente humanas de infectados por el VIH+ (Virus de inmunodeficiencia humana) pacientes7 y melanoma pacientes8. A pesar de estos avances, todavía hay no hay procedimiento disponible que permite el aislamiento de células B Ag específica independientemente de su fenotipo de memoria o de frecuencia.

El procedimiento aquí descrito conduce a aislamiento eficiente ex vivo de las células B humanas circulantes basados en su especificidad BCR, seguido por la producción de plenamente humana mAbs específicos de antígeno en alto rendimiento y con un tiempo de proyección baja. El método no se limita a las células de memoria B o células B secretoras de anticuerpos inducidas después de una respuesta inmune, pero puede aplicarse también al repertorio de células B humanos ingenuos. Que funciona incluso a partir de las células B Ag-específica presentes en muy baja frecuencia es un buen indicador de su eficacia. El principio del método es como sigue: se tiñen las células mononucleares periféricas en sangre (PBMC) con dos tetrámeros que presentan el antígeno de interés, cada uno marcado con un fluorocromo diferente (por ejemplo, ficoeritrina (PE) y Allophycocyanin (APC)), y un tercer tetrámero que presenta un antígeno estrechamente relacionado conjugado con un fluorocromo terceros (p. ej., brillante violeta 421 (BV421)). Para enriquecer las células de antígeno-que ata, las células se incuban luego con bolas recubiertas con anti-PE y Abs anti-APC y ordenados en columnas de separación celular. La fracción de células APC PE+ + es seleccionada, manchadas con una variedad de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir la identificación de las células B y sometida a clasificación de celda de citometría de flujo. Las células de B PE+ y APC+, pero brillante violeta-, están aisladas. Este paso selecciona en células que no son las células de B o no se unen al antígeno tetramerized, pero unen a PE o APC (estas células serán PE+ APC– o PE– APC+) o a la parte no-antígeno de los tetrámeros usado (estos las células serán BV421+). Las células de B no altamente específicas para el epitopo de interés también se seleccionan en este paso (estas células también será BV421+). Por lo tanto, este método puede purificar células B altamente específicas expresan receptores de las células B (BCR) capaces de discriminar entre antígenos relacionados muy de cerca conexos dos. Las células B específicas se recogen en tubos y su cDNAs de la polimerización en cadena-amplificados de la Ig (los ácidos desoxirribonucleico complementarios) clonado y expresado por una línea de células humanas como mAbs IgG secretada.

Como una prueba de concepto, este estudio describe la generación eficiente de mAbs humanos, que reconoce un péptido presentado por una clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula y puede discriminar entre este péptido y otros péptidos cargados en el mismo MHC-I alelo. Aunque el nivel de complejidad de este Ag es importante, este método permite (i) recuperación de alto rendimiento de mAbs específicos de Ag; (ii) producción de mAbs capaces de discriminar entre dos estructuralmente cerca de Ags. Este enfoque puede ser extendido a pacientes infectados o vacunados sin ninguna modificación del protocolo y también ya ha sido implementado con éxito en un sistema humanizado de la rata del9. Por lo tanto, este estudio describe un enfoque versátil y eficiente para generar mAbs plenamente humana que pueden ser utilizados en la inmunoterapia y la investigación básica.

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Protocolo

Todas las muestras de sangre periférica fueron obtenidas de donantes adultos anónimos después de consentimiento informado, según el Comité de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimiento Sampler NTS-2016-08).

1. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica

Nota: Material de partida puede ser sangre total periférica o cytapheresis muestras. Las muestras no deben ser mayores de 8 h y complementan con los anticoagulantes (p. ej., heparina).

  1. Diluir la sangre con 2 volúmenes (sangre periférica) o 5 volúmenes (cytapheresis muestra) del Medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  2. Cuidadosamente la capa 35 mL de suspensión celular diluido en 15 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo cónico de 50 mL. Hacer tantos tubos como sea necesario para distribuir toda la sangre diluida. Centrifugue a 1.290 x g durante 25 minutos a temperatura ambiente en un rotor que hace pivotar-cubo con freno apagado.
  3. Cuidadosamente y aspirar la capa de células mononucleares en la interfase entre el medio de gradiente de densidad y de la capa de plasma y transferir las células a un nuevo tubo cónico de 50 mL.
  4. Llenar el tubo con Medio RPMI, mezcle y centrifugue a 1.290 x g por 10 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante.
  5. Resuspender el precipitado de células en 20 mL de Medio RPMI y centrifugue a 200 x g durante 10 min eliminar las plaquetas. Retire con cuidado el sobrenadante. Repita este paso una vez.
  6. Resuspender el precipitado de células en Medio RPMI con 10% suero bovino Fetal (FBS).
    Nota: Vaya directamente a la etiqueta de tetrámero o mantener a las células a 4 ° C durante la noche en una concentración de 107 células/mL.

2. asociados de tetrámero enriquecimiento magnético de las células B específicas de Ag

  1. Preparar Ag tetrámeros agregando o PE o estreptavidina de grado premium marca APC o estreptavidina marcada con BV421 en una proporción molar de 1:4 a los monómeros de antígeno biotinilado. Añadir la cantidad apropiada de conjugado estreptavidina en tres porciones separadas, añadiendo una alícuota cada 10 min a temperatura ambiente.
  2. Distribución de las células (hasta 3 x 108 por tubo) en tubos cónicos de 15 mL y centrifugar a 460 x g durante 5 minutos.
    Nota: El siguiente protocolo es para un tubo.
  3. Resuspender el precipitado de células en 200 μL de PBS (fosfato tampón salino) con 2% FBS. Añadir PE, APC y tetrámeros conjugado con BV421, cada uno a una concentración final de 10 μg/mL. Mezclar bien e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Preparar el tampón de separación celular helada (SB) con PBS con 0,5% BSA (albúmina de suero bovino) y EDTA (ácido etilendiaminotetracético) 2 mM.
  5. Añadir 10 mL de células SB pellets por centrifugación a 460 x g durante 5 minutos.
  6. Resuspender las células en 500 μl de helada código añadir 50 μl de anti-PE y 50 μl de microesferas magnéticas anti-APC.
  7. Mezclar bien e incubar por 20 min a 4 ° C.
  8. Repita el paso 2.5 dos veces.
  9. Eliminar el sobrenadante con cuidado andresuspend el precipitado de células a una concentración de 2 x 108 células/mL de hielo frío SB.
  10. Equilibrar una columna magnética grande colocada sobre un imán con 3 mL de SB.
  11. Transferencia de suspensión celular de 2.9 en la parte superior de la columna equilibrada y permitir que drene completamente. PASO crítico: Para evitar la aglutinación de la columna, pasar las células a través de una malla de nylon de 70 μm.
  12. Enjuague el tubo que contenía las células con 3 mL de hielo frío SB y transferir el buffer directamente a la columna (en caso de filtración, enjuague el 70 μm de malla de nylon).
  13. Cuando el buffer ha drenado totalmente en la columna, añadir otro 3 mL de hielo frío SB a la columna.
  14. Repita el paso 2.13 para otro lavado con 3 mL.
  15. Retire la columna del imán y lugar sobre un tubo colector cónico de 15 mL.
  16. Añadir 5 mL de hielo frío SB en la parte superior de la columna y lavar inmediatamente las células de la columna utilizando el émbolo. Repita este paso una vez.
  17. Centrifugar las células recogidas (fracción de positivo de la célula de tetrámero pertinentes enriquecido) a 460 x g durante 5 minutos y proceder a la coloración del anticuerpo adicional.
    Nota: Piscina recoge las células de todos los tubos, si procede.

3. tinción de las células B humanas específicas de Ag y clasificación celular

  1. Resuspender el precipitado de células con un cóctel de anticuerpos anti-humanos contra CD3 (dilución final: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50) y 7AAD (1: 1000) en un volumen final de 100 μl de PBS con 2% FBS. Incubar durante 30 min a 4 ° C.
  2. Añadir 10 mL de PBS a las células, centrifugar a 460 x g durante 5 min y eliminar el sobrenadante. Repita este paso una vez. Resuspender el precipitado de células en 200 μL de PBS, filtro en malla de nylon de 70 μm.
  3. Proceder a clasificar las células B específicas a nivel unicelular en un citómetro de clasificador de células con una boquilla de 100 μm y una presión de 20 psi sin sobrepasar los 1.000 eventos/s9.
    Nota: La estrategia bloquea utilizada se muestra en la figura 1. Las células primero fueron gated en CD14–CD16 7AAD–– células monocitos, NK y células muertas (no se muestra en la figura 1). Entonces CD19+ B células fueron seleccionadas antes de bloquear en células doble por PE y APC las Ag-tetrámeros. Las células de B no específicos fueron excluidas por compuerta en BV421 las células negativas (mancha por Ag-tetrámero irrelevante).
  4. Recoger las células B en la tira de 8 tubos PCR previamente llena con 10 μl de PBS de x 1 y 10 unidades de inhibidor de la Rnasa y colocar sobre una rejilla para 96 microtubos. Congelar inmediatamente los tubos PCR a-80 ° C.
    Nota: Las máscaras del tipo seleccionadas en el instrumento de citómetro son máscara de rendimiento: 0, máscara de pureza: 32 y la máscara de fase: 0. este depósito unicelular se podría ajustar a una placa PCR de 96 o 384 pocillos, si es necesario. Las células B deben ser congeladas lo antes posible y se pueden dejar a-80 ° C durante varias semanas, si es necesario.

4. célula RT-PCR

  1. Lyse las células calentando directamente las muestras congeladas en tiras PCR a 70 ° C por 5 min en un baño seco.
  2. Transferencia de tiras para hielo y proceder a revertir la transcripción (RT) mediante la adición de 10 μl por tubo de 2 x mezcla principal tampón que contiene 1 mM dNTP, cartillas de oligod(T) de 25 μg/mL, 5 μm random hexamers, 20 unidades de inhibidor de la Rnasa y 400 unidades de transcriptasa inversa.
    Nota: Después de la descongelación de la célula, RT debe realizarse rápidamente para evitar la degradación del RNA.
  3. Incubar a 25 ° C durante 5 minutos permitir que random hexamers hibridar, incubar 1 h a 50 ° C, y terminar con una incubación a 95 ° C por 3 min detener la reacción.
  4. Continuar con dos rondas de amplificación de PCR anidada para cada una de las regiones de codificación variable pesada (vH) y kappa (vLκ) o las cadenas ligeras lambda (vLλ).
    Nota: Como alternativa, muestras de RT pueden ser congeladas a-20 ° C y durante una semana.
    1. Para la primera ronda de PCR, agregar 3 μl de cDNA para un volumen final de 40 μl, que contiene 1.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 2.5 unidades de ADN polimerasa y 200 nM de imprimadores exteriores (ver figura 2 y Tabla de materiales para las secuencias de la cartilla).
      Nota: Composición de la mezcla de cebadores externos. Para la amplificación de cadena pesada: 4 adelante cebadores (5' HVI mix) y atrás de 2 cartillas (3' CµCγ mix). Para la amplificación de cadena ligera kappa, 3 adelante cebadores (5' LV | mix) y 1 atrás de la cartilla (3' Cκ543-566). Para la amplificación de cadena ligera lambda, 7 adelante cebadores (5' mezcla de LVl) y 1 atrás cartilla (3' Cl).
      Nota: Cebadores fueron diseñados por Sierpe et para la amplificación de la cadena pesada y ligera genes familiares5.
    2. Aplicar las siguientes condiciones de ciclismo: 94 ° C durante 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 58 ° C VH VLκ (60 ° C para VLλ) y 55 paso s a 72 ° C, con una elongación final a 72 ° C por 7 min.
    3. Para la segunda ronda de PCR, use 3 μl del primer producto de la amplificación para un volumen final de 40 μl que contiene 1.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 2.5 unidades de ADN polimerasa y 200 nM de cebadores internos que contienen sitios de restricción enzimática para la clonación en la expresión vectores (ver figura 2 y Tabla de materiales para las secuencias de la cartilla).
      Nota: Composición de la mezcla de cebadores internos. Para la amplificación de cadena pesada: 9 adelante cebadores (5' AgeIVH mix) y atrás de 3 cebadores (3' mix de SalIJH). Para la amplificación de cadena ligera kappa, 9 adelante cebadores (5' AgeIV | mezclar) y 3 atrás cartillas (3' mix de BsiWIJκ). Para la amplificación de cadena ligera lambda, 6 adelante cebadores (5' AgeIVl mix) y 1 atrás de la cartilla (3' XhoICl).
      Nota: Cebadores fueron diseñados por Sierpe et al., para la amplificación de todos los de la familia de genes de cadena pesada y ligera5.
    4. Aplicar las siguientes condiciones de ciclismo: 94 ° C durante 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 58 ° C VH LCκ (60 ° C para LCλ) y 45 paso s a 72 ° C con una elongación final a 72 ° C por 7 min.
  5. Identificar pozos positivos por migración 5 μL de los productos PCR de vH, vLκ y vLλ en gel de agarosa al 1.5% (500 bp productos para segmentos de codificación variable de cadena pesada) y un 350 bp para la cadena ligera variable codificación de segmentos.
  6. Purificar los restantes 35 μl PCR Productos remanentes de pozos positivos mediante membranas de ultrafiltración, diseñadas para la purificación de los productos PCR.
  7. Eluir los productos PCR con 60 μL de H2O.

5. expresión de clonación

  1. Preparar insertos
    Nota: Digerir 60 μL de cada PCR purificado producto en un volumen final de 100 μl que contiene el tampón de enzima de restricción apropiada.
    1. Para productos PCR de vH, añadir 50 unidades de africanas y 50 unidades de SalI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
    2. Para los productos de la polimerización en cadena de vLλ, añadir 50 unidades de africanas y 50 unidades de XhoI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
    3. Para productos PCR vLκ, añadir 50 unidades de africanas e incubar 1 h a 37 ° C. Purificar resúmenes utilizando membranas PCR 96 eluir con 60 μL de H2O. Digest eluido 60 μL en un volumen final de 100 μl de buffer de enzima de la restricción de BsiWI, añadir 50 unidades de BsiWI e Incube por 1 h a 55 ° C.
    4. Inactivar las enzimas por calentamiento a 80 ° C durante 15 minutos.
  2. Preparación de expresar vectores
    Nota: los productos PCR de vH son clonados en un vector de expresión (HCγ1) que contiene la cadena pesada constante Cγ1 de IgG1. vLκ productos de la PCR se clonan en un vector de expresión (LCκ) que contienen la cadena ligera constante Cκ. vLλ productos de la PCR se clonan en un vector de expresión (LCλ) que contienen la cadena ligera constante Cλ.
    1. Llevar a cabo la digestión siguiente:
      1. Mezclar 1 μg de expresión vector HCγ1 con 10 unidades de africanas y 10 unidades de enzimas de SalI en un volumen total de 20 μl de buffer de restricción recomendada por el fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C.
      2. Mezclar 1 μg de vector de la expresión LCκ con 10 unidades de enzimas de restricción de africanas en un volumen total de 20 μl de tampón de restricción recomendada por el fabricante e incubar durante 1 h a 37° C. Agregar 10 unidades de enzimas de restricción BsiWI e incubar 1 h a 55 ° C.
      3. Mezclar 1 μg de vector de la expresión LCλ con 10 unidades de africanas y 10 unidades de enzimas XhoI en un volumen total de 20 μl de tampón de restricción recomendada por el fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C
    2. Calentar cada mezcla de digestión a 65 ° C durante 10 minutos inactivar las enzimas de restricción.
    3. Realizar ligadura de 5 μl del producto PCR digerido con 2 μl (100 ng) del correspondiente vector de expresión lineal en un volumen total de 20 μl de 1 x buffer ligasa de ADN con 1 unidad de T4 ADN-ligasa por incubación durante la noche a 4 ° C.
      Nota: Como alternativa, la ligadura se realiza por 3 h a 4° C.
  3. Clonación
    1. Electroporate 1 μl de la mezcla de la ligadura de 20 μl en 45 μl de espectro casero TOP10 e. coli (protocolos actuales en Biología Molecular, sección 1.8.4-1.8.8). Inmediatamente agregar 500 μl de medio de YT X 2 e incubar en baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos bacterias propagación transformado en 2 x placas de ampicilina de YT. Incubar durante una noche a 37 ° C.
    2. Para cada transformación, pantalla de ocho colonias por PCR.
      1. Establecer una mezcla de reacción como sigue en el hielo: 45 μl de 5 x PCR Buffer, 12 μl de MgCl2 (25 mM), 4 μL de dNTPs (de una bolsa que contiene 10 mM de cada uno), 10 μl de avance cartilla (stock 10 μm) cruza por hibridación a la secuencia del vector (cartilla Ab-vec-sentido) y 10 μl del primer revés (stock 10 μm) dirigidos a la región constante de cadena pesada o ligera (véase Tabla de materiales para las secuencias de la cartilla). Componen a un volumen final de 200 μL con H2O. Luego añadir 4 μL de la enzima de ADN polimerasa (5 U/μL).
      2. Distribuir 25 μl de mezcla de reacción por tubo 8-tira del PCR en hielo.
      3. Utilice un palillo de dientes estéril para recoger las colonias individuales. Raya el palillo de dientes en un plato de ampicilina x TY 2 para constituir una placa replicar y luego introducirlo en un tubo de reacción de PCR.
      4. Realizar el examen PCR bajo las siguientes condiciones de ciclismo: 94 ° C por 10 min, seguido de 25 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 55 ° C y 50 s a 72 ° C.
      5. Identificar bacterias positivas por migración 5 μl de los productos PCR en gel de agarosa al 1.5%.
        Nota: Las colonias positivos dan un producto PCR alrededor 850 bp para el vector de cadena pesada y 600 bp para el vector de cadena ligera.
    3. Inocular cuatro colonias positivas de la placa de replicar en 2 mL de medio LB e incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
    4. Extracto de plásmidos de culturas líquidas usando un kit de purificación del plásmido, indicado por el fabricante.
    5. Verificar la correcta insercion de los dominios variables por Sanger secuenciación de la plásmidos con la cartilla de Ab-vec-sentido.
      Nota: Plásmidos con el inserto correcto (codificación de la HC y la LC correspondiente) deben ser cotransfected en 293A células de secreción. La especificidad de pequeña escala producido mAbs se evaluaron por ELISA. Luego, producción a gran escala se realiza en su caso.

6. producción de mAbs

  1. Producción en pequeña escala para el control de la especificidad
    1. El día antes de la transfección, riñón embrionario humano semilla 15.000 293A (HEK 293A) las células en 200 μL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS por pozo en placas de 96 pocillos. Incubar durante una noche en un incubador de CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
    2. Cotransfect 293A células en medio DMEM con 10% FBS usando un derivado de polietilenimina lineal como reactivo de transfección.
      Nota: Realizar la transfección en triplicado. El siguiente protocolo es para un pozo de una placa de 96 pozos de fondo plano.
      1. Diluir 0,5 μl de reactivo de transfección de ADN en 10 μl de NaCl 150 mM. Diluir 0.125 μg de vH y 0.125 μg de vectores expresando vL en 10 μl de NaCl 150 mM. Vortex cada dilución 10 s.
      2. Añadir 10 μl diluir el reactivo de transfección de DNA en la solución de ADN 10 μl. Agitarlos durante 15 s e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Añadir la mezcla de 20 μl mediante goteo en células 293A y mezclar agitando suavemente la placa.
    3. Reemplazar el medio 16 h después de transfección y células en cultivo durante 5 días en medio libre de suero.
      Nota: Utilice el medio libre de suero para evitar suero Igs contaminando los anticuerpos producidos.
    4. Eliminar las células y desechos por centrifugación a 460 x g durante 5 minutos.
    5. Recoger sobrenadante por aspiración con una pipeta multicanal y transferirlas a una placa de 96 V-fondo-bien.
    6. Capa correspondiente Ag durante la noche a 4 ° C en 100 μl por pocillo de la capa de ELISA/biológico reconstituida tampón 1 x a una concentración final de 2 μg/mL en placas de ELISA de 96 pocillos. Ver ejemplos en 9.
    7. Bloque de pozos con medio DMEM FBS de 10% por 2 h a 37 ° C
    8. Añadir 50 μl de sobrenadante de células transfected 293A paso 6.1.5 e incubar por 2 h a TA.
    9. Añada 100 μl de un humano Ab IgG conjugado a la enzima peroxidasa (HRP) de rábano picante 1 μg/ml e incubar 1 h a temperatura ambiente. Añadir sustrato cromogénico de 50 μl (TMB) e incubar por 20 min.
    10. Leer la densidad óptica a 450 nm en un espectrofotómetro.
      Nota: Los mAbs específicos reveladas por ensayo ELISA se puede además producir en gran escala y purificado de proteína de una columna que presenta afinidad por la IgG humana.
  2. Producción a gran escala y purificación de mAbs específicos
    1. El día antes de la transfección, la riñón embrionario humano de semilla 6 x 106 293A (HEK 293A) células en frascos de2 175 cm que contiene 25 mL DMEM suplementado con 10% FBS. Incubar durante una noche en un incubador de CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
      Nota: Las células deben ser 70% confluentes cuando transfected.
    2. Cotransfect 293A células en medio DMEM con 10% FBS usando un derivado de polietilenimina lineal como reactivo de transfección.
      1. Diluir 50 μl de reactivo de transfección de DNA en 450 μl de NaCl 150 mM. Diluir 10 μg de vH y 10 μg de vectores expresando vL en 500 μl de NaCl 150 mM. Vortex 10 s cada dilución.
      2. Añadir reactivo de transfección de DNA diluida a la solución de ADN. Agitarlos durante 15 s e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Añadir la mezcla de 1 mL mediante goteo a las células y mezclar agitando suavemente el frasco.
    3. Reemplazar el medio 16 h después de transfección y células en cultivo durante 5 días en medio libre de suero.
    4. Medio de cosecha por aspiración con una pipeta de 25 mL.
    5. Eliminar las células y desechos por centrifugación a 460 x g durante 5 minutos.
    6. Purificar los anticuerpos utilizando una columna de 1 mL con proteína A en un sistema de cromatografía líquida (FPLC) proteína rápido a 4 º C.
      1. Equilibrar la proteína una columna sepharose con 20 mM de tampón fosfato (pH 7).
      2. Filtrar el medio de cultivo celular de 6.2.5 usando un filtro 1.22 μm, luego un filtro de 0.45 μm.
      3. Cargue el medio de filtrado en la columna.
      4. Lavar con 20 mM de tampón fosfato (pH 7) y eluir con un tampón de citrato de 0,1 M (pH 3,5).
      5. Leer la densidad óptica a 280 nm en un espectrofotómetro de absorción y de inmediato neutralizar fracciones que contienen proteínas con 1 M Tris buffer (pH 9).
    7. Dializan Ab purificada durante la noche a 4 ° C en un cassette con un peso molecular de 3,5 K corte contra tampón PBS (pH 7.4).
    8. Esterilizar por 0.2 μm filtración y control de pureza por cromatografía por exclusión de tamaño, como indicado por el fabricante.

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Resultados

A partir de PBMC procedentes de donantes sanos, presenta proyecto la generación de mAbs humana, que reconocen el péptido Pp65495 (Pp65, de citomegalovirus humano) presentado por la clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula (HLA - A * 0201 HLA-A2). Estos mAbs pueden discriminar entre este complejo y complejos que representan otros péptidos cargados en el mismo MHC-I molécula.

PBMC fueron manchados ...

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Discusión

El protocolo propuesto es un método eficaz para la generación de mAbs humana directamente de las células B Ag específicos circulantes en la sangre. Combina tres aspectos importantes: (i) el uso de un enriquecimiento magnético asociado de tetrámero, que permite un aislamiento ex vivo incluso raras Unión Ag de células de B; (ii) una estrategia bloquea que utiliza tres tetrámeros Ag (dos relevantes y uno irrelevante) etiquetados con tres fluorocromos diferentes para aislar, mediante citometría de flujo, sólo las cé...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos el servicio de citometría "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) asistencia técnica experta. Agradecemos también todo el personal de producción de proteína recombinante (P2R) y de plataformas de impacto (INSERM 1232 Santé SFR, Biogenouest, Nantes) por su apoyo técnico. Agradecemos Emmanuel Scotet y Richard Breathnach comentarios constructivos sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado financieramente por el proyecto IHU-Cesti financiado por el programa de gobierno francés «Investissements Avenir», administrado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y Région Pays de la Loire. Este trabajo fue realizado en el contexto del programa IGO LabEX apoyado por la Agencia Nacional de investigación a través de la inversión del futuro programa ANR-11-LABX-0016-01.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Línea celular HEK 293AThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco de life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-Glucosa
0,11g/L Piruvato de sodio
(-) L-Glutmina
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
Albúmina sérica bovina (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,5M pH = 8Invitrogen de Life Technologies15575-020
Suero fetal bovino (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - separación de linfocitos medioEuroBioCMSMSL01-01densidad 1,0777+/-0,001
estreptavidina R-ficoeritrina conjugadoInvitrogen de Life TechnologiesS21388premiun grado 1mg/ml contiene 5mM azida sódica
Estreptavidina, aloficocianina conjugadaInvitrogen de thermoFisher scientificS323621mg/ml
2mM azida de grado premium
Violeta brillante 421 estreptavidinaBiolegend405225conc : 0,5mg/ml
MicroBeads magnéticos conjugados Anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801
MicroBeads magnéticos conjugados Anti-APCMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs o separador QuadroMACSMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
LS ColumnasMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonteBD Pharmingen / BD Biosciences563109Dilución utilizada 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Dilución utilizada 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Dilución utilizada 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Dilución utilizada 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Dilución usada 1:1000
Citómetro clasificador de células FACS ARIA III TubosBD Biosciences
Axygen321-10-061
Gradillas para 96 microtubosDominique Dutscher45476
RNAseOUT Inhibidor de la ribonucleasa (recombinante)Invitrogen de thermoFisher scientific10777-019cantidad:5000U (40U/ul)
Agua destilada Libre de dnasa/rnasaGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Hexámeros aleatoriosInvitrogen de thermoFisher scientificN8080127cantidad: 50uM, 5nmoles
Superíndice III Transcriptasa inversaInvitrogen de thermoFisher scientific18080-044cantidad : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polimerasaPromegaM7805
dNTP Set, grado de biología molecularThermo ScientificR01824 * 100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimadores exteriores - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores - Forward Prmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores - Forward Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimadores exteriores - Forward Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas para Ig humana- Detección de bacterias por PCR
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas para Ig humano
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGGAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTGTTGGAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Cebadores delanteros
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Cebadores delanteros
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Cebadores delanteros
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones delanteras
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones inversas
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas - Imprimaciones inversas
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGGACCGTG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas pesadas - Imprimaciones internas -Imprimaciones inversas
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Cebadores
delanteros 5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTGTGC
TCTGGATCTCTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones inversas- Cribado de PCR de bacterias
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Cebadores interiores -Cebadores delanteros
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Cebadores interiores -Cebadores delanteros
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTGTGTGACACAGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas - Imprimaciones directas
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimadores internos -Imprimadores delanteros
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTGTGACGCAGTCTCT		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones directas
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimadores internos -Cebadores delanteros
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Cebadores delanteros
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras k - Imprimaciones internas -Imprimaciones delanteras
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones directas
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Forward cebadores
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Cebadores delanteros
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Cebadores delanteros
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Imprimaciones delanteras
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		Primera ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones exteriores -Adelante cebadores
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTGTGTGCTGACKCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones interiores -cebadores delanteros
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTATGCTGACTCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -cebadores delanteros
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		Segunda ronda de PCR - Amplificación de cadenas ligeras y lambda; - Imprimaciones internas -Imprimaciones inversas - Detección de PCR
de bacterias Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Detección de PCR de bacterias
QA Agarose-TM, Grado de Biología MolecularMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 Placa de PCRMacherey Nagel743.100.100
Enzima Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzima SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzima Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzima BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (Número de acceso al Genbank FJ475055)
LCk (Número de acceso del Genbank FJ475056 )
LCl (Accesión del Genbank número FJ517647)
T4 ADN ligasaInvitrogen de thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT medioSigma AldrichY1003-500ML
AmpicilinaSigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Caldo (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nucleospina Plásmido ADN, ARN y purificación de proteínasMacherey Nagel740588.250
Jet PEI Reactivo de transfección de ADNPolyPlus101-40
Fondo planoPlaca de 96 pocillosFalcon353072
fondo en V Placa de 96 pocillosNunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 cm2Frascos Nunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT tampón de recubrimientoeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp fondo plano 96 pocillos placas ELISA Nunc/Thermofisher44-2404-21alta unión
a proteínas Anti-humano IgG Ab conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
Sustrato TMBBD Biosciences555214
EstreptavidinaSigmaS0677
1 mL-HiTrap proteína A columna HPGE Healthcare17-0402-01
Ä Columna KTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GLHealthcare
NGC Quest 10 Plus Sistema de cromatografíaBioRad7880003
de PCR de 8 tiras GE 17517501

Referencias

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
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  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
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Reimpresiones y permisos

Erratum


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

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Células mononucleares de sangre periféricaRT-PCR de célula únicaclasificación por citometría de flujotetrámeros HLA-A2/Pp65separación mediante microesferas magnéticasensayo ELISAresonancia de plasmón superficialamplificación de genes de inmunoglobulina
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