Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Summary

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Abstract

Estudio de los distintos eventos de regulación del ciclo celular en una forma dependiente de la fase proporciona una comprensión clara acerca de la división y crecimiento celular. La sincronización de poblaciones celulares en etapas específicas del ciclo celular ha resultado para ser muy útil en tales esfuerzos experimentales. Sincronización de las células por tratamiento con sustancias químicas que son relativamente menos tóxicos puede ser ventajoso sobre el uso de medicamentos inhibidores farmacológicos para el estudio de los eventos del ciclo celular consecuente y obtener enriquecimiento específico de las fases mitóticas. Aquí, describimos el protocolo de sincronización de las células humanas en las diferentes etapas de la célula ciclo, incluyendo ambos en fase S y fase M con un bloque doble timidina y suelte el procedimiento para el estudio de la funcionalidad de proteínas mitotic en la alineación del cromosoma y la segregación. Este protocolo ha sido muy útil para el estudio de los roles mitotic de proteínas multifuncionales que poseen funciones de interfase establecido. En nuestro caso, la función mitótica de Cdt1, una proteína crítica para replicación origen licencia en fase G1, se puede estudiar con eficacia solamente cuando Cdt1 específicas de G2/M puede ser agotado. Describimos el protocolo detallado para agotamiento de Cdt1 específicas de G2/M usando la sincronización doble de la timidina. También explicar el protocolo de la fijación de la célula y proyección de imagen de célula mediante microscopía confocal de alta resolución después del lanzamiento de timidina en vivo. El método también es útil para el análisis de la función de proteínas mitotic bajo condiciones fisiológicas y perturbadas como para Hec1, un componente del complejo Ndc80 ya que permite obtener tamaños de muestra grandes de células mitotic para fija y vivo de la célula Análisis como se muestra aquí.

Introduction

En el ciclo celular, las células se someten a una serie de eventos altamente reguladas y controladas temporal para la exacta duplicación de su genoma y su proliferación. En los mamíferos, el ciclo celular consta de interfase y fase M. En la interfase, que consta de tres etapas: G1, S, y G2, la célula duplica su genoma y experimenta un crecimiento que es necesario para el ciclo normal de la célula progresión^1,2. En la fase de M, que consta de mitosis (profase, Prometafase, metafase, anafase y telofase) y citocinesis, una célula parental produce dos células hijas genéticamente idénticas. En la mitosis, la herman....

Protocol

1. doble bloque de timidina y liberación: preparaciones de reactivos

1. Tomar 500 mL que Dulbecco modificado Eagle medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, penicilina y estreptomicina.
2. Hacer caldo de 100 mM de timidina en agua estéril y conservar en alícuotas a-80 ° C.

2. Protocolo para la proyección de imagen de celular fijo de progresión mitótica (figura 1A)

1. El día 1, semilla ~ 2 x 10⁵ células de HeLa en los pocillos de una placa de 6 pozos con un cubreobjetos (esterilizado con etanol al 70% y la radiación ultravioleta) y 2 mL de medio DMEM. Crecen las células en una....

Results

Estudio de la progresión mitótica y estabilidad de los microtúbulos en células fijas después del lanzamiento de doble bloque de timidina
Cdt1 participa en la concesión de licencias de origen de replicación del ADN en la fase G1. Se degrada durante la fase S, pero nuevamente se acumula en la fase G2/M. Para estudiar su papel en la mitosis, Cdt1 endógeno debe agotarse en la fase G/M usando la técnica de sincronización más adecuada de células, la timidina doble bloque

Discussion

La ventaja más importante de la sincronización doble de la timidina es que proporciona un tamaño de muestra mayor de células mitóticas en una ventana de tiempo corto con muchas de estas células en mitosis al unísono, así también, lo que permite el análisis de la alineación del cromosoma, bipolar eje formación y segregación cromosómica con eficiencia mucho más alta.

Muchos complejos de la proteína reguladora y vías de señalización están dedicadas a asegurar una progresión normal a través de la .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Tienda en 4 ° C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Tienda en 4 ° C
Leibovitz' s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Tienda a 4 ° C
Medio reducido de suero (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Tienda a 4 ° C
Penicilina y estreptomicina	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000
dilución Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Tienda en 4 ° C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Disuelto en agua destilada estéril
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
Células HeLa que expresan GFP-H2B
Células HeLa que expresan GFP-&alfa;-tubulina y mCherry H2B	Generoso regalo del Dr. Kozo Tanaka de Tohoku universidad, Japón
Solución de formaldehído	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Tóxico, necesita precaución
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Tóxico, necesita precaución
Anti-&alfa;-tubulina para ratones	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	dilución 1:1.000
Conejo ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	dilución 1:400
Antifosfo-y gamma para ratones; H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clon JBW301	dilución 1:300
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250
dilución Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilución
BioLite Multiplato de 6 pocillos	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Plato con fondo de vidrio	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Microscopio invertido Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments
Disco giratorio para cámara confocal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 longitudes de onda	Agilent
Sistema de incubación para microscopios	Tokai Hit	TIZB
Software NIS-elements	Nikon Instruments