Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

13.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56513

⸱

5 de diciembre de 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Resumen

Estudio de los distintos eventos de regulación del ciclo celular en una forma dependiente de la fase proporciona una comprensión clara acerca de la división y crecimiento celular. La sincronización de poblaciones celulares en etapas específicas del ciclo celular ha resultado para ser muy útil en tales esfuerzos experimentales. Sincronización de las células por tratamiento con sustancias químicas que son relativamente menos tóxicos puede ser ventajoso sobre el uso de medicamentos inhibidores farmacológicos para el estudio de los eventos del ciclo celular consecuente y obtener enriquecimiento específico de las fases mitóticas. Aquí, describimos el protocolo de sincronización de las células humanas en las diferentes etapas de la célula ciclo, incluyendo ambos en fase S y fase M con un bloque doble timidina y suelte el procedimiento para el estudio de la funcionalidad de proteínas mitotic en la alineación del cromosoma y la segregación. Este protocolo ha sido muy útil para el estudio de los roles mitotic de proteínas multifuncionales que poseen funciones de interfase establecido. En nuestro caso, la función mitótica de Cdt1, una proteína crítica para replicación origen licencia en fase G1, se puede estudiar con eficacia solamente cuando Cdt1 específicas de G2/M puede ser agotado. Describimos el protocolo detallado para agotamiento de Cdt1 específicas de G2/M usando la sincronización doble de la timidina. También explicar el protocolo de la fijación de la célula y proyección de imagen de célula mediante microscopía confocal de alta resolución después del lanzamiento de timidina en vivo. El método también es útil para el análisis de la función de proteínas mitotic bajo condiciones fisiológicas y perturbadas como para Hec1, un componente del complejo Ndc80 ya que permite obtener tamaños de muestra grandes de células mitotic para fija y vivo de la célula Análisis como se muestra aquí.

Introducción

En el ciclo celular, las células se someten a una serie de eventos altamente reguladas y controladas temporal para la exacta duplicación de su genoma y su proliferación. En los mamíferos, el ciclo celular consta de interfase y fase M. En la interfase, que consta de tres etapas: G1, S, y G2, la célula duplica su genoma y experimenta un crecimiento que es necesario para el ciclo normal de la célula progresión1,2. En la fase de M, que consta de mitosis (profase, Prometafase, metafase, anafase y telofase) y citocinesis, una célula parental produce dos células hijas genéticamente idénticas. En la mitosis, la hermana chromatids del genoma duplicado son condensado (profase) y son capturadas en sus cinetocoros por microtúbulos del huso mitótico ensamblado (Prometafase), que impulsa su alineación en la placa de la metafase (metafase) seguida por su igual segregación cuando hermana cromátides se divide hacia y transportados en el eje opuesto postes (anafase). Las dos células hijas se separan físicamente por la actividad de un anillo contráctil de actina-basado (telofase y citocinesis). El cinetocoro es una estructura proteica especializada que reúne en la región centromérica de cromátides hermanas y servir como sitios de fijación para los microtúbulos del huso. Su función principal es la captura de cromosoma, alineación, y ayuda en la corrección de accesorio de microtúbulos del huso indebido, al mediar el puesto de control de ensamblaje del huso para mantener la fidelidad de cromosoma segregación3,4.

La técnica de sincronización celular sirve como una herramienta ideal para la comprensión de los eventos moleculares y estructurales implicados en la progresión del ciclo celular. Este enfoque se ha utilizado para enriquecer poblaciones de células en fases específicas de diversos tipos de análisis, incluyendo perfiles de expresión génica, análisis de los procesos bioquímicos celulares y la detección de la localización subcelular de las proteínas. Las células mamíferas sincronizadas pueden utilizarse no sólo para el estudio de productos de genes individuales, sino también de enfoques de análisis de genomas enteros, incluyendo análisis de microarray del gene expresión5, de patrones de expresión de miRNA6, regulación traduccional7y análisis proteómico de proteína modificaciones8. Sincronización puede utilizarse también para estudiar los efectos de genes o proteínas precipitación o knock-out, o de productos químicos en la progresión del ciclo celular.

Las células se pueden sincronizar en las diferentes etapas del ciclo celular. Métodos físicos y químicos son ampliamente utilizados para la sincronización celular. Los criterios más importantes para la sincronización de la célula son que la sincronización debe ser fotoefecto y reversible. Debido a las potenciales consecuencias adversas celulares de la sincronización de las células por agentes farmacológicos, métodos de química dependiente pueden ser ventajosos para el estudio de eventos del ciclo celular clave. Por ejemplo, hidroxiurea, amphidicolin, mimosina y lovastatina, pueden utilizarse para la sincronización de la célula en fase G1/S, pero, debido a su efecto sobre las vías bioquímicas que inhibir, activar mecanismos de control del ciclo celular y matar a un importante fracción de las células9,10. Por otra parte, inhibición de la regeneración de la replicación del ADN mediante la adición de timidina a los medios de crecimiento, conocidos como "bloque de timidina", puede detener el ciclo celular en ciertos puntos11,12,13. Las células también pueden sincronizarse en fase G2/M por tratar con nocodazole y RO-33069,14. Nocodazole, que previene el montaje del microtubule, tiene una relativamente alta citotoxicidad. Por otra parte, las células nocodazole detenido puedan volver a interfase precozmente por deslizamiento mitotic. Doble timidina bloque detención en fase G1/S y después de la liberación del bloque, las células se encuentran células actuar sincrónicamente a través de G2 y mitosis. La progresión normal del ciclo celular de células de bloque de timidina puede observarse bajo microscopia confocal de alta resolución por fijación de la célula o en proyección de imagen. El efecto de la perturbación de las proteínas mitotic puede estudiarse específicamente cuando las células entraran y proceden a través de mitosis después del lanzamiento del bloque doble de timidina. Cdt1, una proteína multifuncional, está involucrado en licencias de origen de replicación de ADN en la fase G1 y se necesita para archivos adjuntos de microtúbulos cinetocoros durante mitosis15. Para estudiar la función de Cdt1 durante la mitosis, es necesario adoptar un método que evita el efecto de su agotamiento en licencias de replicación durante la fase G1, mientras que al mismo tiempo efectuar su agotamiento específicamente durante la fase G2/M solamente. Aquí, presentamos protocolos detallados basados en el bloque de timidina doble para estudiar la función mitótica de proteínas múltiples funciones durante las diferentes etapas del ciclo celular por proyección de imagen fija y células vivas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. doble bloque de timidina y liberación: preparaciones de reactivos

  1. Tomar 500 mL que Dulbecco modificado Eagle medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, penicilina y estreptomicina.
  2. Hacer caldo de 100 mM de timidina en agua estéril y conservar en alícuotas a-80 ° C.

2. Protocolo para la proyección de imagen de celular fijo de progresión mitótica (figura 1A)

  1. El día 1, semilla ~ 2 x 105 células de HeLa en los pocillos de una placa de 6 pozos con un cubreobjetos (esterilizado con etanol al 70% y la radiación ultravioleta) y 2 mL de medio DMEM. Crecen las células en una incubadora humidificada durante 24 h a 37 ° C y 5% CO2.
  2. a 1 cuadra de timidinast : en el día 2, mezclar bien el volumen requerido de timidina en el medio DMEM fresco (concentración de 2 mM stock, final de 100 m m).
  3. Añadir 2 mL de timidina contiene medios a las células en cada pozo del pozo 6 de la placa e incubar durante 18 h.
  4. El día 3, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM precalentado fresco; crecen las células en medio DMEM precalentado fresco de 9 h liberar células del bloque.
  5. 2 bloque de timidinand : otra vez, añadir 2 mL de timidina contiene medios (concentración final de 2 mM) a las células en cada pocillo de la placa de la pozo 6.
  6. Incubar durante 18 h otro.
  7. El día 4, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM fresco de precalentado.
  8. SiRNAs diluidos (control y Cdt1) y el reactivo de transfección en medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclan juntos e incuban por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.
  9. Incube las células a 37 ° C durante 9-10 h para liberar del bloqueo y fijar las células en el cubreobjetos con el 4% PFA por 20 min a TA.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.
  10. Immunostain células, después permeabilizing con detergente de 0,5% (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente y lavado las células dos veces con PBS 1 x durante 5 minutos.
    1. Bloque de celdas con 1% BSA (w/v) de 1 x PBS para 1 h a temperatura ambiente, seguido por el tratamiento de células con 50 μl de anticuerpos primarios (anticuerpo de ratón anti-α-tubulina diluido 1:1, 000, anticuerpos anti-Zwint1 diluido al 1: 400 y mouse anti-phospho-ɣ H2AX diluido en 1:300) en el 1% (p/v) BSA en PBS 1 x por 1 h a 37 oC.
    2. Después de lavar las células con 1 x PBS tres veces, tratar las células con 50 μl de anticuerpos secundarios para cada cubierta de vidrio (Alexa 488 y rojo rodamina en diluciones de 1: 250 en el 1% (p/v) BSA en 1 PBS de x) por 1 h a TA.
    3. Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, tratar las células con DAPI (0.1µg / mL en PBS 1 x) por 5 min a TA.
    4. Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, colocar el cubreobjetos frente a las células a los medios de montaje apropiados en un portaobjetos microscópico claro.
  11. Imagen de las células de las proteínas immunostained con 60 X o con objetivo de inmersión de aceite de 100 X 1.4 NA Plan apocromática DIC montadas en un microscopio confocal invertido de alta resolución equipado con una cámara apropiada según sea necesario para la calidad de las imágenes necesarias.
  12. Adquisición de imágenes a temperatura ambiente como z-pilas de 0.2 μm de espesor utilizando el software apropiado para el microscopio.

3. Protocolo para la proyección de imagen de células vivas de progresión mitótica (Figura 3A)

  1. El día 1, aproximadamente 0.5-1 x 105 células de HeLa expresando estable mCherry H2B y GFP-α-tubulina (ligeramente variable basada en el tipo de la célula y las proteínas que expresan) en platos de fondo de cristal de 35 mm con 1,5 mL de medio DMEM de semillas y cultivarlas en un humidificado incubadora para 24 h a 37 oC y 5% CO2.
  2. a 1 cuadra de timidinast : en el día 2, agregar 1,5 mL de timidina contiene los medios de comunicación a las células en el plato (timidina 100 mM, concentración final de 2 mM,).
  3. Incubar durante 18 h.
  4. El día 3, Aspire el medio que contenía timidina y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado.
  5. SiRNAs diluidos (control y Hec1) reactivo de transfección con medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclar juntos e incubar por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.
  6. Cultivar células en 1,5 mL de medio DMEM precalentado fresco de 8 h liberar células del bloque.
  7. 2 bloque de timidinand : Añadir 1,5 mL de contiene timidina media (concentración final de 2 mM) a las células en el plato.
  8. Incubar durante 18 h otro.
  9. El día 4, Aspire el medio y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado. Luego crecen las células en fresco precalentado Leibovitz de medio (L-15) suplementado con 10% FBS y 20 mM HEPES pH 7.0 durante 8 h para liberar células del bloque.
  10. Coloque el plato en la cámara de control de temperatura en el microscopio confocal de alta resolución que ya ha conectado al menos 30 minutos antes de comenzar la proyección de imagen para estabilizar las temperaturas experimentales y escenario.
  11. Enfoque en campo brillante con el objetivo x 60 hasta que las células son visibles, luego tamizar manualmente el escenario a la región de elección.
  12. Configurar la luz y energía láser, exposición, parámetros de adquisición de imagen y duración del experimento usando el software de adquisición de imagen de microscopio de elección. Utilice filtros para GFP (excitación 488; 385 emisión nm) y mCherry (561 excitación nm y 385 nm emisión) para adquirir imágenes.
  13. Realizar el experimento de Time-lapse por separado adquiriendo pulsada luz transmitida y fluorescencia imágenes cada 10 minutos durante un período hasta 16 h.
  14. Adquisición de imágenes como doce 1.0 μm separado z aviones a las 9 h después de la liberación del bloque doble timidina utilizando software apropiado al microscopio.
  15. Analizar las imágenes de progresión mitótica las células individuales de seguimiento y finalmente montar la película correspondiente con el software ImageJ/Fiji.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Estudio de la progresión mitótica y estabilidad de los microtúbulos en células fijas después del lanzamiento de doble bloque de timidina
Cdt1 participa en la concesión de licencias de origen de replicación del ADN en la fase G1. Se degrada durante la fase S, pero nuevamente se acumula en la fase G2/M. Para estudiar su papel en la mitosis, Cdt1 endógeno debe agotarse en la fase G/M usando la técnica de sincronización más adecuada de células, la timidina doble bloque

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La ventaja más importante de la sincronización doble de la timidina es que proporciona un tamaño de muestra mayor de células mitóticas en una ventana de tiempo corto con muchas de estas células en mitosis al unísono, así también, lo que permite el análisis de la alineación del cromosoma, bipolar eje formación y segregación cromosómica con eficiencia mucho más alta.

Muchos complejos de la proteína reguladora y vías de señalización están dedicadas a asegurar una progresión normal a través de la ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que ellos no tienen ningún interés financiero competencia.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Kozo Tanaka de la Universidad de Tohoku, Japón para el intercambio de células HeLa expresando estable mCherry histona H2B y GFP-α-tubulina. Este trabajo fue financiado por una subvención NCI a DV (R00CA178188) y por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Northwestern.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM (1x)Life Technologies11965-092Tienda en 4 ° C
DPBS (1x)Life Technologies14190-144Tienda en 4 ° C
Leibovitz' s (1x) L-15 mediumLife Technologies21083-027Tienda a 4 ° C
Medio reducido de suero (Opti-MEM)Life Technologies319-85-070Tienda a 4 ° C
Penicilina y estreptomicinaLife Technologies15070-063 (Pen Strep)1:1,000
dilución Dharmafect2GE DharmaconT-2002-02Tienda en 4 ° C
ThymidineMP Biomedicals LLC103056Disuelto en agua destilada estéril
Cdt1 siRNALife TechnologiesRef 10
Hec1 siRNALife TechnologiesRef 13
Células HeLa que expresan GFP-H2B
Células HeLa que expresan GFP-&alfa;-tubulina y mCherry H2BGeneroso regalo del Dr. Kozo Tanaka de Tohoku universidad, Japón
Solución de formaldehídoSigma-Aldrich CorporationF8775Tóxico, necesita precaución
DAPISigma-Aldrich CorporationD9542Tóxico, necesita precaución
Anti-&alfa;-tubulina para ratonesSanta Cruz BiotechnologySc32293dilución 1:1.000
Conejo ant-Zwint1BethylA300-781Adilución 1:400
Antifosfo-y gamma para ratones; H2AX (Ser139)Upstate Biotechnology05-626, clon JBW301dilución 1:300
Alexa 488Jackson ImmunoResearch1:250
dilución Rodamine Red-XJackson ImmunoResearch1:250 dilución
BioLite Multiplato de 6 pocillosThermo Fisher Scientific130184
35 mm Plato con fondo de vidrioMatTek CorporationP35GCOL-1.5-14-C
Microscopio invertido Nikon Eclipse TiENikon Instruments
Disco giratorio para cámara confocalYokagawaCSU-X1
Ultra 888 EM-CCDAndoriXon Ultra EMCCD
4 longitudes de ondaAgilent
Sistema de incubación para microscopiosTokai HitTIZB
Software NIS-elementsNikon Instruments
láser de Technologies

Referencias

  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Bloqueo con doble timidinaan lisis del ciclo celularfunci n de las prote nas mit ticasalineaci n y segregaci n cromos micaprotocolo de depleci n de Cdt1an lisis del cinetocoro Hec1imagen de c lulas vivasan lisis de c lulas fijadas
Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.