Artículo de método

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

DOI:

10.3791/56514

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25 de octubre de 2017

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1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, University of Cologne, 2Cologne Cluster of Excellence in Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos un método simple y rápido para el aislamiento de Salmonella typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina.

Resumen

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Salmonella typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y contenidas en vesículas denominadas fagosomas para degradar. Aislamiento de S. typhimurium-fagosomas que contienen han sido ampliamente utilizados para el estudio de cómo S. la infección typhimurium altera el proceso de maduración del fagosoma para evitar la degradación bacteriana. Clásicamente, el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas ha llevado a cabo por centrifugación gradiente de sacarosa. Sin embargo, este proceso lleva tiempo y requiere de equipo especializado y un cierto grado de destreza. Se describe aquí es un método simple y rápido para el aislamiento de S. typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con bolas magnéticas conjugado con biotina-estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método pueden suspenderse en cualquier buffer de elección, permitiendo la utilización de fagosomas aisladas para una amplia gama de ensayos, como el análisis de proteínas, metabolitos y lípidos. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es específico, eficiente, rápida, requiere equipos mínimos y es más versátil que el clásico método de aislamiento por gradiente de sacarosa-ultracentrifugación.

Introducción

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Los macrófagos circulan células fagocíticas especializadas que detectan, fagocitan y degradarán cualquier partícula extranjera presente en los tejidos periféricos, que van desde células apoptóticas a la invasión de microorganismos como las bacterias. Sobre superficie receptor-medió el reconocimiento de marcadores específicos del patógeno comúnmente presentes en la superficie de los microorganismos (conocido como patrones moleculares asociados a patógenos PAMPs), los macrófagos inician una reorganización compleja de la membrana celular en orden para rodear y fagocitan el patógeno1.

El patógeno engulló entonces conteni....

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Protocolo

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todos los pasos que implican el uso de patógenos S. typhimurium debe llevarse a cabo en un BSL-2 o mayor facilidad de nivel de seguridad biológica. La cultura y la capa de S. Typhimurium, así como la infección de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) debe realizarse bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. El aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas se puede realizar en cualquier banco de laboratorio BSL-2.

la extracción de médula ósea de ratones para su diferenciación en macrófagos fue realizada de acuerdo con las directrices sobre bienestar animal y a....

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Resultados

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Aislamiento de bacterias que contienen fagosomas en este protocolo requiere el biotinylation de las bacterias como un primer paso. Por lo tanto se evaluó la eficacia de S. Biotinilación de typhimurium por análisis de microscopía confocal de BMDMs infectadas con biotinilado mCherry -S. typhimurium marcado con Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs fueron infectados como se describe en este protocolo con mCherry -S. typhimurium previament.......

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Discusión

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Un nuevo método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos se describe aquí. Después de la interrupción de la membrana celular suave, fagosomas que contienen bacterias pueden ser fácilmente extraídos mediante una rejilla magnética. Demostramos que el etiquetado de las bacterias conserva la capacidad del patógeno para inducir inflamación y no altera la propiedad fagocítica de la célula huésped. Lo importan.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Investigación en laboratorio de Robinson es apoyada por fondos de Colonia Cluster de excelencia en las respuestas de estrés celular en enfermedades Aging-Associated, Universidad de Colonia, Alemania (CECAD; financiado por el DFG dentro de la iniciativa de excelencia de la federal alemana y los gobiernos del estado) y becas de la Fundación Maria-Pesch de la Universidad de Colonia, Alemania, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) y fortuna Köln.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
EZ-Link NHS BiotinaThermo Fisher Scientific20217
FluidMag EstreptavidinaChemicell4205
TUBERÍASCarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SacarosaCarl Roth4621.1
ManitolCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasaThermo Fisher Scientific1861280
Citocalasina BSigmaC6762
DYNAL o DynaMagImán Thermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 EspectrofotómetroBio-Rad170-2501
Bucle bacteriano (10µ l)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Instituto Leibniz DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-estreptavidinaInvitrogenSA1011
anticuerpo anti-beta-actinaSanta Cruz Biotechnologysc-47778
anticuerpo anti-mCherryThermo Fisher ScientificPA5-34974
anticuerpo anti-Rab5Santa Cruz Biotechnologysc-46692
anticuerpo anti-Rab7Santa Cruz Biotechnologysc-10764
anticuerpo anti-v-ATPasa (V0)Santa Cruz Biotechnologysc-28801
anticuerpo anti-v-ATPasa (V1)Santa Cruz Biotechnologysc-20943
anti-catepsina D anticuerpoCruz Biotechnologysc-6486
anti-Tomm20Santa Cruz Biotechnologysc-17764
anti-calnexina anti-CalnexinSanta Cruz Biotechnologysc-46669
anti-GAPDHSanta Cruz BiotechnologySC-20357
celulares Santa

Referencias

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  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-79....

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