Summary
Aquí describimos un método simple y rápido para el aislamiento de Salmonella typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina.
Abstract
Salmonella typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y contenidas en vesículas denominadas fagosomas para degradar. Aislamiento de S. typhimurium-fagosomas que contienen han sido ampliamente utilizados para el estudio de cómo S. la infección typhimurium altera el proceso de maduración del fagosoma para evitar la degradación bacteriana. Clásicamente, el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas ha llevado a cabo por centrifugación gradiente de sacarosa. Sin embargo, este proceso lleva tiempo y requiere de equipo especializado y un cierto grado de destreza. Se describe aquí es un método simple y rápido para el aislamiento de S. typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con bolas magnéticas conjugado con biotina-estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método pueden suspenderse en cualquier buffer de elección, permitiendo la utilización de fagosomas aisladas para una amplia gama de ensayos, como el análisis de proteínas, metabolitos y lípidos. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es específico, eficiente, rápida, requiere equipos mínimos y es más versátil que el clásico método de aislamiento por gradiente de sacarosa-ultracentrifugación.
Introduction
Los macrófagos circulan células fagocíticas especializadas que detectan, fagocitan y degradarán cualquier partícula extranjera presente en los tejidos periféricos, que van desde células apoptóticas a la invasión de microorganismos como las bacterias. Sobre superficie receptor-medió el reconocimiento de marcadores específicos del patógeno comúnmente presentes en la superficie de los microorganismos (conocido como patrones moleculares asociados a patógenos PAMPs), los macrófagos inician una reorganización compleja de la membrana celular en orden para rodear y fagocitan el patógeno1.
El patógeno engulló entonces contenido por el macrófago en una vesícula intracelular denominada fagosoma. A través de una serie de eventos de fisión con otras vesículas de endosomas y lisosomas y fusión, el fagosoma que contiene el patógeno adquiere un conjunto de proteínas necesario para la eliminación del contenido phagosomal. Por lo tanto, la composición enzimática del fagosoma es altamente variable en el transcurso de este proceso, conocido como de la maduración del fagosoma2.
Poco después de la fagocitosis, la multimérica Complejo ATPasa vacuolar (v-ATPasa) se incorpora a la membrana del fagosoma por fusión con endosomas3. Este complejo utiliza ATP para protones bomba desde el citosol al lumen del fagosoma4. Acidificación del fagosoma es esencial para los eventos de fusión con otras vesículas5 y para la activación de un gran número de enzimas degradativas dependiente de pH6. Otro complejo enzimático multimérica que rápidamente se ensambla en la membrana del fagosoma es el complejo NADPH-oxidasa (NOX). NOX complejo oxida NADPH para producir especies reactivas del oxígeno (ROS) que se secretan en el lumen del fagosoma y que contribuyen significativamente a la muerte de los microorganismos ingieren7.
Durante los pasos iniciales de la maduración, fagosomas presentan marcadores típicamente como Rab5 y Rab7 de endosomas temprano y tardío respectivamente junto con la subunidad de0 V de la v-ATPasa8. Fusión de los fagosomas con los lisosomas y endosomas finales resulta en la exposición del patógeno fagocitado a una gran variedad de enzimas hidrolíticas tales como lipasas y proteasas catepsina y β-galactosidasa9. Acidificación del lumen también se requiere para la activación de estas enzimas. Por ejemplo, el escote de catepsina D para producir la forma corta activa es dependiente de pH10. Estas enzimas degradan el patógeno y median la producción de péptidos derivados del patógeno cortos que son presentados por el macrófago de histocompatibilidad (MHC) clase II moléculas complejas a las células T para desencadenar una respuesta inmune adaptativa11.
Por lo tanto, la maduración del fagosoma es crucial para la respuesta inmunitaria innata y une los brazos del sistema inmune innatos y adaptativos. No es de sorprender que los patógenos han desarrollado estrategias para superar la eliminación por los macrófagos a través del proceso anteriormente descrito de la maduración del fagosoma. Por ejemplo, la bacteria intracelular tuberculosis del Mycobacterium y Legionella pneumophila prevenir la maduración del fagosoma por Asamblea de v-ATPase inhibidor y lumen consecuente acidificación12,13 . Otras bacterias como la Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducen la formación de poros en la membrana del fagosoma para escapar en el citosol14,15. Por otra parte, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) es capaz de modificar las propiedades del fagosoma dentro de la vacuola para transformarlo en un lugar adecuado para su replicación16. Esta capacidad hace S. typhimurium un modelo muy interesante para estudiar la interferencia mediada por el patógeno de la maduración del fagosoma.
S. typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. Bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y dentro de fagosomas17. Algunos informes han descrito previamente S. typhimurium-fagosomas que contienen actualmente los fabricantes de endosomas y lisosomas18, y otros estudios han encontrado la fusión fagosoma-lisosoma prevenida sobre S. De la infección typhimurium19.
Inicialmente, maduración de fagosoma al S. la infección typhimurium ha sido investigada por microscopia de la inmunofluorescencia. El desarrollo de técnicas para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas permitió un estudio más preciso del contenido en términos de marcadores endosome y lisosoma fagosoma. Hasta la fecha, el método principal utilizado para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas es el fraccionamiento subcelular en sacarosa paso gradientes18,20. Sin embargo, este método requiere varios pasos de centrifugación que pueden causar daños mecánicos en fagosomas, pueden afectar la estabilidad de phagosomal componentes (proteínas y lípidos) y consume tiempo. Por otra parte, requiere el uso de una ultracentrífuga: una pieza de equipo especializado que no es accesible para cada laboratorio.
Recientemente, se ha aplicado un nuevo enfoque para el aislamiento de bacterias que contienen fagosomas, en la que bacterias patógenas están marcados con lipopetide biotinilado (Lipobiotin) y más tarde extrajeron usando bolas magnéticas conjugado estreptavidina21 . Proponemos un método alternativo complementario por etiquetado bacterianas superficiales macromoléculas que contienen amina con NHS-biotina seguido de bolas magnéticas conjugado estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método son altamente enriquecidos en marcadores endosome y lisosoma y pueden utilizarse para una amplia gama de ensayos, de análisis de proteínas para análisis ómicas. Además, no requiere equipo especializado como ultracentrífugas. Por otra parte, mediante la eliminación de los pasos de centrifugación, el daño mecánico a los fagosomas y la cantidad de tiempo empleado se reducen considerablemente. Este método se puede adaptar fácilmente para el aislamiento de los fagosomas que contienen otras bacterias como la gram-positivos Staphylococcus aureus, incluido también en este manuscrito. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es un simple, rentable, y menos consumo de tiempo que el aislamiento clásico de sacarosa gradiente-ultracentrifugación, representación altamente enriquecido fagosomas que contienen bacterias.
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Protocol
todos los pasos que implican el uso de patógenos S. typhimurium debe llevarse a cabo en un BSL-2 o mayor facilidad de nivel de seguridad biológica. La cultura y la capa de S. Typhimurium, así como la infección de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) debe realizarse bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. El aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas se puede realizar en cualquier banco de laboratorio BSL-2.
la extracción de médula ósea de ratones para su diferenciación en macrófagos fue realizada de acuerdo con las directrices sobre bienestar animal y aprobada por la Agencia Estatal de Renania del Norte-Westfalia para la naturaleza, Medio ambiente y protección del consumidor [Landesamt für Natur, Umwelt y Verbraucherschutz (LANUV) Renania del Norte-Westfalia; Archivo no: 02.05.40.14.082 84 y 84-02.04.2015.A443] y la Universidad de Colonia.
1. cultivo S. typhimurium
- inocule S. typhimurium (SL1344 tensión) de una única colonia bacteriana en 5 mL de cerebro corazón infusión (BHI) caldo utilizando un bucle bacteriano.
- Incubar la suspensión bacteriana en una incubadora a 37 ° C durante la noche con sacudarir.
- Al día siguiente, transferir 1 mL de la suspensión bacteriana en 19 mL de caldo BHI en un matraz cónico e incubar a 37 ° C en una incubadora con agitación.
- Supervisar la S. typhimurium crecimiento midiendo la densidad óptica (OD) a 600 nm (OD 600) con un espectrofotómetro. Las mediciones deben tomarse aproximadamente cada 30 minutos
- OD cuando 600 alcanza 1.0, retire la suspensión bacteriana de la incubadora y transferencia en tubo de 50 mL. Centrifugue las bacterias a 5.400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
- Centrifugar a 5.400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Quite el sobrenadante y resuspender las bacterias en 4,9 mL de PBS estéril.
2. Capa de S. typhimurium con bolas magnéticas conjugado NHS-biotina/estreptavidina
biotina- Agregar 100 μl de 10 mg/mL a la solución (NHS-biotina disuelto en dimetil sulfóxido, DMSO) recién preparada, a la suspensión bacteriana preparado en el paso anterior. Por ejemplo, diluir 5 mg de biotina de NHS en 0,5 mL de DMSO estéril. Mezcla adecuadamente mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.
- Dividir la mezcla en cinco tubos de 1.5 mL.
- Incubar por 2 h a temperatura ambiente (RT) en un termobloque con agitación constante a 350 rpm.
- Centrifugar los tubos a 15.000 x g por 10 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
- Resuspender en 1 mL de PBS estéril, centrifugar a 15.000 x g por 10 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
- Repetir 2,5 dos veces más para eliminar el exceso biotina une solución.
- Después del último lavado, Resuspender el precipitado en 1 mL de PBS estéril.
- Transferir 100 μl de solución de conjugado estreptavidina - granos magnéticos de 10 mg/mL en un tubo de 1,5 mL y dejarla en la rejilla magnética de 5 min.
- Quitar el disolvente con una pipeta, tomar el conjugado estreptavidina-solución granos magnéticos de la rejilla magnética y resuspender con 1 mL de suspensión bacteriana revestido de biotina preparado en el paso 2.7.
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en un termobloque con agitación constante a 350 rpm.
- Coloque la solución en la rejilla magnética, espere 5 minutos y luego retire con una pipeta de las bacterias que no adhirió a la pared (guardarlo en un tubo etiquetado como " bacterias sin recubrimiento "). La fracción que se adhiere a la pared del tubo en contacto con el imán es la bacteria biotina/estreptavidina-revestido.
- Quitar el tubo que contiene las bacterias marcadas de la rejilla magnética y resuspender en 1 mL de PBS estéril.
- Colocarlo otra vez en la rejilla magnética, espere 5 minutos y utilice una pipeta para extraer el PBS.
- Repita 2.13 y 2.14 dos veces para eliminar todas las bacterias que no están cubiertas con las bolas magnéticas conjugado estreptavidina.
- Después del último lavado, resuspender las bacterias recubiertas en 500 μl de PBS estéril y etiquetar el tubo como " revestido bacterias ".
- Contar las colonias formando unidades (UFC) de ambos " no recubiertas de bacterias " y " recubiertas de bacterias " soluciones por diluciones seriadas en placas de agar BHI de la galjanoplastia. Se obtienen aproximadamente 2 x 10 8 UFC/mL de bacterias recubiertas de 20 mL de suspensión bacteriana inicial con OD 600 de 1.0. Mantener la suspensión bacteriana cubierto a 4 ° C para ser utilizado al día siguiente para infectar a los macrófagos.
3. Infección de BDMDs
- el mismo día cuando las bacterias están recubiertas con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos, placa completamente el distinguido BMDMs 22 platos de 6 cm con una densidad de 5 x 10 6 células por plato.
- Al día siguiente, centrifugar la suspensión bacteriana cubrió a 15.000 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Quite el sobrenadante y resuspender en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) en una concentración de 10 x 10 6 UFC/mL.
- Para infectar a los macrófagos en una multiplicidad de infección (MOI) de 10, quitar el medio de las BMDMs y añadir 5 mL de suspensión bacteriana cubierto preparado. MOI óptima puede evaluarse para cada tipo de células o el propósito experimental de los fagosomas aisladas.
- Incubar a temperatura ambiente durante 10 min para sincronizar fagocitosis.
- Incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO 2 durante 30 minutos iniciar la fagocitosis. Otros tipos de células pueden requerir tiempos de incubación diferentes para asegurar la internalización de la bacteria.
- Quitarlo del medio que contiene bacterias de los platos y lavar las células con RPMI tres veces para eliminar las bacterias internalizadas no.
- Por último, añadir 10 mL de RPMI con 10% FBS y 50 μg/mL gentamicina para matar a las bacterias fagocitadas no.
- Incubar los infectados BMDMs a 37 ° C con 5% CO 2 hasta que punto el tiempo deseado. El momento deseado debe ser determinada experimentalmente según la bacteria y tipo de la célula usado y el propósito de análisis. Para el estudio de los acontecimientos tempranos de la fusión fagosoma-endosome en S. BMDMs typhimurium infectada, se recomienda una incubación de 30 min. Para el análisis de acontecimientos posteriores, fagosomas pueden extraerse después de 2 h o 4 h de incubación. Incubación prolongada de macrófagos con S. Typhimurium más allá de 24 h resulta en la muerte de los macrófagos. Extendido la infección intracelular antes de la extracción de fagosoma probablemente podría conducir a la degradación de las moléculas de biotina. Sin embargo, no se observó pérdida de biotina en bacterias recubiertas hasta 24 h.
4. Aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas
almacenador intermediario- preparar el volumen de fagosoma necesario aislamiento A (50 mM tubos, pH.7, 50 mM de MgCl 2, 5 mM EGTA) mediante la adición de Ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 1 mM, citocalasina B para un final concentración de 10 μm y proteasa y fosfatasa inhibidores según lo recomendado por el fabricante.
Nota: TDT y Cytochalasin B deben agregarse al búfer de aislamiento de fagosoma A siempre inmediatamente antes de usar. Cytochalasin B altera el citoesqueleto, facilitando la ruptura de la membrana celular. - En el momento deseado punto, eliminar el medio de las células infectadas y lavar con PBS estéril calentada a RT.
- Añadir 750 μl de phagosome aislamiento del almacenador intermediario A por plato e incubar 20 minutos en hielo. Cuando se utiliza un número diferente de células, debe ajustarse proporcionalmente el volumen de tampón de aislamiento A.
- Añadir 250 μl de tampón de fagosoma aislamiento B (tubos de 50 mM, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, manitol de 220 mM y 68 mM sacarosa). Roca la placa para que el buffer llegue a toda la superficie del plato. Cuando se utiliza un número diferente de células, debe ajustarse proporcionalmente el volumen de tampón de aislamiento B.
- Eliminar las células del plato raspando suavemente usando un policía de goma y transferirlos a un tubo de 1.5ml previamente enfriada.
- Pasar la suspensión celular a través de una aguja de 26G utilizando una jeringa de 1 mL por lo menos 15 veces (una aspiración y una expulsión del suspensión del recuento como una vez). Esto es suficiente para liberar el contenido citosólico de BMDMs. El número de pasadas a través de la aguja debe ser optimizado para cada tipo de celular.
- Coloque la suspensión de células en la rejilla magnética y espere 5 minutos. Las partículas de imán son los fagosomas que contienen revestido - S. Typhimurium. La suspensión contiene el resto de los componentes celulares.
- Transferir la suspensión a un tubo de 1,5 mL etiquetado como " citosol ".
- Quitar el tubo con los fagosomas aislados de la rejilla magnética y resuspender en 1 mL de PBS estéril.
- Coloque la suspensión del fagosoma en la rejilla magnética, espere 5 minutos y retirar el PBS.
- Repita los pasos 4.9 y 4.10 para lavar el aislado S. typhimurium-que contienen fagosomas.
- Finalmente retirar el PBS y resuspender los fagosomas en el buffer necesario; por ejemplo, en un tampón de ensayo (RIPA) radioinmunoprecipitación para análisis de proteínas. Aproximadamente el 50-200 μg de proteína se obtiene por ejemplo siguiendo este protocolo, dependiendo de la cantidad inicial de las células y el Ministerio del interior de la infección de.
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Representative Results
Aislamiento de bacterias que contienen fagosomas en este protocolo requiere el biotinylation de las bacterias como un primer paso. Por lo tanto se evaluó la eficacia de S. Biotinilación de typhimurium por análisis de microscopía confocal de BMDMs infectadas con biotinilado mCherry -S. typhimurium marcado con Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs fueron infectados como se describe en este protocolo con mCherry -S. typhimurium previamente biotinilado pero no incuba con bolas magnéticas conjugado estreptavidina. Después de la incubación de 30 min a 37 ° C, las células fueron lavadas con PBS caliente y fijadas con formaldehído al 4% por 20 min a RT. fijación fue detenido por el extenso lavado con PBS. Las células entonces fueron permeabilized con 3% Triton en PBS durante 5 minutos a RT. BMDMs infectado entonces se incubaron con Cy5-estreptavidina durante 20 min a 4 ° C. Después de lavar amplio, las muestras se prepararon para análisis mediante microscopía confocal (figura 1). No biotinilado mCherry -S. Typhimurium fue utilizado como control negativo. Señal fluorescente del Cy5-estreptavidina se observó exclusivamente en biotinilado mCherry -S. typhimurium, confirmando Biotinilación de las bacterias era acertado. Análisis microscópico se realizó en un microscopio confocal con "60 X O2 NA: 1.40" objetivo. Longitudes de onda de excitación de los fluorocromos fueron 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry) y 635 nm (Cy5) y PMT voltaje fue fijado en 574v 565v y 443v, respectivamente.
Desde la respuesta inmunitaria desencadenada en macrófagos por S. typhimurium depende en gran medida de la activación del receptor de la superficie de macrófagos por ligandos bacterianos, que a continuación Probamos si la capa de S. typhimurium con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos podría alterar la respuesta inmune innata en BMDMs infectadas. Primero se evaluó si la capa de S. typhimurium puede alterar la capacidad fagocitaria de BMDMs por microscopia confocal. BMDMs fueron infectados como se describe en este protocolo con mCherry -S. Typhimurium recubierto con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos o sin recubrimiento mCherry -S. typhimurium. Después de la incubación de 30 min a 37 ° C, las células fueron lavadas con PBS caliente y fijadas con formaldehído al 4% por 20 min a TA. Después del extenso lavado con PBS, las muestras se prepararon para análisis mediante microscopía confocal. Como se muestra en la figura 2, los macrófagos fagocitadas mCherry revestido y sin recubrimiento -S. typhimurium igualmente.
A continuación, analizamos la respuesta inflamatoria desencadenada por S. typhimurium con biotina y estreptavidina conjugada bolas magnéticas (figura 3). Sobrenadantes de los BMDMs infectados con revestido y sin recubrimiento S. typhimurium se recolectaron después de 24 h de la infección por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de la secreción de interleucina 6 (IL-6). La capa de S. typhimurium y bolas magnéticas conjugado estreptavidina-biotina no alteró significativamente la respuesta inflamatoria de los macrófagos.
Para evaluar la pureza de los fagosomas que contienen bacterias obtenidos empleando este protocolo hemos analizado aislados mCherry -S. typhimurium-que contienen fagosomas immunoblotting. Usando anticuerpos específicos contra la etiqueta mCherry, encontramos enriquecimiento significativo de expresar mCherry S. typhimurium en fagosomas aislados en comparación con la fracción citosólica de la misma muestra (figura 4). Aislados los fagosomas que contienen mCherry - S. typhimurium que no fue previamente recubiertos con biotina se utilizaron como control negativo. Estos resultados demuestran que este protocolo permite la purificación de fagosomas que se enriquecen altamente en las bacterias.
A continuación realizamos el análisis de immunoblot de marcadores endosome y lisosoma en fagosomas aislados que contiene S. typhimurium (Figura 5). La mayoría de los marcadores endosome y lisosoma se observaron claramente en fagosomas aislados en infección después de 4 h en comparación con 30 minutos. El enriquecimiento de los marcadores endosomal Rab5 y Rab7, así como la lisosoma marcadores v-ATPasa (V0 y subunidades de1 V) y catepsina D, fueron observados. Interesantemente, se observó solamente la forma hendida de catepsina D en fagosomas aislados en infección después de 4 h. El clivaje de la Pro-catepsina D (48 kDa) para producir la forma activa corta (33 kDa) sólo ocurre en los fagosomas, pero no en el citosol, demostrando la especificidad del presente Protocolo para el aislamiento del fagosoma.
Ya que a menudo se detectan marcadores de organelos como las mitocondrias o el retículo endoplásmico (ER) en preparaciones de fagosomas aislados que contiene bacterias, S. typhimurium-que contienen fagosomas aislados fueron sondeados con anticuerpos específicos contra el transportador mitocondrial Tomm20 y el ER proteína calnexin (figura 6). También les probamos con un anticuerpo contra la enzima de la glucólisis GAPDH para evaluar contaminación citosólica en los fagosomas aislados. Encontramos tanto las mitocondrias como marcadores de ER en S. typhimurium-aislado fagosomas pero sin contaminación citosólica.
Para estudiar la versatilidad del protocolo para el aislamiento de los fagosomas que contienen bacterias, la biotina y bolas magnéticas conjugado estreptavidina-capa procedimiento se aplicó a la bacteria gram positiva S. aureus. Empleando la misma fijación y tinción de protocolo como se describe para mCherry -S. typhimurium (Figura 1) confirmamos éxito biotinylation de proteína fluorescente verde (GFP) expresando -S. aureus (figura 7). Por otra parte, detectamos enriquecimiento del marcador del endosome Rab7 y el lisosoma marcadores v-ATPasa (subunidad de0 V) y catepsina D por análisis del immunoblot de aislado GFP -S. aureus-que contienen fagosomas (figura 8). El escote de catepsina D en su forma madura sólo fue detectable después de 4 h de la infección en las muestras de fagosoma aislada pero no en la fracción citosólica. Aislado S. aureus-fagosomas que contienen estaban libres de contaminación citosólica como se muestra en la inmunodetección de GAPDH.
En Resumen, hemos demostrado que nuestro protocolo de aislamiento de fagosoma permite el aislamiento de altamente enriquecidos fagosomas que contienen bacterias, libres de contaminación citosólica. Las preparaciones de fagosoma aislado pueden utilizarse para el análisis de marcadores endosome y lisosoma estudiar phagosome de maduración. Además, fue demostrado que este protocolo se puede utilizar para las bacterias Gram-negativas y gram positivas y que el procedimiento de etiquetado no altera la respuesta inmunitaria de los macrófagos.
Figura 1: Análisis de la microscopia de fluorescencia de biotinilado S. typhimurium con Cy5-Streptavidin. BMDMs fueron infectados por 30 min con mCherry -S. typhimurium que fue biotinilado ("biotinilado S. T."), como se describe en este protocolo. No biotinilado mCherry -S. typhimurium ("No biotinilado S. T.") se utilizó como control negativo. Después de la fijación y permeabilización de las células, las muestras se incubaron con Cy5-estreptavidina durante 20 min a 4 ° C. Señal de fluorescencia del núcleo (DAPI), mCherry -S. typhimuriumy Cy5-estreptavidina se analizaron mediante microscopía confocal. Sólo se podía detectar señal de Cy5-estreptavidina en las bacterias previamente marcadas con biotina, confirmando así la Biotinilación eficiente. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis microscópico de BMDMs infectadas con mCherry -S. typhimurium recubiertos con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos. BMDMs infectaron con mCherry -S.typhimurium marcados con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos como se describe en este protocolo. Después de permitir que los macrófagos que fagocitan las bacterias durante 30 minutos, las células se fijaron con formaldehído al 4% por 20 min a TA. El revestido bacterias fagocitadas por los macrófagos fueron entonces analizados por microscopia confocal. El análisis demostró que la ingesta de bacterias recubiertas ("revestido S. T.") es comparable a la ingesta de bacterias mCherry sin etiqueta ("no recubierto S. T."), demostrando que etiquetado con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos no altera la fagocitosis de S. typhimurium por macrófagos. Los núcleos fueron teñidos con DAPI para microscopía de visualización. Datos se muestran como promedio ± SEM, y la significación estadística calculó tde student-prueba se representa como * = p < 0.05; ** = p < 0.01; = p < 0.001. Barra de escala = 40 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Secreción de IL-6 por BMDMs infectados con bolas magnéticas conjugado biotina y estreptavidina, etiquetados S. typhimurium comparado con etiqueta S. typhimurium . BMDMs estaban infectados con S. typhimurium recubiertos con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos como se describe en este protocolo. Después de 24 h de la infección, sobrenadantes fueron recogidos para su posterior análisis de la secreción de IL-6 por ELISA. Sobrenadante de forma BMDMs infectados sin recubrimiento S. typhimurium se utilizaron como control. La inducción de la secreción de IL-6 por revestido Sde. typhimurium no fue significativamente diferente comparada con la de sin recubrimiento S. typhimurium. Datos se muestran como promedio ± SEM, y la significación estadística calculada la prueba t de student se representa como * = p < 0.05; ** = p < 0.01; = p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: enriquecimiento bacteriano en fagosomas aisladas. Enriquecimiento de tagged mCherry S. typhimurium en fagosomas aislados recogidos después de 30 min y 4 h de la infección se comparó con la fracción citosólica. Fue utilizado β-actina como control de carga. El control negativo se refiere a los fagosomas aislados usando sin recubrimiento S. typhimurium en 30 min post infección. Como era de esperar, el resultado final del aislamiento de fagosoma utilizando sin etiqueta S. typhimurium no presenta cantidades significativas de mCherry o β-actina, demostrando la especificidad del protocolo. se carga 20 μg de proteína por muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de los marcadores endosome y lisosoma en aislado S. typhimurium-que contienen fagosomas. El enriquecimiento de los marcadores del endosome Rab5 y Rab7, lisosoma marcadores v-ATPasa (V0 y V1 subunidades) y catepsina D fue analizado en aislado S. typhimurium-que contienen fagosomas extraídos después de 30 min y 4 h de la infección. Fue utilizado β-actina como control de carga. se carga 20 μg de proteína por muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis de las mitocondrias, ER y marcadores citosólicas en aislado S. typhimurium-que contienen fagosomas. El marcador citosólico GAPDH, el ER marcador calnexin y el marcador mitocondrial Tomm20 en S. fagosomas de typhimurium aisladas en 30 min y 4 h post-infección fueron analizados por immunoblotting y en comparación con las correspondientes fracciones citosólicas. 20 μg de proteína fueron cargados por muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis microscópico de GFP -S. aureus infectaron macrófagos. BMDMs fueron infectados por S. aureus que expresan la proteína fluorescente verde (GFP) etiquetado wibiotina de TH como se describe en la metodología para el etiquetado de S. typhimurium. Después de permitir que los macrófagos que fagocitan las bacterias durante 30 minutos, las células fueron fijadas. Sin recubrimiento de S. aureus ("no biotinilado S. A.") se utilizaron como control negativo. Después de la fijación y permeabilización de las células, las muestras se incubaron con Cy5-estreptavidina durante 20 min a 4 ° C. La señal fluorescente del núcleo (DAPI), GFP -S. aureusy Cy5-estreptavidina se analizaron por microscopia confocal. Sólo se veía la señal de Cy5-estreptavidina en las bacterias previamente marcadas con biotina, confirmando la Biotinilación eficiente. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Análisis de los marcadores endosome y lisosoma en aislado S. aureus-que contienen fagosomas. S. aureus-que contienen fagosomas aislados en 30 min y 2 h post-infección de 4 h, se analizaron mediante immunoblotting para marcadores phagosomal Rab5 y Rab7 v-ATPase en comparación con las correspondientes fracciones citosólicas. 20 μg de proteína fueron cargados por muestra. Muestras también fueron probadas con un anticuerpo específico contra GAPDH, demostrando que aislado S. aureus-fagosomas que contienen están libres de contaminación citosólica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un nuevo método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos se describe aquí. Después de la interrupción de la membrana celular suave, fagosomas que contienen bacterias pueden ser fácilmente extraídos mediante una rejilla magnética. Demostramos que el etiquetado de las bacterias conserva la capacidad del patógeno para inducir inflamación y no altera la propiedad fagocítica de la célula huésped. Lo importante, fagosomas obtenidos por este método se enriquecen en la bacteria y el lisosoma/endosome marcadores y carentes de contaminación citosólica.
Este método presenta varias ventajas en comparación con el método de aislamiento de fagosoma tradicional que emplea la separación gradiente de sacarosa. Elimina el tiempo múltiples pasos de centrifugación, permitiendo al investigador manejar muestras más en menos tiempo y obtener muestras más puras de fagosoma fácilmente aumentando el número de pasos de lavado. El uso de este protocolo elimina la necesidad de equipos especializados y sensibles, como la ultracentrifugación. Centrifugación de alta velocidad podría alterar las características de las vesículas y reducir el rendimiento final22, que se evita en este protocolo. También hemos demostrado que la capa de S. typhimurium y bolas magnéticas conjugado estreptavidina-biotina no altera la capacidad fagocitaria de los macrófagos. Por otra parte, la inducción de IL-6 por los macrófagos infectados con etiqueta S. typhimurium fue inalteradas comparado con macrófagos infectados con bacterias sin etiqueta. Por lo tanto, la capa de S. Typhimurium no induce cambios significativos en su patogenicidad. A nuestro conocimiento, capa de S. typhimurium no representa un impedimento para el uso de los fagosomas aislados de cualquiera de las técnicas de análisis comunes de laboratorio.
S. typhimurium-fagosomas que contienen aislados por este método son enriquecidas en bacterias y endosomal típico presente y marcadores lisosomales, tales como el v-ATPase subunidades V0 y V1 y la proteasa madura troceada catepsina D, que puede ser detectada solamente en las fracciones aisladas del fagosoma. Además, encontramos las mitocondrias y los marcadores de ER en aislados S. typhimurium-que contienen fagosomas. Interacción de los fagosomas con ER ha sido ampliamente estudiada aunque la cantidad de proteínas de la ER en fagosomas que contienen el patógeno pueden variar con el patógeno estudiado y el tipo de célula. Por ejemplo, los fagosomas que contienen muévedo de Brucella aisladas de fagocitos no profesionales son ricos en ER marcadores23 pero no los de macrófagos24. Calnexin ha sido previamente detectado en S. Fagosomas que contienen typhimurium aislados por gradiente de sacarosa18. Estrecha interacción de fagosomas que contienen grano inertes y las mitocondrias también ha sido previamente reportado25, explicando la presencia de Tomm20 en fagosomas aislados. Se han encontrado proteínas mitocondriales en fagosomas aislados que contiene26 de la L. pneumophilao Mycobacterium27. Sin embargo, la detección de componentes de las mitocondrias en los preparativos de los fagosomas que contienen el patógeno aislados mediante el método de centrifugación del gradiente de sacarosa a menudo ha sido creída para ser debido a la densidad similar de este orgánulo y la fagosoma que contiene el agente patógeno y, por tanto,28. Nuestro método evita un problema de contaminación y proporciona información más confiable, lo que sugiere que las membranas mitocondriales podrían mezclarse con la membrana phagosomal. En Resumen, será difícil evitar ER y marcadores mitocondriales en que contienen el patógeno aislado preparaciones de fagosomas, dependiendo del tipo de célula del anfitrión y el patógeno. El método recomendado para la verificación de la pureza de los fagosomas aislados es utilizar bacterias etiquetadas y anticuerpos de etiqueta específica para la detección de bacterias por Western Blot. También mostramos que este método de aislamiento puede ser adaptado para otros microorganismos con grupos de Amina superficie disponible que pueden ser biotinilado. Como ejemplo, hemos aplicado con éxito nuestro protocolo para aislar S. aureus-que contienen fagosomas. Fagosomas que contienen S. aureus aislados mediante este protocolo se enriquecen en el lisosoma y endosome marcadores como la v-ATPasa (subunidad de0 V) y Rab7, respectivamente, pero no presentan marcadores citosólicas como GAPDH.
Endosomal/phagosomal vesículas proporcionan entornos únicos para la degradación de patógenos y preservar los antígenos para la señalización del sistema inmune adaptativo. Aunque, fagosomas y el proceso de maduración han sido ampliamente investigados, el microambiente en el fagosoma sobre hosting varios patógeno sigue siendo elusivo. Es también confuso cómo cambios metabólicos en las células alteran la maduración del fagosoma y su contenido. Por lo tanto, el protocolo detallado aquí da más oportunidades para el estudio de la biogénesis del fagosoma y su función en el contexto de diversas patologías.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Investigación en laboratorio de Robinson es apoyada por fondos de Colonia Cluster de excelencia en las respuestas de estrés celular en enfermedades Aging-Associated, Universidad de Colonia, Alemania (CECAD; financiado por el DFG dentro de la iniciativa de excelencia de la federal alemana y los gobiernos del estado) y becas de la Fundación Maria-Pesch de la Universidad de Colonia, Alemania, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) y fortuna Köln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
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