Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes

Resumen

Microscopía lente libre de vídeo nos permite supervisar cultivos celulares directamente dentro de la incubadora. Aquí describimos el protocolo completo utilizado para adquirir y analizar una adquisición largo 2,7 días de cultivos de células HeLa, conduce a un conjunto de datos de 2.2 x 10⁶ mediciones de morfología de la célula individual y ciclo celular 10584 pistas.

Resumen

Aquí, demostramos que video gratis lente microscopía nos permite capturar simultáneamente la cinética de miles de células directamente dentro de la incubadora y que es posible supervisar y cuantificar las células a lo largo de varios ciclos de la célula. Describimos el protocolo completo usado para monitorear y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. En primer lugar, se realiza adquisición de cultura de célula con un microscopio de lente-libre de vídeo, y luego los datos son analizados siguiendo un proceso de cuatro pasos: detección de segmentación y división celular de celular rastreo de celular, reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, algoritmos. Como resultado, mostramos que es posible reunir un conjunto de datos cuenta con más de 10.000 pistas de ciclo celular y las mediciones de más de 2 x 10⁶ células morfológica.

Introducción

Monitoreo de células de mamíferos cultivadas a lo largo de varios ciclos de la célula y medir con precisión la célula tamaño y célula masa seca es una tarea difícil. Varias técnicas de etiqueta-libre ópticas son capaces de realizar esta tarea^1,2: desfasaje interferometría³, microscopia holográfica digital (DHM)^{4,5,6, 7}, quadriwave lateral corte interferometría^8,9 y fase cuantitativa tomografía^10,11. Estos métodos han conducido a muchas nuevas perspectivas en la comprensión del ciclo celular de células de mamíferos. Sin embargo rara vez se juntan con algoritmos de seguimiento automático de la célula y su rendimiento sigue siendo limitada cuando medición de células trayectorias masa¹ (N < 20 respectivamente^{3,4,5 , 6}). por lo tanto es necesario un novedoso método óptico para medir trayectorias masa celular con estadísticas grandes (N > 1000).

En este trabajo demostramos la capacidad de microscopía lente libre de vídeo imagen simultáneamente miles de células directamente dentro de la incubadora, y luego cuantificar métricas de unicelular a lo largo de miles de pistas de cada ciclo celular. Lente libre la microscopia es una fase cuantitativa, técnica que permite la adquisición de la imagen de la fase de células densamente sobre un gran campo de visión de la proyección de imagen (normalmente varias decenas de mm², aquí 29,4 mm²)^{12,13 ,14,15}. Se determinan varias métricas a nivel unicelular, por ejemplo, área de la célula, celular de masa seca, espesor de célula, célula eje mayor longitud y proporción^12,15, de cada imagen de la célula. Luego, mediante la aplicación de un algoritmo de seguimiento de la célula, se pueden trazar estas características para cada célula individual en función del experimento tiempo^14,15. Además, mediante la detección de la ocurrencia de divisiones celulares en las pistas de la célula, es posible extraer información importante tales como la celda inicial seca masa (justo después de la división de célula), la masa seca de la célula final (justo antes de la división de célula) y la célula ciclo de duración, es decir, el tiempo entre dos divisiones consecutivas¹⁵. Todas estas mediciones se pueden computar con muy buenas estadísticas (N > 1000) ya que el gran campo de visión por lo general permitiría el análisis de 200 a 10.000 células en una sola adquisición libre de lentes.

Para explicar esta metodología basada en microscopía lente libre de vídeo, se describe el protocolo para controlar y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. Análisis de datos es un proceso de cuatro pasos, basado en reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, seguimiento de células, segmentación de la célula y algoritmos de la división celular. Aquí se demuestra que la resolución espacial y la velocidad de fotogramas relativamente rápido (una adquisición cada 10 minutos) con esta configuración de microscopía lente libre de vídeo es compatible con estándar algoritmos de seguimiento de la célula. El análisis completo de este conjunto de resultados en la medición de 10.584 celular pistas sobre ciclos celulares completos.

Para resumir, microscopía lente libre de vídeo es una herramienta poderosa para monitorizar automáticamente miles de sincronización, sin etiqueta y sin modificar las células por experimento; cada célula rastrean varios ciclos de la célula. Nuestras mediciones ofrecen el valor medio de varios parámetros de la celda, pero más importante aún, la variabilidad inter-célula sobre una gran población de células.

Protocolo

1. célula cultura control adquisición

1. Cultivar células HeLa en DMEM + glutamina (p. ej., GlutaMAX) suplementado con 10% (v/v) ternera fetal inactivado por calor del suero y el 1% penicilina y estreptomicina.
2. Capa 6-pozo cristal placas inferior con fibronectina (25 μg/mL) durante 1 hora. Entonces la semilla 2 x 10⁴ células por pocillo.
3. Durante la adquisición, cambiar el medio cada 3 días.
4. Para la adquisición de Time-lapse, utilizar el microscopio lente gratis video (disponible comercialmente).
   Nota: Esto se basa en la técnica de imagen Computacional libre lente descrito por Ozcan et al. ¹⁶ que fue modificado para llevar a cabo un monitoreo continuo en una incubadora a una temperatura controlada de 37 ° C^12,15. Cuenta con un sensor de imagen de semiconductor (CMOS) de óxido de metal complementario con una echada del pixel de 1,67 μm y una superficie de proyección de imagen de 6.4 x 4.6 mm². Múltiples de longitud de onda iluminación es proporcionada por un multichip luz emitiendo diodo (LED) dispositivo que proporciona iluminación de roja, verde y azul. Las longitudes de onda están centradas, en 636, 521 y 452 nm respectivamente, con un ancho de banda espectral de 25, 45 y 25 nm respectivamente. El rojo, verde y azul (RGB) LED se encuentra por encima de una 150 μm del agujero de alfiler a una distancia de aproximadamente 5 cm de las células. La potencia de luz mide cerca de lo LED es tan baja como 10 μW en cada longitud de onda y el tiempo de iluminación es sólo un segundo por adquisición. Por lo tanto, no hay problemas de toxicidad de la foto esperan cuando cultivos de células se observan bajo el microscopio lente libre de vídeo.
5. Poner el contenedor de la cultura de célula ponerse en contacto con el sensor CMOS (figura 1). Utilice un recipiente con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior, que es importante para la calidad de la adquisición gratuita de lentes. También pueden utilizar envases de plástico pero se degradará la adquisición libre de lentes debido a la mala calidad óptica de estos contenedores.
6. Control de video gratis lente de microscopio con el software de adquisición (disponible comercialmente), que realiza la adquisición de Time-lapse y la reconstrucción holográfica. Los parámetros que necesitan ser introducidos por el usuario en la interfaz del software son la velocidad de fotogramas, la duración de la experiencia y el tipo de cultivo celular, células por ejemplo, adherentes o flotante.
7. Establecer los parámetros de software de adquisición de la entrada. Establecer la velocidad de fotogramas establece que una adquisición cada 10 minutos y el tipo de cultivo celular en 'adherente'.
   Nota: Una velocidad de adquisición de una cada 10 minutos es un buen compromiso, como asegura un celular confiable de seguimiento mientras que el tamaño del conjunto de datos resultante a analizar es todavía razonable. La velocidad de fotogramas más rápida con esta configuración de microscopía lente-libre es una adquisición cada 5 minutos. Aumentando la velocidad de fotogramas se traduce en calentamiento del sensor CMOS que puede afectar la viabilidad de las células en cultivo.
8. Iniciar la adquisición de Time-lapse, y el algoritmo de reconstrucción holográfica (disponible comercialmente) procesará automáticamente la adquisición gratuita de lentes para obtener la imagen de la fase de cultivo celular. El algoritmo de reconstrucción holográfica se basa en una onda fase recuperación algoritmo¹⁷ y proporciona una imagen de fase reconstruido de RGB en el rango de [-π, + π] para cada celda individual en un gran campo de visión de 29,4 mm². El principio de la holografía en línea libre de la lente es iluminar una muestra delgada (en z = 0) con una onda de plano (de amplitud 1 después de normalización) y detectar en un sensor CMOS de la imagen de la intensidad de difracción posterior a una corta distancia z = Z, normalmente 1 mm después de la muestra. En nuestra configuración, la iluminación se conecta secuencialmente a 3 longitudes de onda (λ₁= 0.450 μm, λ₂= 0.540 μm, λ₃= 0,647 μm) para medir tres patrones de difracción de la muestra misma.

2. célula cultura análisis de datos

1. Para el rastreo de celulares, utilizan el algoritmo Trackmate, un plugin de Fiji de código abierto para el seguimiento automatizado de partículas solo¹⁸. En cargar en primer lugar, la adquisición completa de Time-lapse en Fiji (comando de secuencia de imagen de carga). Debido al gran tamaño de los conjuntos de datos, que incluye típicamente 400 marcos de RGB de 29,7 Mb, es más rápido cargar en formato de 8 bits. A continuación el plugin Trackmate Fiji guía al usuario a través de varias etapas del algoritmo de rastreo de celulares, es decir, una etapa de detección de células, una etapa de rastreador de celulares y varios filtros aplicados a las detecciones de la célula y las pistas computadas. En cada etapa, configurar los algoritmos y ver los resultados inmediatamente para que, si es necesario, uno puede fácilmente navegar hacia adelante y hacia atrás para reajustar la configuración. Los distintos menús de la interfaz Trackmate se muestran en la figura 2 con los ajustes reales utilizados para el experimento de las células HeLa.
2. Establecer los parámetros de software de adquisición de la entrada como la siguiente (ver figura 2). Establece el diámetro de gota estimada en 15 píxeles, el umbral del detector a 0.25, la distancia máxima de enlace en 15 píxeles, la distancia máxima de cierre de la brecha a 15 píxeles y el número de puntos en las pistas a 3.5.
   Nota: Estos valores obviamente serán diferente de un experimento a otro, especialmente el 'blob Estimado diámetro' que se corresponde con el tamaño de la celda (aquí dado en píxeles de 1,67 μm). La misma observación se aplica a la 'distancia máxima vinculación' que representan la distancia máxima recorrida por una celda de dos fotogramas consecutivos (aquí dada en píxeles de 1,67 μm). Su valor óptimo dependerá de motilidad celular sino también de la densidad celular.
3. Al final del proceso de seguimiento de la célula, genera los resultados en forma de tres archivos de texto ('Análisis' botón, ver figura 2). El archivo más útil, denominado estadísticas de pistas puntos, consiste en una tabla todo detectadas células con sus posiciones respectivas (x, y) en la adquisición, su número y su número de pista. Sobre la base de datos, realizar segmentación de células y detectar divisiones celulares utilizando algoritmos dedicados (ver archivos de código complementario). Los dos archivos se denominan 'Enlaces en las estadísticas de pistas' y 'Pista estadísticas' y son todos los resultados relacionados con pistas, por ejemplo, duración de la pista, número de deficiencias detectadas, pista marco inicial, etcetera.
4. Utilizar el algoritmo de segmentación de la célula (véase código complementario archivo) para extraer automáticamente varias métricas que describen la morfología de la célula de la imagen de la fase de reconstrucción. Estas métricas son la superficie de la célula (S), la longitud del eje mayor de la célula (L), la longitud del eje menor de la célula (l) y la relación de aspecto de la célula (L/l). La fase de microscopía lente libre es proporcional a la densidad y el espesor de la capa de la muestra según lo discutido previamente¹⁵.
5. Además de las características morfológicas de la célula, extracto seco medidas de (MDL) masa celular cuantitativa de la fase reconstruido^13,19,20
   Ecuación (1)
   donde φ(x,y) es el cambio de fase reconstruido¹⁹, λ la longitud de onda y α = 1,8 x 10^-4 m³/kg el índice de refracción específico relacionado con la variación del índice de refracción para secar la masa^{1, 19}.
6. Evaluar el espesor de la célula mediante una estimación de la diferencia entre el índice de refracción de la célula y de los medios de cultivo. Se da la relación entre la célula de espesor h(x,y) y el desplazamiento de fase medido por²⁰:
   Ecuación (2.1)
   Ecuación (2.2)
   Δn(x,y) = nde la_celda (x,y) - _medio de n (x,y), la diferencia de índice de refracción entre la célula y los medios de cultivo. En el siguiente, asume un valor constante de Δn = 0.025, que se calcula por el índice de refracción medido en los núcleos de célula HeLa (n = 1.355¹¹) y la de medios de cultivo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (n = 1.33). Aunque el valor de espesor de célula es sólo indicativo ya que se basa en una asunción, sus variaciones relativas son significativos y pueden ser aprovechados para detectar células divisorias.
7. Utilizar el algoritmo dedicado (ver código complementario archivo) para detectar la ocurrencia de divisiones celulares y luego extraer las pistas de células que se asocian a las divisiones de célula detectadas, con el fin de detectar una división de célula, las células con un espesor medido más grande que 8 μm primero se identifican a continuación, compruebe si una nueva célula aparece estrechamente en espacio y tiempo. De esta manera, la detección de las divisiones de célula se basa en dos criterios robustos. Alternativas y métodos más elaborados para la detección de la división de célula pueden aplicarse a la adquisición de Time-lapse de lensfree^21,22,23.

Resultados

Para el proceso de reconstrucción holográfica, el campo de la luz se describe por un campo escalar A (donde es el complejo valor de A en el plano de la distancia z de la posición de la muestra y el lateral y en la longitud de onda λ). Propagación de la luz es modelada por la teoría de Huygens-Fresnel que proporciona un núcleo pr...

Discusión

En este trabajo, mostramos que microscopía lente libre de vídeo puede utilizarse dentro de una incubadora para capturar la cinética de miles de células. Para describir la metodología global nos explicó cómo una adquisición de Time-lapse de 2,7 días de células HeLa en cultura puede ser analizada con algoritmos estándar de seguimiento de la célula. El resultado es un conjunto de datos con 2,2 x 10⁶ células medidas y 10.584 pistas de ciclo celular. Las adquisiciones se realizaron en un cultivo de células Hela con...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio de vídeo sin lentes Cytonote	Iprasense
Horus Placas	vidrio Iprasense
de 6 pocillos	Corporación MatTek Nº	pieza: P06G-0-14-F
DMEM + GlutaMAX medio	Gibco
	Eurobio
penicilina y estreptomicina	Gibco
Fibronectina	Sigma Aldrich
Matlab, caja de herramientas de procesamiento de imágenes	Obras