Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura

Resumen

En el manuscrito, describimos el uso de un análisis de reportero de fluorescencia basada en levadura a identificar componentes celulares implicados en la trata de personas y matar procesos de los citotóxicos a una subunidad de la ricina toxina de planta (RTA).

Resumen

Bacteriana y planta A / toxinas B explotan las vías de tráfico naturales en las células eucariotas para llegar a sus destinos intracelulares en el citosol y en última instancia matar. Tal A / toxinas B consisten en generalmente un enzimático activo Asubunit (p. ej., toxina de ricina (RTA)) y una o más células enlace Bsubunit(s), que es responsables de toxina vinculante específico para receptores de superficie celular. Nuestro conocimiento actual de cómo A las toxinas B son capaces de intoxicar eficientemente células ayudó a los científicos para entender los mecanismos celulares fundamentales, como la endocitosis y la proteína intracelular clasificación en células eucariotas superiores. Desde un punto de vista médico, asimismo es importante identificar las rutas de tráfico principales toxina para encontrar soluciones de tratamiento adecuada para pacientes o para eventualmente desarrollar aplicaciones terapéuticas de toxina para terapia del cáncer.

Desde el análisis del genoma del tráfico en células de mamíferos la toxina B es complejo, lento y caro, varios estudios sobre una / transporte de la toxina B han llevado a cabo en el organismo del modelo de la levadura Saccharomyces cerevisiae. A pesar de ser menos complejos y fundamentales procesos celulares de levadura y las células eucariotas superiores pueden transferirse a la situación mamífera son similares y muy a menudo los resultados obtenidos en la levadura.

Aquí, describimos un análisis reportero rápido y fácil de utilizar para analizar el tráfico intracelular de RTA en la levadura. Una ventaja esencial de la prueba de nuevo es la oportunidad para investigar no sólo retro-desplazamiento de RTA desde el retículo endoplásmico (ER) en el citosol, pero algo endocitosis y toxina retrógrada transportan de la membrana del plasma en la sala de emergencia. El ensayo hace uso de un plásmido reportero que permite una medición indirecta de la toxicidad de la RTA a través de emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) después de la traducción en vivo . Como RTA eficientemente previene la iniciación de la biosíntesis de la proteína por 28S rRNA depurinación, este ensayo permite la identificación de proteínas de la célula huésped involucrado en el transporte intracelular de RTA a través de la detección de cambios en la emisión de fluorescencia.

Introducción

Pacientes que sufren de infecciones por bacterias de producir la toxina representan una grave carga médica y financiera para cada sistema de salud social, en particular tratamientos terapéuticos eficaces son todavía en gran parte desaparecidos. Desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, los mecanismos complejos de la intoxicación del médicamente relevante A las toxinas B como la toxina del cólera, Shiga toxina ricina necesita ser entendido completamente a nivel molecular basado en ensayos poderos novela que deben aplicarse.

En los últimos años, varios estudios intentaron analizar A / transporte de la toxina B en levaduras y células de mamíferos mediante métodos desperdiciadores de tiempo y costosa como toxina radiactivo etiquetado^1,2 , así como basado en el siRNA se acerca a³. En algunos casos, trata de la toxina ha sido visualizado en vivo por microscopía de fluorescencia después de acoplamiento químico o genética de subunidades de la toxina individual con fluoróforos, puntos cuánticos o proteínas fluorescentes^4,5. Por desgracia, tales modificaciones conducen a menudo a propiedades naturales inactivadas o alteradas de las toxinas. Otra forma elegante de responder indirectamente a una amplia variedad de cuestiones científicas es el uso de sistemas de reportero basados en enzimas como lacZ, luciferasa o proteínas fluorescentes (e.g. GFP o Discosoma sp. (proteína fluorescente roja dsRed)).

En este manuscrito, se describe un protocolo simple que identifica los componentes celulares necesarios para el transporte intracelular de RTA aplicada extracelularmente en S. cerevisiae. Por lo tanto, un plásmido reportero de fluorescencia que contiene una señal N-terminal ER-import seguida de GFP actúa como un sensor de la biosíntesis de proteína, que indirectamente mide la inhibición de la traducción de RTA-mediado proteína GFP fluorescencia emisión después de la en vivo traducción⁶. En caso que endocitosis RTA o tráfico intracelular negativamente (o positivamente) sufre en un mutante de levadura especial eliminación en comparación con el tipo salvaje, esto se puede detectar a través de un aumento (o disminución) en la fluorescencia de GFP emisión⁶.

Hasta ahora, todos los métodos de análisis de transporte de RTA en células de levadura fueron restringidos en el proceso de retro-desplazamiento ER al citosol de RTA. En un sistema tan artificial, que contiene una señal de importación ER RTA se expresa de un promotor inducible, resultando en un fenotipo suicida^1,7. Aunque la célula Unión subunidad B de ricina es además que falta en la configuración experimental descrita en este manuscrito y, por lo tanto, no totalmente representa la situación natural de ricina holotoxin intoxicación⁸, transporte de la toxina del plasma membrana a través del aparato de Golgi al ER puede mímico de cerca con este ensayo novela. Curiosamente, los resultados preliminares obtenidos en el estudio piloto indican que las vías de tráfico utilizadas por RTA revelan similitudes sorprendentes con la ruta de intoxicación de ricina holotoxin.

En Resumen, el método descrito puede ser utilizado para determinar el papel específico de las proteínas celulares en endocitosis RTA y trata de levadura. Además, este montaje experimental podría ser fácilmente adaptado a otro ribosoma inactivar las toxinas producida y secretada de diversas levaduras y especies bacterianas como zymocin o toxina Shiga.

Protocolo

Nota: Un resumen del flujo de trabajo experimental general se representa en la figura 1.

PRECAUCIÓN: RTA es altamente tóxica para los seres humanos. Se necesita permiso de laboratorio de seguridad S2 (bioseguridad nivel 2 equivalente). Favor de utilizar guantes durante todo el experimento.

1. la expresión heteróloga de su etiquetado RTA en Escherichia coli

1. Transformar las células de e.coli con el plásmido de expresión pET24-RTA_{(su) 6} o el vector vacío pET24a⁽⁺⁾ usando electroporación estándar protocolos^9,10. Las células que contienen el plásmido vacío sirven como control negativo.
2. Después de la selección de clones positivos en placas de LB (100 μg/mL) que contiene kanamicina, inocular las células que contienen el plásmido de expresión de la RTA o el vector vacío en medio de_kan 5 mL LB (medio LB con 100 μg/mL de kanamicina) e incube a 37 ° C y 220 rpm por 24 h.
3. Suplemento 1 LB de L_kan mediana con precultivo 5 mL e incubar las células a 37 ° C y 220 rpm hasta que las células han alcanzado un OD₆₀₀ de 0.8-1.0 (aproximadamente 3-4 h). Después de eso, reduzca la temperatura de cultivo a 28 ° C y preparar un 1 M de la solución madre de Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) de H₂O.
4. Inducen la expresión de la RTA de la e. coli añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM.
5. Después de 3,5 horas a 28 ° C y 220 rpm, cosecha las células por centrifugación a 10,000 x g y 4 ° C durante 10 minutos, lavar el pellet dos veces con 5 mL de tampón de unión (500 mM NaCl, imidazol de 10 mM y 20 mM KH₂PO₄ pH = 7.4) a 10.000 x g y 4 ° C por 10 min y resuspender pellet en 5 mL de tampón de Unión.
   Nota: Protocolo puede hacer una pausa en esta etapa y las células pueden almacenarse a 80 ° C por varios días.

2. purificación de su etiquetado RTA mediante cromatografía de afinidad

1. Someter a ultrasonidos las células en hielo utilizando el siguiente protocolo: pulso s 15 (20 micras), 30 de s de pausa. Repita este paso cinco veces.
2. Centrifugar células lisado en 21.000 x g y 4 ° C por 15 minutos y filtrar el sobrenadante utilizando un sistema de filtros de jeringa estériles (tamaño de poro de 0,2 μm).
   Nota: Pellets celulares de sonicación con éxito muestras muestran fronteras transparentes.
3. Utilizar un sistema automatizado de purificación con 5 mL Ni^{2 +}-basado en columna de afinidad para purificar la fracción de su etiquetado RTA de la estéril filtrada e. coli sobrenadante. En general, utilice una velocidad de elución de 1 mL/min y enfriar el sistema de purificación todo para evitar la Unión de la toxina no eficiente y pérdida de la actividad de la toxina.
   Nota: Los parámetros para la purificación eficiente de RTA se enumeran en la tabla 1. Véase también Becker et al. para más información⁹.
   1. Brevemente, equilibrar la columna de afinidad con 20 mL de tampón de Unión para eliminar el buffer de almacenamiento. Aplicar el sobrenadante estéril filtrado en la columna de afinidad utilizando una jeringa.
   2. Lavar la columna con 25-35 mL de tampón de Unión para eliminar las proteínas no Unidas de la columna. Realizar el paso de lavado hasta absorbancia UV a 280 nm es cercana al valor inicial de la UV.
   3. Eluir la fracción unida de la RTA en 20-35 mL de tampón de elución (imidazol de 500 mM, 500 mM NaCl, 20 m m KH₂PO₄, pH = 7.2) y mantener la muestra en hielo (figura 2A y figura 2B).
      Nota: Elución de la fracción de RTA se caracteriza por un aumento en la absorción de UV. Tenga en cuenta para recoger exclusivamente esta fracción para evitar la contaminación con proteínas encuadernadas no específicas.
   4. Utilice 20 μl de las muestras eluídas a cabo azul Coomassie tinción¹¹ o mancha blanca /negra occidental análisis^12,13 (opcional). Utilizar primaria contra su anticuerpos (1:1, 000) y secundaria anti-anti-ratón-IgG-HRP (1:10, 000) para detectar RTA y verificar la pureza de la muestra (figura 3).
   5. Eluídas fracción RTA en una columna de 5 mL desalación del desalt y equilibrar la muestra en 0,8 M sorbitol.
      1. Vuelva a colocar la columna de afinidad de sistema de purificación de la columna de la desalación y primero equilibrar la columna con 20 mL de sorbitol de 0,8 M.
      2. La fracción de RTA eluída se aplica a la columna por medio de una jeringa. Lavar la columna con 100 mL de sorbitol de 0,8 M y eluir la fracción RTA desalada en un tubo de 15 mL en cuanto a la absorción UV comienza a aumentar (figura 2).
      3. Almacenar la fracción RTA eluída a 4 ° C.
         Nota: Directamente deje de muestreo fracción de RTA cuando aumenta la conductancia para evitar la contaminación de sal. Parámetros para el procedimiento de desalación se enumeran en la tabla 1.
4. Concentrado de fracción de RTA eluída a 10.000 x g y 4 ° C por 30-180 min., usando una columna de giro de corte 10 kDa hasta un volumen final de 1-2 mL y almacenar la muestra a 4 ° C durante 3-4 semanas.
   PRECAUCIÓN: No congelar la muestra desde la congelación conduce a una pérdida completa de actividad de RTA.
5. Determinar la concentración de proteína usando un kit de determinación de la proteína convencional. Concentración de la proteína debe estar en el rango de 1-1.5 mg/mL.
   Nota: RTA tiende a precipitar si la concentración de proteína es muy alta (> 5 mg/mL).

3. transformación y eliminación de la pared celular de levadura

1. Transformar a mutantes de deleción de levadura salvaje o seleccionado con la GFP reportero plásmido pRS315-K28_SP- GFP⁶ utilizando acetato de litio estándar transformación métodos¹⁴. Incubar las células en el abandono de la leucina (d/o) placas de glucosa (glucosa 2%, agar 1,5%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% levadura nitrógeno Base (YNB) y 0.087% d/o mix sin leucina) a 30 ° C durante 2-3 días para la selección de clones positivos.
2. Escoger 3 clones de levaduras diferentes de cada placa y sembrar los clones en 100 mL de leucina d/o medio de rafinosa (rafinosa 2%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% d/o mezclar sin leucina) en 220 rpm y 30 ° C a OD₆₀₀ = 1.0-2.0 (2-4 x 10⁷ células/mL).
   Nota: El crecimiento de las células de las levaduras diferentes de eliminación es diferente. Monitor OD₆₀₀ mediante un espectrofotómetro.
3. Para calcular los valores de OD₆₀₀ , diluir las muestras a OD₆₀₀ = 0.1-0.3 (1:5 a 1:10 diluciones) y medir OD₆₀₀ en un espectrofotómetro. Como referencia, el uso de H₂O complementado con la correspondiente cantidad de medio de leucina d/o raffionose.

Por último, resuspender OD₆₀₀ = 125 en 5 mL de agua estéril (5 x 10⁸ células/mL).

Centrifugar las células a 25 ° C por 5 min a 10.000 x g, lave las células dos veces con 5 mL de agua estéril y resuspender las células en 50 mL de tampón de spheroplasting (sorbitol de 0,8 M, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl₂, 2 mM Ditiotreitol (DTT) y enzima lítica de 200 μg/mL).

Incubar el cultivo de 50 mL a 100 rpm y 30 ° C por 90 min opcional: Monitor formación spheroplast cada 15 min por microscopía de contraste de fase. Bajo el microscopio, las células deben tener un oscuro color gris translúcido. Células brillantes (refractile) son digeridas, mientras que fantasmas (gris pálido células con poco, si cualquiera, estructura interna) se digieren demasiado.

Comprobar eficacia de preparación spheroplast para cada muestra.

1. Después de terminar paso 3.5, 4 μL de la cultura spheroplasted 50 mL de la mezcla con 496 μl de tampón de spheroplasting (aproximadamente 2 × 10⁶ Esferoplastos) y centrifugar 10 min a 400 x g.
2. Pellets de resuspender en 10 mL de H₂O destilada, muestra de vortex por 30 s y placa 10 μl de la muestra en placas de glucosa de d/o leucina (glucosa 2%, agar 1,5%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% d/o mix sin leucina).
3. Incube las células durante 3 días a 30 ° C. Contar el número total de colonias de células crecidas en la placa. Para la evaluación de datos, utilizar sólo las muestras con eficiencia superior al 98% (total de número de la colonia de células < 40 colonias/placa).

Centrifugar las células de paso 3.5 a 400 x g y 4 ° C por 10 minutos y lavar las células dos veces con 5 mL estabilizado leucina d/o rafinosa medio (0,8 M sorbitol, rafinosa 2%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% mezcla de abandono sin leucina). Resuspender las células en medio de 5 mL leucina estabilizada d/o rafinosa (1 x 10⁸ células/mL) y utilizar directamente las células para las mediciones de ensayo reportero GFP (sección 4).

4. GFP reportero ensayo medida en placas de 96 pocillos

1. Semilla a los Esferoplastos de células de levadura obtenidas en el paso 3.7 en placas de 96 pocillos (200 μL/pocillo).
2. Añadir 70 μl leucina estabilizada d/o rafinosa de medio que contiene el control negativo (efluente de una Ni^{2 +}-afinidad purificado célula de lisado de células inducida por IPTG de e. coli expresando el vector vacío) o purificada RTA en una concentración final de RTA de 5 μm ( correspondiente a 160 g/L RTA) en cada pocillo.
3. Añadir 30 μL estabilizado galactosa solución (30% galactosa, sorbitol de 0,8 M) para inducir la expresión de GFP y posteriormente iniciar la medición.
   Nota: Realizar al menos 3 repeticiones técnicas por experimento y 3 biológicos Replica por cepa de levadura.
4. Después de terminar la preparación de la muestra (pasos 4.1-4.3), pone la placa de 96 pocillos en un lector de fluorescencia y comenzar la medición. Utilice el filtro de 475/509 nm sistema requerido para la detección de la fluorescencia de GFP. Realizar mediciones a 30 ° C, 120 rpm y con un diámetro de agitación de 1 mm sobre una ventana de tiempo de 20 h (medición de intervalos de 10 min).
   Nota: El conjunto de filtro GFP está normalmente disponible en todos los sistemas de lector. Temperatura, ventana de tiempo, medición de intervalos y la RTA concentración puede ajustarse a necesidades propias. Resultados representativos se muestran en la figura 4.
5. Opcional: Usar controles internos adicionales en la medida de control de calidad. Preparar un control negativo añadiendo medio rafinosa d/o 30 μl de leucina estabilizado en lugar de 30% galactosa (sin inducción de GFP). Además, añadir 70 μl de solución de 0,8 M sorbitol estabilizado G418 (300 μg/mL). El inhibidor de la proteína traducción G418 sirve como control positivo para la inhibición de la proteína impide la expresión de GFP en la levadura.
6. Calcular la fluorescencia de GFP relativa en porcentaje para el momento de 20 h según la siguiente ecuación (ver Figura 4A): donde NC es el control negativo
   1. Por otra parte, determinar la fluorescencia de GFP relativa para cada punto de medición (en este caso 10 min, véase también paso 4.4) utilizando la ecuación anterior. Como se muestra en la Figura 4B, crear un gráfico por borrar las intensidades de fluorescencia de GFP (eje y) con el tiempo (eje x).

Resultados

El flujo de trabajo general del protocolo descrito en este manuscrito se ilustra en la figura 1, más o menos resumiendo los pasos solo para la purificación exitosa de RTA y el posterior experimento de ensayo de reportero GFP. Puede encontrarse una descripción más detallada de cada paso individual en el protocolo. La figura 2 ilustra el resultado esperado de una purificación exitosa de RTA por cromatografía de afinidad (

Discusión

Cuando se realiza el protocolo anterior, recomendamos las siguientes sugerencias para lograr un resultado exitoso del experimento.

Para la expresión de proteínas heterólogas, es importante no exceder la concentración de 1 mM IPTG. Concentraciones de IPTG > 1 mM inhibir expresión de RTA inducida por el promotor y plomo para bajar rendimientos de toxina. Además, las células no deben ser cultivadas a temperaturas superiores a 28 ° C para evitar la formación de cuerpo de inclusión, plegable in...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cepas bacterianas y de levaduras
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000<
em>S. cerevisiae BY4742 deleción	mutantes Dharmacon	YSC1054	toda la colección
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Plasmidios utilizados en este protocolo
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250 enzima lítica USBio Z1000.250	para la pared celular se
medio de caldo LB	Thermo Scientific	10855021	15 g de agar para la producción de placas
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Sulfato de amonio	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Mezcla de levadura sin leucina	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-rafinosa	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactosa	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazol	Roth	3899.1
PAGE regla preteñida Fermentas		26616	escalera de proteínas utilizada para el análisis occidental
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Material para la purificación de RTA, la desalinización y las mediciones del lector
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		modelo antiguo, otros modelos disponibles
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	modelo antiguo, ya no está disponible
& Auml; KTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	El producto se suspende y se sustituye
HisTRAP Columna HP	GE Healthcare	17-5248-02
Columna de desalinización HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart filtro estéril	Sartorius	16534K	0.2 µ m tamaño de poro
kit de ensayo de proteínas BCA	Pierce	23225
kit de ensayo de 660 nm	Thermo Scientific	22660
placas de 96 pocillos	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Número de catálogo	Comments
(opcional)
Tetra-His	Qiagen	34670	; dilución 1:1.000
Anticuerpo secundario Anti-HRP Sigma-Aldrich		A9044-2ML	, dilución 1:10.000