Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

Rinat Arbel-Goren; Yonatan Shapira; Joel Stavans

doi:10.3791/56600

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Artículo de método

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

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DOI:

10.3791/56600

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21 de diciembre de 2017

Rinat Arbel-Goren¹ , Yonatan Shapira¹ , Joel Stavans¹

¹Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.

Resumen

Se describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) en bacterias fijadas para uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH permite la medición de la variabilidad de la célula a célula en número de copias de ARNm de genes de interés, así como la localización subcelular de las transcripciones. Los pasos principales son la fijación de la cultura de la célula bacteriana, permeabilización de las membranas celulares e hibridación de las transcripciones de destino con juegos de sondas de oligonucleótidos de marcada con fluorescencia corto disponible en el mercado. smFISH permite la proyección de imagen de los transcritos de genes múltiples en la misma celda, con las limitaciones impuestas por el solapamiento espectral entre diferentes marcadores fluorescentes. Después de completar el protocolo que se ilustra a continuación, las células pueden ser fácilmente reflejadas utilizando un microscopio juntado con una cámara adecuada para baja intensidad de la fluorescencia. Estas imágenes, junto con contornos celulares obtenidos de segmentación de los marcos de contraste de fase o de coloración de la membrana de la célula, permiten el cálculo de la distribución número de copia de ARNm de una muestra de las células utilizando el software de la abrir-fuente o medida. El método de etiquetado descrito aquí puede aplicarse también a las transcripciones de la imagen con microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta).

Introducción

La estocasticidad es un aspecto fundamental e inevitable de la expresión génica y da lugar a la célula heterogeneidad¹, tanto a nivel de transcripción y proteínas²^,³. Cuantificación de la variabilidad entre las células bajo condiciones bien definidas ofrece una ventana única en los procesos básicos que subyacen a su regulación y expresión génica. Una fuente importante de heterogeneidad de la célula en bacterias ocurre a nivel transcripcional. Transcripción de números varían no sólo por la estocasticidad de transcripción, sino también a procesos regulación postranscripcional de small RNA....