Este protocolo describe un método para determinar proteína vida media en las células adherentes vivas sola, con pulso de etiquetado e imagen Time-lapse de fluorescencia complemento etiqueta de proteínas de fusión.
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Artículo de método
Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteínas están en un estado dinámico de la síntesis y degradación y su vida media se pueden ajustar bajo diversas circunstancias. Sin embargo, más utilizados enfoques para determinar la vida media de la proteína pueden ser limitadas a medias de la población de las células sometidas a lisis o requieren el uso de inhibidores de la síntesis de proteínas. Este protocolo describe un método para medir la proteína vida media en las células adherentes solo vivas, utilizando proteínas de fusión SNAP tag en combinación con Time-lapse de microscopía de fluorescencia. Cualquier proteína de interés unida a una etiqueta de cierre puede ser covalentemente por, célula permeable colorante fluorescente que se une a un derivado de benzylguanine, y el decaimiento de la población proteínas etiquetados puede controlarse después de lavado del tinte residual. Celda posterior seguimiento y cuantificación de la intensidad de fluorescencia integrada por los resultados del tiempo en una curva de decaimiento exponencial para cada celda de orugas, lo que permite determinar las tasas de degradación de proteínas en las células por ajuste de curvas. Este método proporciona una estimación de la heterogeneidad de la vida media de una población de células cultivadas, que no se puede evaluar fácilmente por otros métodos. El enfoque presentado aquí es aplicable a cualquier tipo de cultivos de células adherentes expresando una proteína de interés unida a una etiqueta de cierre. Aquí utilizamos células madre embrionarias (ES) de ratón cultivadas en placas de cultura de E-cadherin-revestida de la célula para ilustrar cómo única degradación celular tipos de proteínas con una amplia gama de vida media pueden ser determinadas.
Introducción
Es bien sabido que las proteínas celulares someterse a rotación extensa, con tasas de síntesis y degradación es específica para cada proteína y conforme a la regulación fisiológica. Tradicionalmente, las tasas de degradación de proteína han sido medidos utilizando métodos a granel, tales como el análisis de chase de pulso radiactivo, ni recurrir a inhibidores de la síntesis de proteínas como la cicloheximida1. Más recientemente, Isótopo estable que etiqueta con aminoácidos en cultura de célula (SILAC) en combinación con la espectrometría de masas se ha establecido para cuantificar el volumen de la proteína en una escala global....
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Protocolo
Nota: En este estudio, se utilizó la línea celular de E14 ES. Sin embargo, este protocolo es directamente aplicable a cualquier otra línea de células de ratón ES expresar una proteína de interés unida a una etiqueta de cierre, ya sea por selección de la proteína endógena o con sobreexpresión. Para los ejemplos mostrados en la sección de resultados, se utilizaron líneas de células de fusión de SNAP tag doxiciclina-inducible (SNAP-etiqueta unida a las proteínas siguientes: Oct4, Nanog, Srsf11, o a las proteínas fluorescentes mOrange2 y sfGFP y puesto bajo el control de un promotor inducible por la doxiciclina. Ver11 para obtener más información s....
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Resultados
El protocolo descrito proporciona una estimación de la variabilidad de célula a célula en Half-Life para cualquier proteína dada sobre una etiqueta de cierre. El uso de E-cadherin-Fc recombinante para el recubrimiento de la placa de imagen permite resolución de célula en células madre embrionarias, que crecen en colonias. Las células pueden ser rastreadas por separado en el transcurso de la película ( figura 1A).
Para determinar la vida media de proteínas de cada .......
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Discusión
El paso más crucial cuando se utiliza una etiqueta de cierre para controlar la descomposición de la proteína asegurar que ningún tinte residual queda en el medio o en las células después del lavado, como si no lo puede enlazar a recién producido moléculas de complemento etiqueta más adelante en el curso de la experiencia y compromiso la curva de decaimiento de la Eby. Se trata por un lado logrado realizando cuidadosamente todos los pasos de lavado descrito. Por otro lado, la concentración de tinte se debe mantener tan ba.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Se realizaron experimentos de microscopía de Time-lapse en la Biomolecular Screening Facility (BSF), EPFL. Agradecemos a Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) para la grabación y edición de la película.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| de Corning | 353219 | ||
| Marienfeld-superior | 640030 | ||
| Incubadora de CO2 | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrífuga 5804 | R Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Sistema de imágenes celulares | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Número de catálogo | >Comentarios |
| >Reactivos | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Suero fetal bovino, calificado para células madre embiónicas | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Solución de piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Medio Esencial Mínimo Aminoácidos no esenciales | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicilina-Estreptomicina | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamina 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Factor inhibidor de la leucemia | - | - | Producido en el laboratorio por transfección transitoria de células HEK-293T, seguida de recolección y filtrado del sobrenadante. |
| CHIR99021 (Inhibidor de GSK-3 XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatina de piel de bovino | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| PBS de Dulbecco 10x concentrado | BioConcept | 3-05K00-I | |
| PBS de Dulbecco sin Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Solución de tripsina-EDTA 0,25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Ratón recombinante E-Cadherina Fc Proteína quimera | R& Sistemas D | 748-EC-050 | |
| Hicalato de doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | Nueva Inglaterra BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Nombre | Company | >Número de catálogo | Comentarios |
| Software | |||
| FIJI- | - | Software de análisis de imágenes de código abierto | |
| MATLAB R2014a | Mathworks-Microsoft | ||
| Excel | Microsoft | - |
Referencias
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P.
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Reimpresiones y permisos
