Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

Resumen

Este protocolo describe un método para determinar proteína vida media en las células adherentes vivas sola, con pulso de etiquetado e imagen Time-lapse de fluorescencia complemento etiqueta de proteínas de fusión.

Resumen

Las proteínas están en un estado dinámico de la síntesis y degradación y su vida media se pueden ajustar bajo diversas circunstancias. Sin embargo, más utilizados enfoques para determinar la vida media de la proteína pueden ser limitadas a medias de la población de las células sometidas a lisis o requieren el uso de inhibidores de la síntesis de proteínas. Este protocolo describe un método para medir la proteína vida media en las células adherentes solo vivas, utilizando proteínas de fusión SNAP tag en combinación con Time-lapse de microscopía de fluorescencia. Cualquier proteína de interés unida a una etiqueta de cierre puede ser covalentemente por, célula permeable colorante fluorescente que se une a un derivado de benzylguanine, y el decaimiento de la población proteínas etiquetados puede controlarse después de lavado del tinte residual. Celda posterior seguimiento y cuantificación de la intensidad de fluorescencia integrada por los resultados del tiempo en una curva de decaimiento exponencial para cada celda de orugas, lo que permite determinar las tasas de degradación de proteínas en las células por ajuste de curvas. Este método proporciona una estimación de la heterogeneidad de la vida media de una población de células cultivadas, que no se puede evaluar fácilmente por otros métodos. El enfoque presentado aquí es aplicable a cualquier tipo de cultivos de células adherentes expresando una proteína de interés unida a una etiqueta de cierre. Aquí utilizamos células madre embrionarias (ES) de ratón cultivadas en placas de cultura de E-cadherin-revestida de la célula para ilustrar cómo única degradación celular tipos de proteínas con una amplia gama de vida media pueden ser determinadas.

Introducción

Es bien sabido que las proteínas celulares someterse a rotación extensa, con tasas de síntesis y degradación es específica para cada proteína y conforme a la regulación fisiológica. Tradicionalmente, las tasas de degradación de proteína han sido medidos utilizando métodos a granel, tales como el análisis de chase de pulso radiactivo, ni recurrir a inhibidores de la síntesis de proteínas como la cicloheximida¹. Más recientemente, Isótopo estable que etiqueta con aminoácidos en cultura de célula (SILAC) en combinación con la espectrometría de masas se ha establecido para cuantificar el volumen de la proteína en una escala global^....

Protocolo

Nota: En este estudio, se utilizó la línea celular de E14 ES. Sin embargo, este protocolo es directamente aplicable a cualquier otra línea de células de ratón ES expresar una proteína de interés unida a una etiqueta de cierre, ya sea por selección de la proteína endógena o con sobreexpresión. Para los ejemplos mostrados en la sección de resultados, se utilizaron líneas de células de fusión de SNAP tag doxiciclina-inducible (SNAP-etiqueta unida a las proteínas siguientes: Oct4, Nanog, Srsf11, o a las proteínas fluorescentes mOrange2 y sfGFP y puesto bajo el control de un promotor inducible por la doxiciclina. Ver¹¹ para obtener más información s....

Resultados

El protocolo descrito proporciona una estimación de la variabilidad de célula a célula en Half-Life para cualquier proteína dada sobre una etiqueta de cierre. El uso de E-cadherin-Fc recombinante para el recubrimiento de la placa de imagen permite resolución de célula en células madre embrionarias, que crecen en colonias. Las células pueden ser rastreadas por separado en el transcurso de la película ( figura 1A).

Para determinar la vida media de proteínas de cada .......

Discusión

El paso más crucial cuando se utiliza una etiqueta de cierre para controlar la descomposición de la proteína asegurar que ningún tinte residual queda en el medio o en las células después del lavado, como si no lo puede enlazar a recién producido moléculas de complemento etiqueta más adelante en el curso de la experiencia y compromiso la curva de decaimiento de la Eby. Se trata por un lado logrado realizando cuidadosamente todos los pasos de lavado descrito. Por otro lado, la concentración de tinte se debe mantener tan ba.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
	de Corning	353219
	Marienfeld-superior	640030
Incubadora de CO2	Panasonic	MCO-170AICUV-PE
Centrífuga 5804	R Eppendorf	5804000528
InCell Analyzer 2200 Sistema de imágenes celulares	GE Healthcare Life Sciences	29027886
Name	Company	Número de catálogo	>Comentarios
>Reactivos
Glasgow Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	G5154
Suero fetal bovino, calificado para células madre embiónicas	ThermoFisher	16141-079
Solución de piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	113-24-6
Medio Esencial Mínimo  Aminoácidos no esenciales	ThermoFisher	11140-035
Penicilina-Estreptomicina	BioConcept	4-01F00H
L-Glutamina 200mM	ThermoFisher	25030-024
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	63689-25ML-F
Factor inhibidor de la leucemia	-	-	Producido en el laboratorio por transfección transitoria de células HEK-293T, seguida de recolección y filtrado del sobrenadante.
CHIR99021 (Inhibidor de GSK-3 XVI)	Merck Millipore	361559
PD 0325901	Sigma-Aldrich	391210-10-9
Gelatina de piel de bovino	Sigma-Aldrich	9000-70-8
PBS de Dulbecco 10x concentrado	BioConcept	3-05K00-I
PBS de Dulbecco sin Ca++/Mg++	BioConcept	3-05F29-I
Solución de tripsina-EDTA 0,25%	Sigma-Aldrich	T4049
Ratón recombinante E-Cadherina Fc Proteína quimera	R& Sistemas D	748-EC-050
Hicalato de doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891
SNAP-Cell 647-SiR	Nueva Inglaterra BioLabs	S9102S
FluoroBrite DMEM	ThermoFisher	A18967-01
Nombre	Company	>Número de catálogo	Comentarios
Software
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