Artículo de método

Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

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DOI:

10.3791/56613

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2 de febrero de 2018

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1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

En este artículo

Resumen

Inyección en la vena hidrodinámica cola de vectores de integración basado en el transposón permite la transfección estable de hepatocitos murinos en vivo. Aquí, presentamos un protocolo práctico para sistemas de transfección que permite la expresión constitutiva a largo plazo de un solo transgen o expresión constitutiva e inducible de doxiciclina combinada de un transgén o miR-shRNA en el hígado.

Resumen

En modelos de investigación de cáncer de hígado, inflamación, regeneración y fibrosis, flexible para en vivo gene expresión y silenciamiento son muy útiles. Inyección en la vena hidrodinámica cola de construcciones basadas en el transposón es un método eficiente para la manipulación genética de hepatocitos en ratones adultos. Además la expresión del transgen constitutiva, este sistema puede utilizarse para aplicaciones más avanzadas, como consecuencia de precipitación, shRNA-mediado del gene del sistema CRISPR/Cas9 para inducir mutaciones genéticas, o sistemas inducibles. Aquí, la combinación de la expresión constitutiva de CreER junto con la expresión inducible de un transgen o miR-shRNA de elección se presenta como un ejemplo de esta técnica. Cubrimos el procedimiento de varios paso a partir de la preparación de la bella durmiente-transposon construye, a la inyección y el tratamiento de ratones y la preparación del tejido hepático para su análisis por immunostaining. El sistema presentado es un acercamiento confiable y eficiente para lograr complejas manipulaciones genéticas en los hepatocitos. Es especialmente útil en combinación con cepas de ratón basados en Cre/loxP y puede aplicarse a una variedad de modelos en la investigación de la enfermedad hepática.

Introducción

Enfermedad del higado crónica presenta una carga de salud importante en todo el mundo1. Modelos de investigación animal son herramientas esenciales en el estudio de la enfermedad hepática y han ayudado a responder preguntas complejas en la regeneración del hígado, inflamación hepática, esteatosis como cáncer de hígado2. Un número considerable de estos modelos animales se basan en la modificación genética de las células del hígado. Por lo tanto, herramientas eficaces para manipular genes en los hepatocitos están útil3. Métodos establecidos, tales como la cría de las cepas de ratón modificados genéticamente o la generación de vectores virales para la infección del hepatocito son o puerto mucho tiempo, preocupaciones de seguridad o rendimiento pobre transgene expresión en hepatocitos en vivo 4 , 5. inyección en la vena hidrodinámica cola (HTVI) es un método alternativo para en vivo de la transfección de hepatocitos permitiendo interrogatorio fácil, rápido y eficiente de la función génica en el hígado. Para HTVI, un vector con la secuencia de ADN deseada se disuelve en un volumen de solución salina correspondiente al 10% del peso corporal del animal inyectado. La solución entonces se inyecta en la vena de la cola dentro de 5-10 s6. Exceder el gasto cardiaco, la solución salina fluye de la vena cava inferior en las venas hepáticas, hacia la expansión del hígado y la hidrodinámica de la transfección de hepatocitos7. Para lograr la integración genómica estable, el método se ha combinado con vectores transposon-basados, tales como el sistema de transposon dormir belleza. Este sistema interviene en la recombinación de vectores objetivo con los sitios de recombinación genómica catalizados por transposasa dormir belleza-8,9. Para los modelos de fibrosis hepática o carcinogénesis, a menudo es deseable que sobrexpresan o silencio genes en ciertos momentos del modelo de la enfermedad. Para ello, herramientas para la expresión de genes inducibles como el sistema Cre/LoxP o el sistema de expresión del gen inducible por tetraciclina (Tet-) pueden ser usados10.

Aquí, describimos un protocolo de la transfección en vivo de hepatocitos murinos utilizando HTVI de un durmiente transposon-sistema. Además de un protocolo de expresión constitutiva, estable de un transgen bajo el control de un promotor específico de hígado, describimos un sistema de vectores más avanzado que combina la expresión constitutiva de recombinase (CreER) de Cre de tamoxifeno-dependiente con la expresión inducible de un transgén o shRNA adaptado de microARN (miR-shRNA), llamado el pTC TET-system11. En este sistema de vectores, los transgenes inducibles o miR-shRNAs de expresión dependiente de la tetraciclina son clonados en el vector de la columna vertebral con un sistema de clonación recombinational, permitiendo la fácil y rápida generación de nuevos vectores12. Esta guía de video abarca la preparación de vectores adecuados, inyección y tratamiento de los ratones para lograr la expresión del transgen/miR-shRNA inducible y finalmente la preparación de tejido hepático para su análisis. El método descrito en este protocolo fue diseñado para permitir la combinación de cualquier sistema Cre/loxP mediada del ratón con la expresión o la precipitación de cualquier gen de elección, lo que es un sistema ampliamente aplicable en la investigación de la enfermedad hepática.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por las autoridades responsables (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania y Stanford institucional Animal cuidado y Use Comité, Stanford, CA, USA). Se proporciona una lista de todos los plásmidos para la clonación (paso 1 a 4) en la tabla suplementaria S1.

1. clonación de un transgen para la expresión del gen constitutivo

  1. Diseño de cebadores para el transgen amplificación13,14.
  2. Agregar a sitios de restricción para PacI (TTAATTAA) en el extremo 5' del primer avance. Añadir sitios de restricción para AscI (GGCGCGCC) o FseI (GGCCGGCC) en el extremo 5' del primer revés.
  3. Amplificar el transgén por PCR usando condiciones optimizadas para el transgen deseado14. Purificar mediante un kit de purificación de DNA disponible comercialmente.
    Nota: Tiempo del recocido depende de los cebadores diseñados en el paso 1.1., tiempo de alargamiento depende de la longitud de la construcción. Por ejemplo, para una construcción de 1.000 bp longitud uso 60 s tiempo de elongación.
  4. Digerir el transgen y vector de expresión constitutiva del gen15 con nucleasas de restricción respectivas (ver paso 1.2) y tampón en un volumen total de 50 μl a 37 ° C durante la noche. Digerir por ejemplo, construir con PacI de 5 unidades y 5 unidades FseI si procede (consulte el paso 1.2).
  5. Gel de purificar el vector digerido e insertar usando un kit de extracción de gel comercial según las instrucciones del fabricante. Realizar una ligadura estándar de 100 ng del vector y 100 – 1.000 ng de insertar usando 400 U T4 ligasa a 14 ° C por 16 h. calor inactivar a 65 ° C durante 10 minutos.
  6. Transformar las bacterias competentes usando un estándar de protocolo de shock de calor16.
  7. Placa en agar las placas que contienen ampicilina 100 de μg/mL. Incubar a 30 ° C por 24 h.
  8. Pick solo colonias, purificar DNA plasmídico utilizando un kit comercial miniprep según las instrucciones del fabricante y verificar la secuencia de secuenciación de Sanger17 (cartilla de la secuencia: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
  9. Uso positivo de colonias para maxi escalan de amplificación de ADN plásmido y purifican mediante un plásmido libre de endotoxina preparación kit18 según las instrucciones del fabricante.
  10. Construcción está lista para la inyección, por lo tanto continúe con el paso 5.

2. clonación de un transgen para expresión génica Inducible

  1. Diseño de cebadores para el transgen amplificación13,14.
  2. Agregar sitios de restricción de KpnI (GGTACC), SacI (GAGCTC) y SpeI (ACTAGT) al extremo 5' del primer avance. Añadir sitios de restricción NotI (GCGGCCGC) o XhoI (CTCGAG) en el extremo 5' del primer revés.
  3. Amplificar el transgén por PCR usando condiciones optimizadas para el transgen deseado14. Purificar mediante un kit comercial de purificación de ADN.
  4. Digerir el transgén purificado y 4 μg del vector de entrada (pEN_TTmcs-Vector, véase Tabla de materiales)19 por separado con nucleasas de restricción apropiado (véase el paso 2.2) y tampón en un volumen total de 50 μl a 37 ° C durante la noche.
  5. Gel de purificar el vector digerido e insertar usando un kit de extracción de gel comercial según las instrucciones del fabricante. Realizar ligadura estándar con 100 ng de vector y 100 – 1.000 ng de insertar usando 400 U T4 ligasa a 14 ° C por 16 h. calor inactivar a 65 ° C durante 10 minutos.
  6. Transformar las bacterias competentes usando un estándar de protocolo de shock de calor16.
  7. Placa en agar las placas que contienen Gentamicina 15 μg/mL. Incubar a 37 ° C por 16 h.
  8. Pick solo colonias, purificar DNA plasmídico y verificar inserción secuenciación17 utilizando la cartilla adelante pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
    Nota: PCR sobre colonias solo puede realizarse sin una previa purificación con cartillas pCEP adelante y atrás pCEP (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Este paso puede útil para la selección de las colonias positivas.
  9. Proceda al paso 4.

3. clonación de un miR-shRNA Inducible Gene Knock-down

  1. Diseño de oligonucleótidos de miR-shRNA según pSLIK clonación protocolo19. Recocido y purificar oligonucleótidos y diluir 1:20 en el ddH2O.
  2. Recopilación 3 μg de vectores de entrada con 5 BfuAI de U a 50 ° C por 3 h, luego inactivar la reacción a 65 ° C por 20 min.
    Nota: Si se desea la coexpresión de la proteína verde fluorescente (GFP), use el pEN_TTGmiRc19 como un vector de entrada, si no uso pEN_TTmiRc219.
  3. Gel de purificar el vector digerido como en el paso 2.5. Realizar ligadura estándar de 100 ng del vector y 1 μl de purificada y diluida shRNA oligonucleótidos (paso 3.1) con 400 U T4 ligasa a temperatura ambiente durante 1 h. calor inactivar a 65 ° C durante 10 minutos.
  4. Transformar las bacterias competentes usando un estándar de protocolo de shock de calor16.
  5. Placa en agar las placas que contienen Gentamicina 15 μg/mL. Incubar a 37 ° C por 16 h.
  6. Pick solo colonias, purificar DNA plasmídico y verificar inserción por Sanger secuenciación17 (cartilla de la secuencia: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
  7. Proceda al paso 4.

4. recombinational de clonación para generar Clones listos para la inyección

  1. Mezcla 150 ng del vector de entrada (del paso 2 o del paso 3) y 150 ng de pTC TET-vector20.
  2. Añadir buffer TE a un volumen total de 8 μl (pH = 8).
  3. Transferir la mezcla de enzima clonase LR II (véase Tabla de materiales) para hielo, Incube por 2 minutos vórtice dos veces.
  4. Añadir 2 μl de mezcla de enzima clonase LR II a la reacción e incubar a 25 ° C durante 1 hora.
  5. Detener la reacción agregando 1 μl de proteinasa K solución. Incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
  6. Transformar Stbl3 bacterias competentes con 2 μl de clonación recombinational mezclan utilizando un estándar de protocolo de shock de calor16.
  7. Placa en agar las placas que contienen ampicilina 100 de μg/mL. Incubar a 30 ° C por 24 h.
  8. Seleccionar colonias solo, purificar DNA plasmídico utilizando un plásmido libre de endotoxina preparación kit18 según las instrucciones del fabricante y confirmar la integridad de vector por Sanger secuenciación17 (cartilla de la secuencia 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
  9. Construcción está lista para la inyección, continúe con el paso 5.

5. preparación de solución para inyección en la vena hidrodinámica cola

Nota: Preparación de construcciones para expresión génica inducible y constitutiva se describen en el paso 1, 2, 3 y 4.

  1. Preparación de solución salina 0.9% estéril para inyección (hacer no uso PBS). Utilice el volumen correspondiente a cerca del 10% del peso corporal de ratón. Ejemplo: para un ratón de 20 g de peso, preparar 2 mL de solución.
  2. Preparación de vectores de inyección que se purificaron usando un plásmido libre de endotoxina purificación kit18 (ver paso 1.8 o 4.8, respectivamente).
  3. Añadir 10 μg o 15 μg del constructo de vector libre de endotoxina de la bella durmiente (del paso 1 Utilice 10 μg, de paso 4 uso 15 μg, respectivamente) y 1 μg de endotoxina libre pc-HSB521 por mL de solución salina estéril.
  4. Solución para un máximo de 4 h a 4 ° C. No congelar.

6. realizar la inyección en la vena hidrodinámica cola

  1. Utilizar un limitador para la inyección de la vena de la cola (comercial o preparada de un tubo cónico de 50 mL con agujeros de respiración y de la cola). Llene el fondo del tubo con papel de seda.
  2. Para la inyección, utilizar ratones de unos 8 – 10 semanas de edad con pesos de 20-25 g.
  3. Pesar ratones antes de la inyección y preparar el volumen de inyección según el peso corporal (correspondiente al 10% del peso corporal, consulte el paso 5.1). Preparar una estéril 3 mL-jeringa con una aguja de 27 G para inyección y relleno con el volumen requerido.
  4. Coloque el ratón en el limitador. Ajustar la cantidad de papel de seda (ver paso 6.1) para dejar un mínimo espacio para el movimiento pero suficiente espacio para respirar.
  5. Asegúrese de que el ratón está respirando regularmente.
  6. Caliente la cola con una lámpara infrarroja para 30-60 s. con cuidado para observar signos de sobrecalentamiento.
  7. Limpiar la cola con un algodón embebido en alcohol.
  8. Inserte la aguja casi horizontalmente en una de las dos venas laterales de la cola cerca de la base de la cola.
    Nota: Si coloca con éxito, una pequeña cantidad de sangre puede fluir hacia el cono de la aguja. No se recomienda aspirar activamente ya que cualquier movimiento adicional de la aguja podría provocar su desplazamiento y/o lesiones de la vena.
  9. Inyectar el volumen total en la vena de la cola en s 8-10.
  10. Inmediatamente Quite el ratón el limitador. Comprimir la inyección de la herida para menos de 30 s o hasta que el sangrado ceda.
  11. Coloque el ratón en una jaula separada. Una vez que el ratón se ha recuperado del procedimiento (unos 30-60 min), transferir el ratón a su jaula original. Compruebe en el ratón regularmente para las próximas 24 horas.
    Nota: Sedación suave del ratón se observa rutinariamente hasta 2 h después de la inyección.
  12. Antes de proceder a los experimentos adicionales (es decir, paso 7), espere 10 a 15 días para el despacho de vectores no integradas.

7. inducción de CreER Transfected con tamoxifeno

PRECAUCIÓN: El tamoxifeno es perjudicial, puede ser canceroso o dañar la fertilidad. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad.

  1. Plan de inyecciones intraperitoneales de tamoxifeno durante tres días consecutivos.
  2. El día 1, disolver 10 mg de tamoxifeno en etanol al 40 μl. Incubar a 55 ° C durante 10 minutos Vortex varias veces hasta que se disuelva el tamoxifeno.
  3. Añadir el aceite de maíz μl 960. Incubar por 5 minutos a 55 ° C. Vórtice varias veces para obtener una solución clara.
  4. Preparar la solución en una jeringa de insulina 1 mL con una aguja de 27 G.
  5. Pescuezo del ratón agarrando el cuello del ratón cuidadosamente con el pulgar y el dedo segundo, fijar la cola entre la base de la mano y los dedos cuarto y quinto.
  6. Inyectar 0.1 mL (= 1 mg de tamoxifeno) de la solución por vía intraperitoneal en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen.
  7. Repetir las inyecciones en los días dos y tres.

8. inducción de genes dependientes de la tetraciclina o shRNA expresión

PRECAUCIÓN: La doxiciclina puede ser perjudicial. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad.

Nota: Dependiendo del tipo y duración del experimento, doxiciclina puede suministrarse en el agua potable (paso 8.1) o chow (paso 8.2)

  1. Para los experimentos a corto plazo (< 10 días) administrar doxiciclina a través de agua potable utilizando el siguiente protocolo.
    1. Disolver el sacarosa 5 g en 100 mL de agua. Autoclave.
    2. Disolver 100 mg de Doxiciclina hiclato en 5 mL de solución de sacarosa (paso 8.1.1) en un tubo cónico de 15 mL.
    3. Utilizando una jeringa de 10 mL, filtro estéril la solución mediante filtro 0.2 μm. Añadir a la solución de sacarosa preparada en el paso 8.1.1.
    4. Suministro de solución de sacarosa de doxiciclina como agua potable para el ratón. Compruebe diariamente y reemplazar cuando la solución se vuelve turbia indicando crecimiento excesivo bacteriano (Reemplace la solución clara después de tres días a más tardar).
  2. Para los experimentos de largo plazo (> 10 días) o experimentos sensibles a los cambios metabólicos, uso comercial doxiciclina-chow (por ejemplo, Doxiciclina hiclato Chow 0,625 g/kg) para evitar la deshidratación y los cambios inducidos por la sacarosa en los hígados de los animales tratados.

9. preparación de hígado de ratón para análisis por inmunotinción

PRECAUCIÓN: Paraformaldehído puede ser perjudicial. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad.

Nota: El punto cuando se analizarán de ratones depende el experimento. Se recomienda analizar el tejido del hígado después de no menos de tres días de tratamiento doxiciclina para garantizar suficiente inducción de la expresión del transgen o shRNA.

  1. Preparar una jeringa de 1 mL con una aguja de 27 G con 1 mL de solución al 4% paraformaldehido (PFA).
  2. Eutanasia el ratón mediante un método adecuado según un protocolo aprobado del animal.
    Nota: Las directrices para los métodos adecuados de la eutanasia pueden variar dependiendo de la institución.
  3. Con tijeras de disección y pinzas anatómicas, abra cuidadosamente la cavidad abdominal con una laparotomía mediana para exponer el hígado. Mover el intestino delgado hacia la derecha para exponer la vena porta y la vena cava inferior (IVC).
  4. Inserte la aguja de la jeringa preparada (ver paso 9.1) en la vena cava inferior y corte la vena porta. Inyectar 1 mL de PFA lentamente en la vena cava inferior para inundar el tejido del hígado y quitar auto-fluorescente glóbulos rojos (deseables si se realizará la coloración inmunofluorescente).
  5. Retirar el hígado. Enjuague con agua y traslado a 5 – 10 mL de solución 4% de la PFA.
  6. Para secciones de parafina, parche tejido para 36 a 48 h. tejido está listo para la deshidratación y la inclusión en parafina.
  7. Para secciones congeladas, fijar tejido en 4% PFA durante 1 hora.
    1. Para crioprotección, transferencia a la solución de sacarosa al 10%. Incubar 60 min.
    2. Traslado a la solución de sacarosa al 20%. Incubar 60 min.
    3. Traslado a la solución de sacarosa al 30%. Incubar 12 – 16 h. Embed en la encajadura para secciones congeladas y congelar a-20 ° C.

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Resultados

Eficacia de transfección por inyección en la vena hidrodinámica cola: El porcentaje de hepatocitos murinos que son transfectadas hidrodinámico de una sola inyección es variable y depende de varios parámetros tales como volumen de inyección, tiempo de inyección, cantidad de ADN inyectado y el tamaño de la construcción inyectado6, 22,23. Además, la eficiencia de transfección es ge...

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Discusión

Transfección de hepatocitos con inyección en la vena hidrodinámica cola se ha convertido en un método establecido desde su introducción hace más de 15 años6. El volumen inyectado excede gasto cardiaco y fluye de la vena cava inferior en los sinusoides del hígado7, llevando a la transfección de unos 10-20%, en algunos casos hasta el 40% de hepatocitos25,26. Predictores de una exitosa transfección son el volumen inyec...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Deutsche Krebshilfe, Alemania (número de licencia 111289 a UE), la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños (Ernest y Amelia Gallo dotado Beca Postdoctoral - número de la concesión de la CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos a Dr. Mark A. Kay vector construcciones y asesoramiento experimental y Dr. Julien Sage para los ratones experimentales y apoyan.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher#SM1331de ADN para electroforesis
Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583Incrustación de criosecciones
Biozym LE AgarosaBiozym 840004
Bromuro de etidioSigma-AldrichE7637-1G
D(+)-SacarosaCarl Roth4621.1Para el endulzamiento de la solución de doxiciclina
Ampicilina Sal sódicaAppliChemA0839,0010Para la selección de clones resistentes a Amp
LB Agar (Luria/Miller)Carl RothX969.1
LB Caldo (Luria/Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. ThermoFischerMedio 15544034
Gentamicina sulfatoAppliChemA1492,0001Para la selección de clones resistentes a la gentamicina
Roti-Histofix 4 %Fa. RothP087.6solución de para-formaldehído
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mixinvitrogen/ThermoFisher11791-020contiene LR-clonasa enzima mix II y proteinasa K
DB3.1 Células competentesThermo Fisher11782-018
Stbl3 E. coli químicamente competenteThermo FisherC737303
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Enzimas de restricción
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Kits
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Para la extracción de ADN del gel
NucleoSpin Gel y PCR Clean UpMacherey & Nagel740609.10
NucleoBond PC20Macherey & Nagel740571Extracción de plásmidos (Mini preparación)
NucleoBond PC500Macherey & Nagel740574Extracción de plásmidos (Maxi preparación)
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidadThermo FisherF530S
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Materiales para experimentos con ratones
Jeringa Injekt F 1 mlBraun9166017VPara inyección intraperitoneal
Omnifix Luer 3 mlBraun4616025VPara inyección intravenosa
Cánula Sterican 24GBraun4657675
Cánula Sterican 27GBraun4657705
TamoxifenoSigma-AldrichT5648-1GPara la activación de CreER
Aceitede maíz Sigma-AldrichC8267-500MLPortador para inyecciones de tamoxifeno
Hiclato de doxiciclinaAppliChemA2951,0025Activación de la expresión dependiente de tetraciclina
Injekt 10 ml JeringaBraun4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831,826,001Para filtración de doxiciclina
NaCl 0,9%Braun3200905Portador para inyecciones intravenosas
Falcon Tubo cónico 50mlCorning Life Science352095
Lámpara infrarrojaN/AN/APara el calentamiento de la cola de ratón
IVISPerkin Elmer124262Sistema de imagen in vivo
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Plasmsids para la clonación de vectores de transposones de la bella durmiente para HTVI.
constitutiva, ref. 15
Vector de entrada para la expresión inducible de miR-shRNA con coexpresión de GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2Addgene #25752Vector de entrada para la expresión inducible de miR-shRNA sin coexpresión de GFP, ref. 19
pTC ApoE-TetAddgene #85578Vector de expresión para la expresión de genes inducibles o miR-shRNA con promotor ApoE.HCR.hAAT, ref. 11
pTC-CMV-TetAddgene #85577Vector de expresión para la expresión de genes inducibles o miR-shRNA con promotor CMV, ref. 11
escalera pTC n/a Vector para la expresión génica pEN_TTmcs Addgene #25755 Vector de entrada para la expresión génica inducible, ref. 19 pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753

Referencias

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