Inyección en la vena hidrodinámica cola de vectores de integración basado en el transposón permite la transfección estable de hepatocitos murinos en vivo. Aquí, presentamos un protocolo práctico para sistemas de transfección que permite la expresión constitutiva a largo plazo de un solo transgen o expresión constitutiva e inducible de doxiciclina combinada de un transgén o miR-shRNA en el hígado.
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Artículo de método
Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola
En este artículo
Resumen
Resumen
En modelos de investigación de cáncer de hígado, inflamación, regeneración y fibrosis, flexible para en vivo gene expresión y silenciamiento son muy útiles. Inyección en la vena hidrodinámica cola de construcciones basadas en el transposón es un método eficiente para la manipulación genética de hepatocitos en ratones adultos. Además la expresión del transgen constitutiva, este sistema puede utilizarse para aplicaciones más avanzadas, como consecuencia de precipitación, shRNA-mediado del gene del sistema CRISPR/Cas9 para inducir mutaciones genéticas, o sistemas inducibles. Aquí, la combinación de la expresión constitutiva de CreER junto con la expresión inducible de un transgen o miR-shRNA de elección se presenta como un ejemplo de esta técnica. Cubrimos el procedimiento de varios paso a partir de la preparación de la bella durmiente-transposon construye, a la inyección y el tratamiento de ratones y la preparación del tejido hepático para su análisis por immunostaining. El sistema presentado es un acercamiento confiable y eficiente para lograr complejas manipulaciones genéticas en los hepatocitos. Es especialmente útil en combinación con cepas de ratón basados en Cre/loxP y puede aplicarse a una variedad de modelos en la investigación de la enfermedad hepática.
Introducción
Enfermedad del higado crónica presenta una carga de salud importante en todo el mundo1. Modelos de investigación animal son herramientas esenciales en el estudio de la enfermedad hepática y han ayudado a responder preguntas complejas en la regeneración del hígado, inflamación hepática, esteatosis como cáncer de hígado2. Un número considerable de estos modelos animales se basan en la modificación genética de las células del hígado. Por lo tanto, herramientas eficaces para manipular genes en los hepatocitos están útil3. Métodos establecidos, tales como la cría de las cepas de ratón modificados genét....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por las autoridades responsables (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania y Stanford institucional Animal cuidado y Use Comité, Stanford, CA, USA). Se proporciona una lista de todos los plásmidos para la clonación (paso 1 a 4) en la tabla suplementaria S1.
1. clonación de un transgen para la expresión del gen constitutivo
- Diseño de cebadores para el transgen amplificación13,14.
- Agregar a sitios de restricción para PacI (TTAATTA....
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Resultados
Eficacia de transfección por inyección en la vena hidrodinámica cola: El porcentaje de hepatocitos murinos que son transfectadas hidrodinámico de una sola inyección es variable y depende de varios parámetros tales como volumen de inyección, tiempo de inyección, cantidad de ADN inyectado y el tamaño de la construcción inyectado6, 22,23. Además, la eficiencia de transfección es ge.......
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Discusión
Transfección de hepatocitos con inyección en la vena hidrodinámica cola se ha convertido en un método establecido desde su introducción hace más de 15 años6. El volumen inyectado excede gasto cardiaco y fluye de la vena cava inferior en los sinusoides del hígado7, llevando a la transfección de unos 10-20%, en algunos casos hasta el 40% de hepatocitos25,26. Predictores de una exitosa transfección son el volumen inyec.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Deutsche Krebshilfe, Alemania (número de licencia 111289 a UE), la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños (Ernest y Amelia Gallo dotado Beca Postdoctoral - número de la concesión de la CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos a Dr. Mark A. Kay vector construcciones y asesoramiento experimental y Dr. Julien Sage para los ratones experimentales y apoyan.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | de ADN para electroforesis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | Incrustación de criosecciones |
| Biozym LE Agarosa | Biozym 840004 | ||
| Bromuro de etidio | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Sacarosa | Carl Roth | 4621.1 | Para el endulzamiento de la solución de doxiciclina |
| Ampicilina Sal sódica | AppliChem | A0839,0010 | Para la selección de clones resistentes a Amp |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Caldo (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Thermo | Fischer | Medio 15544034 | |
| Gentamicina sulfato | AppliChem | A1492,0001 | Para la selección de clones resistentes a la gentamicina |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | solución de para-formaldehído |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contiene LR-clonasa enzima mix II y proteinasa K |
| DB3.1 Células competentes | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 E. coli químicamente competente | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| >Enzimas de restricción | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| >Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Para la extracción de ADN del gel |
| NucleoSpin Gel y PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Extracción de plásmidos (Mini preparación) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Extracción de plásmidos (Maxi preparación) |
| Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Materiales para experimentos con ratones | |||
| Jeringa Injekt F 1 ml | Braun | 9166017V | Para inyección intraperitoneal |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | Para inyección intravenosa |
| Cánula Sterican 24G | Braun | 4657675 | |
| Cánula Sterican 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifeno | Sigma-Aldrich | T5648-1G | Para la activación de CreER |
| Aceite | de maíz Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Portador para inyecciones de tamoxifeno |
| Hiclato de doxiciclina | AppliChem | A2951,0025 | Activación de la expresión dependiente de tetraciclina |
| Injekt 10 ml Jeringa | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | Para filtración de doxiciclina |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Portador para inyecciones intravenosas |
| Falcon Tubo cónico 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Lámpara infrarroja | N/A | N/A | Para el calentamiento de la cola de ratón |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Sistema de imagen in vivo |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Plasmsids para la clonación de vectores de transposones de la bella durmiente para HTVI. | |||
| constitutiva, ref. 15 | |||
| Vector de entrada para la expresión inducible de miR-shRNA con coexpresión de GFP, ref. 19 | |||
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Vector de entrada para la expresión inducible de miR-shRNA sin coexpresión de GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Vector de expresión para la expresión de genes inducibles o miR-shRNA con promotor ApoE.HCR.hAAT, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Vector de expresión para la expresión de genes inducibles o miR-shRNA con promotor CMV, ref. 11 |
Referencias
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159(2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 ....
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