Líquido de alimentación insectos tienen la capacidad de adquirir cantidades diminutas de líquido de superficies porosas. Este protocolo describe un método para determinar directamente la capacidad de los insectos a ingerir líquidos de superficies porosas utilizando soluciones de alimentación con nanopartículas magnéticas, fluorescentes.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos
En este artículo
Resumen
Resumen
Líquido de alimentación insectos ingieren una gran variedad de líquidos, que están presentes en el ambiente como piscinas, películas, o confinados a pequeños poros. Estudios de adquisición líquido requieren evaluar las relaciones estructura y función del mouthpart; sin embargo, mecanismos de absorción de líquido históricamente se infieren de las observaciones de la arquitectura estructural, a veces acompañado con evidencia experimental. Aquí, Divulgamos un nuevo método para evaluar la capacidad de absorción de líquido con mariposas (Lepidoptera) y moscas (Diptera) con pequeñas cantidades de líquidos. Insectos se alimentan con una solución de sacarosa 20% mezclada con nanopartículas magnéticas, fluorescentes de papeles de filtro de tamaño de poro determinado. El cultivo (estructura interna para guardar líquidos) se extrae del insecto y colocado en un microscopio confocal. Un imán es agitado por el cultivo para determinar la presencia de nanopartículas, que indican si los insectos son capaces de ingerir líquidos. Esta metodología se utiliza para revelar un mecanismo alimentación generalizado (acción capilar y formación de puente líquido) que es potencialmente compartido entre Lepidoptera y Diptera cuando alimentación de superficies porosas. Además, este método puede utilizarse para estudios de mecanismos de entre una variedad de insectos de alimentación de líquido, los importantes incluidos en la transmisión de la enfermedad y biomimética y potencialmente otros estudios que implican tamaño nano o micro conductos de alimentación donde transporte líquido requiere verificación.
Introducción
Muchos grupos de insectos tienen piezas bucales (probóscide) adaptado para alimentarse de líquidos, tales como néctar, frutas, la descomposición de sap flujos (por ejemplo 1de Diptera, Lepidoptera2, Hymenoptera3), xilema (Hemiptera4), lágrimas (Lepidoptera 5) y sangre (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7,8de Hemiptera, Lepidoptera9). La capacidad de los insectos se alimentan de fluidos es relevante para la salud del ecosistema (por ejemplo, polinización,10), enfermedad transmisión4,11, biodiversification2,12y estudios de evolución convergente13. A pesar de la amplia variedad de fuentes de alimentos, un tema entre algunos insectos de alimentación de fluido es la capacidad de adquirir pequeñas cantidades de líquidos, que podrían limitarse a gotitas de tamaño micro o nano, películas líquidas o superficies porosas.
Dada la amplia diversidad de insectos de alimentación de líquido (más del 20% de las especies animales14,15) y su capacidad para alimentarse de una variedad de fuentes de alimentos, entendiendo su alimentación comportamientos y mecanismos de absorción de líquido es importante en muchos campos. Funcionalidad del mouthpart insectos, por ejemplo, ha desempeñado un papel en el desarrollo de tecnología biomimética, p. ej., dispositivos de microfluidos que pueden realizar tareas como la adquisición de pequeñas cantidades de líquidos utilizando métodos similares a los empleados por insectos16. Un problema fundamental en los estudios de los mecanismos de absorción de líquido, sin embargo, es determinar no sólo cómo insectos se alimentan de líquidos, pero adquirir evidencia experimental que apoya el mecanismo. Únicamente mediante el comportamiento (por ejemplo, sondeando con la probóscide12,17) como un indicador de alimentación es insuficiente porque no confirma la exitosa absorción de líquidos, ni provee un medio para determinar la ruta que fluidos de viaje su paso a través de los insectos. Además, realizar experimentos con pequeñas cantidades de líquidos mejor representa escenarios naturales de alimentación donde los fluidos son un recurso limitante2,12.
Fase de proyección de imagen de contraste se utilizó con la mariposa monarca (Danaus plexippus L.) para evaluar cómo las mariposas se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas12de rayos x. Mariposas monarca usa acción capilar a través de espacios entre proyecciones cuticulares (legulae dorsal) a lo largo de la probóscide para hacer fluidos confinados a pequeños poros en el canal de alimentación. Los fluidos entrantes forman una película en la pared del canal de alimentos que crece y se derrumba en un puente líquido por meseta inestabilidad12,18, que luego es transportada al intestino de la mariposa por la acción de la bomba de succión en la cabeza. Aunque la proyección de imagen contraste fase de rayos x es una herramienta óptima para la visualización de flujo de fluidos en insectos12,19,20,21, la técnica no es fácilmente disponible y más conveniente el método es necesario para la evaluación rápida de la capacidad de un insecto para líquidos de absorción e ingerirlos.
Para determinar si el mecanismo de alimentación de D. plexippus se aplica a otros lepidópteros y también a las moscas (Diptera) (ambos grupos se alimentan de líquidos de superficies porosas), Lehnert et al. 13 aplica una técnica para evaluar la capacidad de un insecto que se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas, que se divulga en detalle aquí. Aunque el protocolo descrito aquí es para estudios que utilizan húmedos y superficies porosas, la metodología puede modificarse para otros estudios, tales como abordar mecanismos de alimentación de piscina. Además, las aplicaciones se extienden a otros campos, incluyendo la tecnología microfluídica y Bioinspirados.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. insectos especies, preparación de soluciones y la configuración de la estación de alimentación
Nota: las mariposas de la col (Pieris rapae L., Pieridae) son seleccionados como la especie de Lepidoptera representante porque se han utilizado en estudios previos de capacidades de absorción de líquido y mouthpart morfología22,23. Moscas domésticas (Musca domestica L., Muscidae) y las moscas de botella azul (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) se usan porque se observan a menudo alimentándose de superficies porosas13.
- Orden p. rapae como larvas de un insecto proveedor y posterior en artificiales de la dieta (véase Tabla de materiales) hasta que pupan y emergen como adultos en una cámara ambiental de 23 ° C y un fotoperiodo de 18 L: 6. Orden M. domestica y C. vomitoria como pupas y posterior en las mismas condiciones ambientales que p. rapae. No alimentar moscas y mariposas adulto después de que emergen de las pupas antes de los experimentos de alimentación.
- Preparar una solución de sacarosa al 20% (control) y una solución de nanopartículas de sacarosa 20% para comprobar la absorción de líquido. Preparar la solución de nanopartículas mediante la adición de nanopartículas magnéticas fluorescentes (óxido de hierro con una capa de ácido poliacrílico, aproximadamente 20 nm de diámetro)24 a una solución de sacarosa 20% (1 mg/mL dH2O nanopartículas con 20% de sacarosa solución 1:1). Preparar una solución de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) (10 x diluido a 1 x en dH2O, pH 7.4), que se utiliza para disecciones.
- Configurar una estación de alimentación que consiste en un manipulador manual con una abrazadera y una etapa de alimentación separada (una plataforma plana) (figura 1). Colocar un portaobjetos cóncavo en la etapa de alimentación y filtros de red de nylon con un diámetro de tamaño de poro de 11, 20, 30, 41 y 60 μm y membrana filtros con diámetros de tamaño de poros de 1, 5, 8 o 10 μm cerca de los experimentos de alimentación.
2. Protocolo de alimentación
- Envolver los cuerpos, piernas y alas de los insectos en un papel doblado. Coloque el insecto de modo que sólo la cabeza y partes bucales están expuestos. Coloque las alas de los insectos entre dos portaobjetos, que se mantienen unidas por la pinza en el manipulador para que el insecto está suspendido por encima de la etapa de alimentación (figura 1).
- Administrar una gota de 30 μl de la solución de sacarosa al 20% o la solución al 20% sacarosa nanopartículas con una micropipeta en el centro de la diapositiva cóncava. Coloque un solo papel de filtro de un tamaño específico de poro portaobjetos cóncavo para que el centro del papel de filtro se alinea con la gota de la solución de nanopartículas. El contacto entre la gota y el papel de filtro da como resultado la solución que se separa a lo largo el papel de filtro, llenar los poros (figura 1).
Nota: El papel de filtro se coloca sobre la gota, en lugar de al revés, para reducir al mínimo la presencia potencial de las nanopartículas sobre el papel de filtro donde se alimentan los insectos. - Coloque el insecto con el manipulador de modo que sólo las regiones distales de las piezas bucales pueden contactar con el papel de filtro impregnado en la etapa de alimentación (figura 1). Utilice un pasador de insectos para extender las piezas bucales en el papel de filtro y permitir que el insecto para alimentarse de 45 s.
- Para minimizar la posibilidad de insectos alimentándose de películas líquidas que pueden estar presentes en la superficie del papel filtro, coloque las piezas bucales para que estén en contacto con una parte del papel de filtro que está tocando la parte plana de la diapositiva (es decir. no directamente sobre la parte cóncava de la diapositiva). Si el insecto no expresa un interés en la alimentación, las piezas bucales pueden guardarse para el papel de filtro con el pasador de insectos el tiempo de la alimentación.
3. disecciones
- Poner la solución de PBS en un vidrio de reloj de 50 mm que hay suficiente solución para cubrir el cuerpo de los insectos. Colocar el vidrio de reloj bajo un estereoscopio y posición insecto disección equipo (resorte micro disección, tijeras, alfileres insectos, pinzas de disección de punta fina) al lado del estereoscopio.
- Después de alimentar, retirar el insecto desde el papel de tejido y manténgalo con alas cerradas. Quitar la cabeza, las patas y las alas del insecto con las tijeras de disección micro muelle y coloque el insecto en la solución de PBS en el vidrio de reloj (figura 2).
- Si es necesario, anestesiar insectos antes de disecciones. Utilice pinzas para sujetar el insecto por la cutícula cerca de la región distal del abdomen. Con la mano dominante, utilizar el micro de primavera tijeras de disección para cortar la cutícula en sentido anterior a lo largo de la parte lateral del abdomen, comenzando en el extremo posterior, hasta el tórax. Tenga especial cuidado para asegurar que se corta sólo la cutícula y que el tubo digestivo en los insectos no está dañado (figura 2).
- Hacer recortes adicionales de la cutícula con las tijeras de disección para abrir el abdomen para revelar el tubo digestivo interior (figura 2). Quitar la cutícula abdominal, grasa corporal y otras estructuras con la ayuda de insectos pasadores y reubicarlas fuera el vidrio de reloj para la posterior eliminación, dejando sólo el tórax y el tubo digestivo en el vidrio de reloj.
Nota: La disección revelará el cultivo, que es una estructura de forma de saco (una extensión del canal alimenticio) situada cerca de la confluencia del tórax y el abdomen. - Si el cultivo no está expuesto, hacer incisiones adicionales en el tórax con las tijeras hasta que quede expuesto el cultivo. Una vez que el cultivo es visible, corte las partes restantes del insecto, dejando sólo el tubo digestivo con el cultivo en el vidrio de reloj (figura 2).
Nota: El cultivo de lepidópteros es casi transparente y celofán-como en la naturaleza, que puede ser difícil de reconocer si no se llena de fluidos y ampliado o si se corta durante la disección. - Utilice fórceps de disección de punta fina para colocar la cosecha en un cubreobjetos de (24 x 24 mm) para posterior proyección de imagen (figura 2).
4. determinación de nanopartículas ingeridas
- Posición del cultivo sobre el cubreobjetos con la pinza disección punta fina usando cuidado para evitar la ruptura de la cosecha. Utilice el canal CY3 (o contraste de fases) en un microscopio confocal invertido para obtener imágenes de 20 aumentos. El cultivo de la imagen inmediatamente después de la disección para evitar que se resequen.
- Mantenga una agitación magnética (41,3 mm de longitud y 8 mm de diámetro) en la mano que no está en control de la etapa de funcionamiento del microscopio.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El estudio de patrones en la capacidad de absorción de líquido entre insectos de alimentación de líquido requiere determinación de alimentación cuando se produce. El protocolo aquí descrito se utiliza para probar la hipótesis limitación de tamaño de poro entre Lepidoptera y Diptera13. La hipótesis limitación de tamaño de poro afirma que insectos de alimentación de líquido no pueden alimentar de poros llenos de líquido, si el diámetro de tamaño de poro es más pequeñ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Funcionalidad de insectos mouthpart históricamente se infiere de los estudios de morfología gruesa (e.g., funcionalidad de lepidópteros probóscide relacionadas con un consumo de paja de25,26); sin embargo, estudios recientes que incorporan evidencias experimentales han dado como resultado un cambio de paradigma en nuestra comprensión de la complejidad de partes bucales de insectos y las relaciones de estructura y función2,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por National Science Foundation (NSF) subsidio no. IOS 1354956. Agradecemos al Dr. Andrew D. Warren (centro de McGuire para lepidópteros y biodiversidad, Florida Museo de Historia Natural, Universidad de Florida) permiso utilizar las imágenes de la mariposa.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
Solución salina tamponada con fosfato al de la etapa de alimentación Carolina Carolina Microscopio de
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 20% | Domino Sugar | necesaria para producir la solución de sacarosa con dH2 | |
| O Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | Concentración 10X diluida a 1X en dH2O para disecciones de insectos |
| Portaobjetos cóncavo de depresión simple | AmScope | BS-C6 | Slide es necesario para la configuración |
| Papel de filtro | EMD Millipore | NY6004700 (60 µ m) | Filtros de red de nylon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | NY4104700 (41 µ m) | Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | NY3004700 (30 µ m) | Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | NY2004700 (20 µ m) | Filtros de red de nylon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | NY1104700 (11 µ m) | Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | TCTP04700 (10 y micro; m) | Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | TETP04700 (8 µ m) | Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µ m) | Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Papel de filtro | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µ m) | Filtros de red de nailon y filtros de isoporos necesarios para producir una superficie porosa para la alimentación de insectos |
| Tijeras de microdisección Iris | Biological Supply Company | 623555 | Tijeras utilizadas para disecciones |
| Alfileres de insectos | 7Productos Bioquip | 1208B1 | Alfileres utilizados durante las disecciones y los ensayos de alimentación |
| Pinzas de disección de punta extrafina | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Equipo de disección |
| Estereoscopio Leica M205 C Leica | Microsystems | M205 C | Estereoscopio utilizado para disecciones |
| Microscopio confocal invertido | Olympus | IX81 | Microscopio fluorescente utilizado para detectar nanopartículas magnéticas |
| Fisherbrand PTFE Barra agitadora desechable | Fisherscientific | S68067 | Imán utilizado para detectar nanopartículas |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Pañuelos utilizados para asegurar insectos durante las pruebas de alimentación |
| Pupas de mosca doméstica (Musca domestica) | Mantisplace.com | insectos para experimentos | |
| Pupas de mosca de botella azul (Calliphora vomitoria) | Mantisplace.com | insectos para experimentos Larvas de | |
| mariposa de col (Pieris rapae) | Biological Supply Company | 144102 | insectos para experimentos |
| Finnpipette F1 | Micropipeta ThermoFisher Scientific | 4641080N | para la dosificación de líquidos |
| Finntip 250 puntas de pipeta | puntas de micropipeta | ThermoFisher Scientific | 9400250 |
| (=cubreobjetos) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | cubreobjetos para ver el buche del insecto en el microscopio confocal |
Referencias
- Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
- Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
- Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
- Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
- Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
- Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
- Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
- Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
- Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
- Barth, F. G. Insects and flowers: the biology of a partnership. , Princeton University Press. Princeton. (1991).
- Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
- Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
- Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
- Grimaldi, D., Engel, M. S. Evolution of the insects. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).
- Adler, P. H., Foottit, R. G. Insect biodiversity: science and society. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).
- Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
- Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
- Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6(2007).
- Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
- Lee, W. -K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2(2009).
- Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
- Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
- Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032(2014).
- Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
- Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
- Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
- Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
