Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Con el fin de coordinar crecimiento con su entorno, las plantas han evolucionado elegante vías de señalización para sentido, transducir y responder a señales de señalización. Como los corredores en una carrera de relevos, las proteínas son necesarias en transduction de la señal de planta. Ha sido ampliamente reconocido que la interacción proteína-proteína (PPI) desempeña un papel importante para la comunicación celular. Degradación, acetilación y fosforilación de la proteína son todas dependen de la interacción física entre una proteína diana y sus enzimas de modificación. Por ejemplo, Jasmonate ZIM-dominio proteína (JAZ) familia proteínas interactúan con el factor de transcripción MYC2 y suprimen su actividad transcripcional^1,2. Dada la importancia de PPI, proteína a gran escala han sido interactomes en las plantas exploradas recientemente^3,4,5. Estos resultados del interactoma más revelan la compleja red de regulación que coordina diversas funciones celulares.

Hay algunos enfoques establecidos para el seguimiento PPI. La levadura dos híbridos (Y2H) es el método más ampliamente utilizado para la detección de PPI. Y2H es fácil de realizar y adecuado para una prueba rápida examinar las interacciones entre proteínas. Y2H es también ampliamente utilizado para la detección de socios desconocidos de la interacción de la proteína de interés específico. Sin embargo, porque Y2H se realiza enteramente en la levadura, no puede reflejar la situación real en la planta las células y aporta altos falsos positivos. Otra estrategia similar es el análisis pull-down. En general, dos proteínas son expresadas y purificadas de células de Escherichia coli mezcladas e inmovilizadas para la detección de las interacciones entre proteínas. Aunque este método no es desperdiciador de tiempo, que no puede obtener en vivo resultados de interacción ya sea. Para propósitos de interacción en vivo , co-inmunoprecipitación (co-IP) es el ensayo más popular, que requiere de anticuerpos de alta calidad para immunoprecipitate el proteína de interés y no se puede excluir la posibilidad de IBP indirectas. Por otra parte, debido a los complicados procedimientos experimentales en co-IP, los resultados generalmente varían con cada experiencia.

Ensayos de reconstitución de reportero basado en avanzarán enormemente la detección de en vivo PPI. Estos métodos incluyen la fluorescencia de resonancia energética transferencia (traste)⁶, bimolecular de la fluorescencia complementación (centro)⁷y la complementación de la luciferasa de luciérnaga (LCI) ensayo⁸la proyección de imagen. Aunque estos tres enfoques son mejor que co-IP directa en vivo PPI, FRET y centro necesitan microscopios específicos para detectar señales de fluorescencia y fácilmente no pueden cuantificar la intensidad de la interacción. Por el contrario, LCI aprovecha de luciferasa de la luciérnaga, que brillará después de reaccionar con su luciferin del substrato. Más importante aún, intensidad PPI puede determinarse el valor de actividad de luciferasa. Así, LCI no sólo indica si dos proteínas interactúan o no, sino que también proporciona información sobre la dinámica de interacción sobre el tratamiento. Aunque hay algunos métodos establecidos para el seguimiento de la interacción dinámica (basada en plasmones resonancia o estabilidad terma turnos)^9,10, estos enfoques requieren instrumentos delicados o etiquetado específico. En cambio, es más fácil de realizar y detectar LCI.

El principio de LCI es que las mitades amino terminal y carboxilo-terminal de luciferasa (denominado N-Luc o C-Luc, respectivamente) fueron fusionados con la proteína A y B y estas dos proteínas al mismo tiempo se expresaron en las células vegetales la fusión. Si protein A interactúa con la proteína B, entonces las dos mitades del luciferase serán reconstituidas para ser una enzima luciferase activo. Actividad de luciferasa puede detectarse con un luminómetro o una cámara CCD. No es necesario obtener transformantes estables para LCI; expresión transitoria es suficiente para obtener un resultado de la interacción de alta calidad.

ANILLO tipo E3 ubiquitina ligasa constitutiva photomorphogenic 1 (COP1) interactúa con un gran número de factores de transcripción y promueve su degradación por el proteosoma 26S del¹¹. Algunos de estos factores de transcripción dirigido por COP1 son reguladores positivos para photomorphogenesis. En la oscuridad, COP1 interactúa con supresor de fitocromos A-105 1 (SPA1), que mejora la COP1 E3 actividad⁸. Después de la percepción de la luz, fotorreceptores abrogan la interacción COP1-SPA1 para inhibir la actividad de COP1 y luego estabilizar COP1 sustratos^12,13,14. Este ejemplo ilustra la importancia biológica de PPI de estudiar y determinar la dinámica PPI.

1. preparación de plantas (8 semanas)

1. Poner 50 semillas de Nicotiana benthamiana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 1 mL de 5% NaClO y solución al 0,1% Tritón X-100 (V/V) y licencia para 5 min esterilizar las semillas.
2. Enjuagar las semillas con agua estéril 5 veces y suspender las semillas en 200 μL de agua estéril.
3. Cuidadosamente lugar semillas individuales sobre la superficie del medio de MS-agar (1 L: 1 x sales de Murashige y Skoog, sacarosa 10 g, pH 5.8 (KOH), agar al 1%) con puntas finas y placas de medio de almacén en 4 ° C por 3 días sincronizar la germinación.
   Nota: Para evitar la contaminación del microbio, realice este paso en una mesa de trabajo limpia. No es necesario agitar el tubo durante la esterilización.
4. Colocar placas de medio bajo condiciones de crecimiento normal (22 ° C, 80-90 µmolm^-2s^-1 blanco intensidad de la luz) durante 10 días y entonces transfiera las plántulas germinadas en el suelo.
   Nota: Asegúrese de que insertar las raíces de las plántulas en suelo y no dañar las raíces. Cubrir la bandeja con una cubierta de plástico transparente durante la noche para mantener la humedad.
5. Crecer las plantas en una habitación de crecimiento controlado a una humedad de ciclo y el 70% de 16 h a 8 h luz/oscuridad. 7 semanas de edad las plantas de N. benthamiana están listas para Agrobacteriumtumefaciens de infiltración (figura 1A).
   Nota: Plantas de agua y control de plagas según sea necesario para mantener las plantas sanas.

2. transitoria expresión en hojas de N. Benthamiana (7-10 días)

1. Entregan 150 ng de plásmidos (plásmido control pEGAD-HA-LUC y vacía vector plásmido construido para LCI de ensayo, en este caso hemos utilizado pCAMBIA1300-Nluc y pCAMBIA1300 Cluc para la construcción de plásmidos) en a. tumefaciens célula competente cepa GV3101 con un método de electroporación estándar.
2. Cultura a. tumefaciens en Luria-Bertani (LB) agar medio (1 L: 10 g NaCl, extracto de levadura 5 g, 10 g de triptona, agar 1,5%) que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina a 28 ° C durante 4 días.
   Nota: La elección de los antibióticos depende del vector y la cepa de a. tumefaciens empleada.
3. Inocular una sola Colonia de a. tumefaciens de cada placa en 3 mL de medio líquido LB que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina y agitar a 220 rpm a 28 ° C durante 24 h propagar el cultivo celular.
4. Transferencia de 75 μl de cultivo bacteriano en 15 mL LB líquido medio fresco que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina, diluyéndolo en un factor de 200. Cultura de las bacterias a 220 rpm a 30 ° C por cerca de 8 horas, hasta OD₆₀₀ es entre 0.5 a 1.0.
5. Transferir el cultivo líquido de a. tumefaciens en tubos de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 4.000 x g y 4 ° C por 15 minutos, descartar el sobrenadante y suspender la pastilla en 15 mL de solución de transformación para lavar el pellet.
6. Girar el tubo a 4.000 x g y 4 ° C por 15 min y descarte el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez más.
7. Resuspender el precipitado en 5 mL de solución de transformación y mantener durante 2 h a temperatura ambiente. Ajuste la densidad de a. tumefaciens pelotilla células con solución de transformación hasta que la concentración final de OD₆₀₀ es 0,5, o mezcla de dos muestras con igual volumen de interacciones de proteínas apareadas prueba.
8. Infiltrar las células suspendidas en el 4^th a 7 hojas de^th con una jeringa sin aguja 1 mL (figura 1B-C). Después de la infiltración, cubrir las plantas inmediatamente con una cubierta de plástico negro y coloque la bandeja en la oscuridad durante 12 h. Después de eso, crecen las plantas como de costumbre para 2 a 4 días antes de detectar actividades LUC.
   Nota: Elija hojas sanas de tamaño similar. La infiltración de cuatro zonas diferentes en una hoja es fina.

3. detección de actividad de luciferasa (un día)

Nota: Hay dos formas de controlar la actividad de luciferasa. Uno se basa en la proyección de imagen, y el otro es para medir cuantitativamente la actividad de luciferasa.

1. Método de proyección de imagen
   1. Separar una hoja infiltrada y el folleto entero en medio MS-agar.
   2. Tampón sobre la superficie adaxial de la hoja con un atomizador de 50 mL en spray luciferin trabajo. Mantener los materiales en la oscuridad durante 5 minutos apagar el auto fluorescencia de la clorofila.
   3. Utilizar un CCD refrigerado por poca luz imagen aparato (enfriado a-30 ° C) para capturar imágenes (figura 2). El tiempo de exposición presentado por luz es 50 ms, y tiempo de detección de luminiscencia es de 1 minuto.
      Nota: Ajuste los parámetros según el manual de la máquina. Temperaturas más bajas mejorarán la relación señal-ruido para mejorar la calidad de la imagen.
2. Por otra parte, medir luminiscencia directamente con un luminómetro comercial.
   1. Recortar fragmentos de la hoja (aproximadamente 0,25 cm²) de la zona de infiltración de las hojas de N. benthamiana y cuidadosamente sumerja el disco de hoja en 100 μl de agua desionizada en una placa de 96 pocillos blanca (figura 3).
   2. Añadir 10 μl de tampón de trabajo luciferin y dejar durante 5 minutos. Realizar tratamientos específicos para estudiar la dinámica de interacción de la proteína.
      Nota: Detectar la luminiscencia con un luminómetro en diferentes puntos temporales para obtener la dinámica actividad de luciferasa, que representan la cinética de las interacciones proteína-proteína bajo cierto tratamiento. Este método tiene ventajas para las pruebas de un gran número de pares de proteínas simultáneamente. Para aquellos sin un luminómetro comercial, examinar la concentración de proteína luciferase por western blot, por lo tanto se refieren a la posible actividad LUC. Si la luz no es necesaria, sólo mantener la placa en el luminómetro y medir luminiscencia en diferentes puntos temporales. De lo contrario, mueva la placa en una cámara de crecimiento durante el espacio de detección. Para obtener resultados estadísticamente significativos, utilizar al menos tres réplicas biológicas. Aunque varían las actividades LUC de zonas de infiltración diferentes, sus patrones de cambio son constantes después de la normalización.

Tres pasos principales pueden ser singularizados en el presente Protocolo de complementación de la luciferasa para estudiar proteínas interacciones en vivo, incluyendo el crecimiento de las plantas, infiltración de tabaco y el ensayo de luciferasa. El paso más crucial en el presente Protocolo es infiltración de líquido a. tumefaciens en hojas de N. benthamiana (figura 1).

Aquí es un ejemplo de la utilidad de esta técnica confirma jasmonate reducir interacciones COP1-SPA1. Las mitades amino terminal y carboxilo-terminal de luciferasa fueron fundidas con COP1 (COP1-NLuc) o SPA1 (CLuc-SPA1), respectivamente. COP1-SPA1 interacciones resultan en la complementación de luciferasa funcional. La actividad luciferasa fue fotografiada por la cámara de CCD (figura 2), y la actividad enzimática puede ser detectada con un luminómetro (figura 3). Para excluir la posibilidad que luciferase sí mismo se ve afectado por el tratamiento, el gen de la luciferasa de larga duración (LUC) también fue transitorio en hojas de N. benthamiana para servir como un control. La actividad luciferasa antes del jasmonate tratamiento (tiempo 0) nace como 1, y luego cada valor de actividad de luciferasa obtenido bajo tratamiento jasmonate fue normalizada con tiempo 0 para que la actividad de luciferasa relativa (figura 4). Los resultados mostraron que interacciones de COP1-SPA1 (reflejadas por la actividad de luciferasa) gradualmente declinó en la oscuridad, y que el tratamiento JA reduce aún más sus interacciones.

Figura 1 . Proceso de infiltración de N. benthamiana . 
(A) Abaxial y adaxial vista de plantas antes de la infiltración. (B) imagen representativa para mostrar el protocolo de infiltración. (C) Abaxial y adaxial vista de plantas después de la infiltración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Actividad de luciferasa bajo cámara de CCD de imagen. 
(A) imagen representativa de una hoja de N. benthamiana bajo un campo normal de la luz. Señales de luminiscencia (B) detección bajo cámara CCD para mostrar las actividades de la luciferasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Imagen representativa para demostrar cómo medir luminiscencia de corte discos de hoja. 
Discos de hoja infiltrada se cortaron y se ponen en una placa de 96 pocillos blanca para la medición de las señales de luminiscencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 . Representante de resultados de ensayo de luciferasa transitoria una complementación. 
(A) la duración del tratamiento (tiempo) y los resultados originales del valor de luminiscencia (actividad LUC) fueron enumerados. Hay tres réplicas independientes para cada muestra. Para la preparación de esta tabla, actividad LUC en momentos diferentes de tratamiento se normalizó con tiempo 0 como la relativa actividad LUC.
(B) cuantificación de actividades relativa de LUC, mostrando las interacciones COP1-SPA1 en la oscuridad gradualmente disminuido, que puede reducirse mediante tratamientos de JA. La barra de error indica que la desviación estándar (sd). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.