Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Resumen

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína son mecanismos fundamentales de transmisión transducción de señales en procesos celulares más; por lo tanto, la identificación de pares de interacción novedosa proteína-proteína y monitoreo de dinámicas de interacción de la proteína son de particular interés para revelar cómo las plantas responden a factores ambientales o señales de desarrollo. Una plétora de enfoques se han desarrollado para examinar las interacciones de proteínas, ya sea in vitro o en vivo. Entre ellos, la complementación de luciferase recientemente establecido imaging (LCI) es el método más simple y rápido para demostrar en vivo las interacciones proteína-proteína. En este ensayo, la proteína A o proteína B se fusiona con la mitad terminal amino o carboxilo terminal de la luciferasa, respectivamente. Cuando proteína interactúa con la proteína B, las dos mitades del luciferase serán reconstituidas para formar una enzima luciferasa funcional y activo. Actividad de luciferasa puede grabarse con una cámara CCD o un luminómetro. En comparación con otros enfoques, el análisis LCI muestra las interacciones proteína-proteína cualitativa y cuantitativamente. Infiltración de Agrobacterium en hojas de Nicotiana benthamiana es un sistema ampliamente utilizado para la expresión transitoria de proteínas. Con la combinación de LCI y expresión transitoria, estos enfoques demuestran que la interacción física entre COP1 y SPA1 fue reducida gradualmente después del tratamiento del jasmonate.

Introducción

Con el fin de coordinar crecimiento con su entorno, las plantas han evolucionado elegante vías de señalización para sentido, transducir y responder a señales de señalización. Como los corredores en una carrera de relevos, las proteínas son necesarias en transduction de la señal de planta. Ha sido ampliamente reconocido que la interacción proteína-proteína (PPI) desempeña un papel importante para la comunicación celular. Degradación, acetilación y fosforilación de la proteína son todas dependen de la interacción física entre una proteína diana y sus enzimas de modificación. Por ejemplo, Jasmonate ZIM-dominio proteína (JAZ) familia proteínas interactúan con el factor de....

Protocolo

1. preparación de plantas (8 semanas)

1. Poner 50 semillas de Nicotiana benthamiana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 1 mL de 5% NaClO y solución al 0,1% Tritón X-100 (V/V) y licencia para 5 min esterilizar las semillas.
2. Enjuagar las semillas con agua estéril 5 veces y suspender las semillas en 200 μL de agua estéril.
3. Cuidadosamente lugar semillas individuales sobre la superficie del medio de MS-agar (1 L: 1 x sales de Murashige y Skoog, sacarosa 10 g, pH 5.8 (KOH), agar al 1%) con puntas finas y placas de medio de almacén en 4 ° C por 3 días sincronizar la germinación.
   Nota: Para evitar la contaminación del mi....

Resultados

Tres pasos principales pueden ser singularizados en el presente Protocolo de complementación de la luciferasa para estudiar proteínas interacciones en vivo, incluyendo el crecimiento de las plantas, infiltración de tabaco y el ensayo de luciferasa. El paso más crucial en el presente Protocolo es infiltración de líquido a. tumefaciens en hojas de N. benthamiana (figura 1).

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Discusión

El protocolo descrito aquí es simple y reproducible para el estudio en vivo las interacciones proteína-proteína y particularmente conveniente para detectar la dinámica de interacción de la proteína bajo tratamiento exógeno. El paso clave en este ensayo es infiltración de N. benthamiana . Para asegurar el éxito de infiltración, las plantas deben ser muy saludables. Otro factor crítico es cuando verificar actividad de luciferasa después de la infiltración. Existe una respuesta correcta para esta pregunta........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
transformación fuerte
10 mM Ácido morfolineetanosulfónico	VETEC V900336
27.8 mM Glucosa	VETEC	V900392
10 mM MgCl2× 6H2O	VETEC	V900020
150 y mu; M Acetosiringona	ALDRICH	D134406
pH 5,7
luciferina
5 mM Sal de potasio de luciferina	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC V900502
H2O a 10 ml