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Artículo de método

Establecer un modelo de ratón de una neuropatía de fibra pequeña pura con el Ultrapotent agonista de Receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1

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DOI:

10.3791/56651

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13 de febrero de 2018

 ,  , 
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research, Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory, Kaohsiung Medical University Hospital

En este artículo

Resumen

Este estudio establece un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña pura con la resiniferatoxina (RTX). Una dosis única de RTX (50 μg/kg) es óptimo para el desarrollo de un modelo de neuropatía de fibra pequeña que imita las características de los pacientes y podría ayudar a investigar el significado molecular nociceptivo subyacente dolor neuropático.

Resumen

Pacientes con diabetes mellitus (DM) o experimentar los efectos neurotóxicos de los agentes quimioterapéuticos pueden desarrollar trastornos de la sensibilidad debido a la degeneración y lesión de las neuronas sensoriales de pequeño diámetro, conocido como neuropatía de fibra pequeña. Modelos animales actuales de neuropatía de fibra pequeña afectan tanto las fibras sensoriales de diámetro grande y pequeño y así crean una neuropatología demasiado complejos para evaluar correctamente los efectos de heridas fibras sensoriales de pequeño diámetro. Por lo tanto, es necesario desarrollar un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña pura para examinar adecuadamente estas cuestiones. Este protocolo describe un modelo experimental de neuropatía de fibra pequeña que específicamente afectan nervios sensoriales de pequeño diámetro con resiniferatoxina (RTX), un agonista ultrapotent del receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1 (TRPV1), a través de una sola dosis de inyección intraperitoneal, se denomina neuropatía RTX. Esta neuropatía RTX mostró manifestaciones patológicas y anormalidades del comportamiento que imitan las características clínicas de los pacientes con neuropatía de fibra pequeña, incluyendo la degeneración de la fibra del nervio (IENF) de intraepidermal, específicamente lesiones en las neuronas de pequeño diámetro y la inducción de hipoalgesia térmica y alodinia mecánica. Este protocolo probado tres dosis de RTX (200, 50 y 10 μg/kg, respectivamente) y concluyeron que una dosis crítica de RTX (50 μg/kg) es necesaria para el desarrollo de manifestaciones de neuropatía de fibra pequeña típica y preparado un procedimiento modificado de la inmunotinción para investigar IENF degeneración y lesión del soma neuronal. El procedimiento modificado es rápida, sistemática y económica. Evaluación conductual del dolor neuropático es fundamental para revelar la función de los nervios sensoriales de pequeño diámetro. La evaluación de los umbrales mecánicos en roedores experimentales es particularmente desafiante y este protocolo describe una malla metálica modificada para requisitos particulares que es conveniente para este tipo de evaluación en los roedores. En Resumen, la neuropatía RTX es un modelo experimental nuevo y fácilmente establecido para evaluar la significación molecular e intervención subyacente dolor neuropático para el desarrollo de agentes terapéuticos.

Introducción

Neuropatía de fibra pequeña que implicaba el dolor neuropático, que es evidente por la degeneración de IENFs, es común en varios tipos de condiciones, como la DM y como resultado de los efectos neurotóxicos de los agentes quimioterapéuticos1,2, 3,4,5. IENFs son los terminales periféricos de diámetro pequeño de neuronas localizadas en los ganglios de raíz dorsal (GRD) y son afectados en paralelo en los casos de IENF degeneración6. Por ejemplo, la transcripción genética upstream alterada de Somas neuronales ha demostrado por el upregulation de activar la transcripción factor-3 (ATF3)6,7. Por otra parte, la evaluación de la inervación IENFs con biopsia de la piel es útil para el diagnóstico de neuropatía de fibra pequeña5,8,9. Tradicionalmente, los perfiles de las IENFs en la biopsia de la piel han dependido de demostración immunohistochemical del producto del gene de la proteína 9.5 (PGP 9.5)1,10,11. Tomados en conjunto, los perfiles patológicos de DRG y IENFs reflejan la neuropatía de fibra pequeña subyacente condición funcional y pueden ser un indicador de las consecuencias funcionales de este tipo de neuropatía en las neuronas de pequeño diámetro.

Previamente, varios modelos experimentales han abordado el tema de la degeneración IENF en casos de neuropatía inducida por quimioterapia12,13 y nervio lesión causada por compresión o sección transversal14,15 , 16. estos modelos experimentales también afectaron los nervios de gran diámetro; por consiguiente, no es posible excluir la contribución de los nervios afectados de gran diámetro en la neuropatía de fibra pequeña observada; por ejemplo, el examen de thermosensation trastorno por retiro nocivo depende de las fibras del nervio de motor funcional17,18,19. Por lo tanto, establecer un modelo de neuropatía de fibra pequeña pura e investigar sistemáticamente el estado patológico de Somas neuronales y sus fibras nerviosas cutáneas periféricas en las neuronas de pequeño diámetro son necesario e imperioso.

RTX es un análogo de la capsaicina, un potente agonista del receptor transitorio potencial vaniloides receptor 1 (TRPV1), que media el proceso nociceptivo20,21,22. Recientemente, periférica tratamiento RTX relevó dolor neurogénico23,24,25 y una inyección intraganglionic de RTX indujo la pérdida irreversible de neuronas DRG22. El efecto de la administración de RTX periférica es dosis dependiente20,26,27, que dio lugar a la desensibilización transitoria o degeneración de IENFs. Curiosamente, tratamiento sistemático de RTX de la alto-dosis llevó a dolor neuropático28, un síntoma de neuropatía de fibra pequeña. Estos resultados sugieren que el modo de tratamiento y la dosis de RTX producen distintos efectos patológicos y respuestas neuronales; a saber, administración periférica impidió la transmisión del dolor por los efectos locales29 y afectado los Somas neuronales que desarrollado comportamiento neuropático6. Colectivamente, estos resultados indican que el RTX tiene un efecto de multipotencia y planteó la cuestión de si existe una dosis determinada de RTX que sistemáticamente puede afectar los nervios periféricos, como la IENFs periféricas y central Somas neuronales. Si es así, el RTX puede ser un agente potencial que específicamente afectan a las neuronas de pequeño diámetro y mímico neuropatía de fibra pequeña en la clínica. Por ejemplo, DM en la clínica es un tema complicado como desorden metabólico y neuropatología de nervios periféricos, que son las principales características de la neuropatía de fibra pequeña. Los mecanismos de la neuropatía de fibra pequeña asociada a DM no podrían excluir la contribución de desorden metabólico que puede no ser el principal agente que afectan a los nervios periféricos. Por lo tanto, neuropatía de fibra pequeña asociada a la DM requiere de un modelo animal puro que podría excluir los efectos del desorden metabólico sistemático. Este protocolo describe la dosis de trabajo de RTX para desarrollar un modelo de neuropatía de fibra pequeña típica, como IENF degeneración y lesión de la neurona de pequeño diámetro, según lo demostrado por análisis de immunostaining modificado.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos están conforme a normas éticas para los animales de laboratorio30, y el protocolo ha sido aprobado por la Animal Comité de Kaohsiung Universidad médica, Kaohsiung, Taiwan.

1. establecimiento de la neuropatía RTX

PRECAUCIÓN: RTX es neurotóxica y peligrosos. En contacto, que actúa como un irritante a los ojos, membranas mucosas y tracto respiratorio superior. Evitar la inhalación y gafas de laboratorio y capas durante la preparación de RTX. Enjuague con abundante agua en caso de contacto con la piel o después de manipular.

  1. Añadir 1 mg de RTX polvo a 200 μL de mezcla de igual volumen de Tween 80 y etanol absoluto (100 μL para cada solvente).
  2. Alícuota de la solución RTX (12 μl/frasco) y almacenar a-20 ° C, por hasta 3 meses. Esto constituye la acción RTX; desechar la solución restante de RTX en la expiración.
  3. Diluir el caldo RTX con suero fisiológico hasta un volumen final de 600 μl. La concentración final de la solución RTX debe ser 0.01%, que equivale a 1 μg RTX en solución de vehículo de 10 μl.
  4. Como animales de experimentación ratones ICR machos adultos 8 semanas de edad (35-40 g) y administrar una sola dosis de solución RTX (dosis: 200, 50 y 10 μg/kg, respectivamente) por vía intraperitoneal (i.p.) con una jeringa de microinyección para los ratones. Ratones fue anestesiado por inhalador con isoflurano de 5% para la anestesia profunda. Si los ratones mostraron acción de retiro de las extremidades durante la inyección del RTX, ratones deben tomar mayor inhalación de la anestesia.
    Ejemplo: Si el ratón pesa 40 g, lo que recibirá 20 μl de la solución RTX, representando a la dosis de 50 μg/kg.
  5. Dar a un grupo de ratones un volumen igual de vehículo (10% Tween 80 y 10% etanol absoluto en solución salina), como un control.
  6. Después de la inyección de RTX, devolver los ratones en una jaula de plástico en un 12 h luz/12 h oscuro ciclarán y proporcionan alimento y agua ad libitum.

2. evaluación del comportamiento neuropático

Nota: Mantener los animales en un entorno cómodo (criterio 1.6) para permitir la recuperación después de la inyección. En el día 7 post RTX de la inyección (D7), cada animal realiza las pruebas de filamento de pelo placa y von Frey en el mismo día para reducir el sesgo de tiempo y promover la eficiencia de las pruebas de comportamiento. Llevar los animales a una habitación tranquila que es mantenida a una humedad estable (40%) y temperatura (27 º C) para optimización de aclimatación del animal y reducir los efectos ambientales durante la prueba de comportamiento. No molestes a los animales durante los períodos de prueba; las pruebas de comportamiento se programan semanalmente.

  1. Medición de latencias termal con el test de placa caliente
    1. Coloque al animal suavemente sobre una placa de metal caliente (27 cm x 29 cm) con una jaula de plexiglás transparente (largo × ancho × alto: 22 cm x 22 cm x 25 cm; Figura 1A). Ajuste la temperatura de la placa de metal caliente a 52 ° C.
    2. Comenzar a medir la duración de la latencia térmica del animal en la placa con el temporizador en el paso, integrado de la placa una vez fursuit de animal toque la placa y observa las respuestas de fursuit del animal. Si el animal muestra agitación, lamiendo de fursuit, o saltar mientras que en la placa caliente, retírela y registrar el tiempo que el animal permaneció en la placa. Esta duración de tiempo define la latencia termal de un animal individual. Grabar la latencia termal para el más cercano 0.1 s.
    3. Para cada sesión de la prueba, realizar tres ensayos con intervalos de 30 min para la normalización de la respuesta después de la última prueba de la placa caliente. Si el animal no muestra ninguna respuesta sobre la placa caliente, deje la sesión después de 25 s para evitar el potencial daño a los tejidos.
  2. Prueba de medición del umbral mecánico con los filamentos de von Frey cabello
    1. Poner el animal sobre la malla metálica personalizada (tamaño de acoplamiento: 5 x 5 mm) con una jaula de plexiglás semitransparente cilindro (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) (figura 1B) para aclimatación durante al menos 2 h.
    2. Aplicar los diferentes calibres de los filamentos de von Frey cabello a la región plantar de la hindpaw con el método de arriba hacia abajo31. Iniciar la aplicación inicial de la fuerza media de un conjunto de filamentos de von Frey cabello para una duración de la aplicación del filamento de s 5-8.
    3. Utilizar un intervalo de 2 minutos entre aplicaciones de filamento para optimizar la normalización animal. Cambiar la fuerza aplicada filamento basada en la última respuesta del animal.
      Nota: Un conjunto de filamentos de von Frey cabello consiste en 0,064 0.085, 0.145, 0.32, 0.39, 1.1 y uso de la fuerza de 1,7 g. Por ejemplo, si hindpaw retiro ocurrió con una fuerza inicial de 0,32 g, luego aplicar 0,145 g. En la ausencia de retiro de la pata, se aplica una fuerza de 0,39 g. A continuación cuatro filamentos adicionales de fuerzas diferentes se aplican en base a las respuestas anteriores y el umbral mecánico se calcula según una fórmula publicado31.
    4. Para cada sesión de prueba incluyen el fursuit bilateral. Realizar tres ensayos para cada hindpaw. Expresa el promedio de estos seis umbrales mecánicos como el umbral mecánico promedio (mg) de cada animal.

figure-protocol-1
Figura 1. Malla de jaula de plexiglás y el metal a medida para la evaluación del dolor neuropático en el modelo murino de resiniferatoxina (RTX)-inducida por neuropatía de fibra pequeña. (A, B) Estos gráficos muestran los equipos utilizados para medir (A) los Estados latentes térmicos por una placa de metal caliente (27 cm x 29 cm) con una jaula de plexiglás transparente (largo × ancho × alto: 22 cm x 22 cm × 25 cm) y evaluar (B) el umbral mecánico por una meta modificada para requisitos particulares malla l (tamaño de acoplamiento: 5 x 5 mm) con una jaula de plexiglás semitransparente cilindro (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) en los ratones con neuropatía de fibra pequeña RTX-inducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. biopsia de la preparación y evaluación de la inervación IENFs de la piel

  1. Después de pruebas de comportamiento, anestesiar los animales con 5% isoflurano y sacrificar a los animales por perfusión intracardíaca con tampón de fosfato de 0,1 M (PB) (pH 7.4) seguidos de paraformaldehído al 4% (4P) en 0,1 M de PB.
  2. Corte a las primera bandoleros de dos fursuit después de la perfusión y fijar después en 4P de h. 6 otra transferencia del tejido de la almohadilla a 0,1 M de PB a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.
  3. Cryoprotect bandoleros con sacarosa al 30% en PB durante la noche y de corte en vertical a modo superficie plantar en rebanadas gruesas de 30 μm. El bandolero de la etiqueta secciones secuencialmente y luego almacenar en anticongelante-20 ° c.
    Nota: La composición de anticongelante es el siguiente: agua destilada, glicerina de etileno, glicerol y 2 PB x en una proporción de 3:3:3:1.
  4. Para asegurar el adecuado muestreo, seleccionar cada sección tercera de la almohadilla.
    1. Ponga las secciones solicitadas bandolero en portaobjetos de vidrio y les deje secar al aire.
    2. Cubrir una cubierta de plástico sobre la diapositiva y proceso con procedimientos estándar immunostaining.
      1. Saciar las secciones de bandolero con 1% H2O2 en metanol por 30 min y bloque con leche descremada en polvo 0,5% y 0,1% Tritón X-100 en 0.5 M Tris buffer (Tris) durante 1 hora.
      2. Incubar las secciones bandolero con antisueros contra pan marcador axonal, PGP 9.5 (conejo criado en; 1:1, 000), durante una noche a 4 ° C.
      3. Incubar las secciones bandolero con una biotinilado cabra anti-conejo IgG anticuerpo secundario a temperatura ambiente (RT) por 1 h y luego incubar con el complejo avidina-biotina en RT por 45 min.
      4. Visualizar el producto de la reacción con 0.05% solución 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) para 45 s. Luego Lávese las secciones de la almohadilla con agua destilada y secar para el montaje.
        Nota: El antisuero primario y secundario se diluye con leche descremada en polvo 0.5% en 0,5 M Tris.

4. DRG sección Preparación y evaluación de lesionados neuronas de pequeño diámetro

  1. Diseccionar el 4to y 5to lumbar DRG y la solución para otro 2 h.
  2. Tejidos Cryoprotect DRG con 30% de sacarosa en PB durante la noche y cortan a un grosor de 8 μm secuencialmente, colocar en portaobjetos de microscopio y la etiqueta. Almacenar las secciones DRG en un congelador de-80 ° C.
  3. Secciones del Immunostain DRG en 80 μm-intervalos para muestreo adecuado.
    1. Realizar procedimientos de immunostaining DRG como los de las secciones de bandolero, salvo los procedimientos de inmunofluorescencia doble etiquetado. Como alternativa, incluyen ATF3 (conejo criado en; 1: 100), un marcador de lesión y peripherin (levantado adentro ratón; 1: 800), un marcador neuronal de pequeño diámetro en el antisuero primario.
    2. Incubar las secciones DRG con la mezcla de antisueros primarios durante la noche a 4 ° C.
  4. Incubar las secciones DRG con ya sea tejas rojo o fluoresceína isotiocianato (FITC)-conjugados secundarios antisueros (1: 200), corresponden a los antisueros primarias apropiadas en RT para 1 h y luego montar para la cuantificación.

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Resultados

Este protocolo describe un modelo de ratón novela de neuropatía RTX, que afecta específicamente a las neuronas de pequeño diámetro, incluyendo la degeneración IENF, asociada con los trastornos sensoriales (figura 2). Siguiendo el protocolo descrito en este documento, los animales exhiben hipoalgesia térmica y alodinia mecánica en D7 después RTX de la inyección. Para establecer este modelo de neuropatía de fibra pequeña, tres dosis de RTX: 200, 50 y 10 μg/kg s...

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Discusión

Eficaz tratamiento de la neuropatía de fibra pequeña en la clínica es necesaria para promover la recuperación funcional y calidad de vida de los pacientes. En la actualidad, hay falta de una guía terapéutica a trastornos sensoriales asociados con neuropatía de fibra pequeña debido a la falta de comprensión global de los mecanismos moleculares subyacentes a lesiones neuronales de pequeño diámetro. Los modelos anteriores de la neuropatía generalmente afectaron ambos nervios sensoriales de diámetro grande y pequeño; por eje...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de ciencia y tecnología (106-2320-B-037-024), Universidad médica de Kaohsiung (KMU-M106028, S105034 KMU) y objetivo para la concesión de las universidades Top (TP105PR15), Universidad médica de Kaohsiung, Taiwán.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo químico
ResiniferatoxinaSigmaR8756
Tween 80SigmaP1754
3,3'-diaminobenzidinaSigmaD8001
Vector de complejo avidina-biotinaPK-6100
NombreCompanyNúmero de catálogoComments
Primary Antisera
PeripherinChemiconMAB-1527
ATF3Santa CruzSC-188
PGP9.5UltraCloneRA95101
< strong>NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Secondary Antisera
Biotinylated goatat anti-rabbit IgGVectorBA-1000
Texas Cabra conjugada roja anti-ratónJackson ImmunoResearch115-075-146
Burro conjugado con isotiocianato (FITC) anti-conejoJackson ImmunoResearch711-095-152
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Equipo
Placa calienteIITCModelo 39
von Frey filamentoSomedic Sales AB10-600-0001
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Material
Shandoncoverplate Thermo scientific72110017
Slide rackThermo scientific73310017

Referencias

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Neuropatía por resiniferatoxinaAgonista de TRPV1Fibra nerviosa intraepidérmicaHipolgesia térmicaAlodinia mecánicaFilamento de Von FreyPrueba de placa calienteAnálisis de tejido de DRGProcedimiento de inmunotinción
Establecer un modelo de ratón de una neuropatía de fibra pequeña pura con el Ultrapotent agonista de Receptor transitorio potencial vaniloides tipo 1
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