Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Resumen

El microambiente tumoral ácida juega un papel crítico en la progresión tumoral. Para evaluar los efectos del pH extracelular ácido en las células de cáncer in vitro, hemos establecido sistemas de cultivo ácidos simples.

Resumen

Condiciones del microambiente tumoral, tales como hipoxia o nutrientes hambre, juegan un papel crítico en la progresión del cáncer y la malignidad. Sin embargo, el papel del pH extracelular ácido en la agresividad del tumor y su mecanismo subyacente no ha sido extensivamente estudiado en comparación con las condiciones de hambre hipóxico o nutrientes. Además, un método de cultivo bien definidas para imitar el microambiente tumoral extracelular ácido no se ha completamente divulgado.

Aquí presentamos un método de cultivo simple en vitro para mantener el pH extracelular ácido utilizando reducción bicarbonato y lactato aumento o concentración de HCl en el medio de cultivo. El pH del medio fue sostenido durante al menos 24 h y poco a poco disminuyó en 72 h después de cultivo de células de cáncer de páncreas 1 PANC y AsPC-1. Tres condiciones de distintos medios ácidos en este estudio muy upregulated genes pH-sensibles tales como MSMO1, INSIG1y IDI1 compararon con hipoxia o hambre de nutrientes. La regulación al alza de estos genes puede utilizarse como marcador de pH ácido. Estas técnicas sencillas son beneficiosas para dilucidar los mecanismos subyacentes de la malignidad del tumor en el microambiente tumoral ácidos. Por lo tanto, nuestro sistema de cultura extracelular pH ácido permite descubrimiento de respuestas celulares de pH ácido en las células cancerosas, pero también en células primarias, como las células tubulares renales, en relación con los otros ácidos trastornos incluyendo, cetoacidosis diabética, acidosis láctica, la acidosis tubular renal y acidosis respiratoria.

Introducción

El microambiente tumoral juega un papel crítico en la progresión del tumor y cáncer de la célula metabolismo^1,2,3. Las células cancerosas a menudo se exponen a condiciones como hipoxia, la privación de nutrientes y pH extracelular ácido (pHe). Sin embargo, el papel de pHe en la progresión tumoral no ha aclarado tan extensivamente como en hambre hipoxia o nutrientes. El pHe en el tejido del tumor puede ser ácida, llegando a aproximadamente pH 6.8^4,5. El pH ácido se presenta de aeróbica y anaeróbica glicolítica excreció....

Protocolo

1. preparación de medio de cultivo ácidos

1. Preparación de control (pH 7.4) y de medio de cultivo de pH bajo (pH 6.8)
   1. Disolver 4,75 g de polvo DMEM sin L-glutamina en 500 mL de agua.
   2. Preparar 0,33 M NaHCO₃ solución en una botella de presión-apretado.
      PRECAUCIÓN: Es importante utilizar una botella de presión apretado ya que NaHCO₃ emite CO₂ gas cuando se calienta y se descompone térmicamente.
   3. Autoclave el medio y la solución. Permitir estos búferes enfriar a 25 ° C.
   4. Añadir 5 mL de 200 mM L-glutamina, 5 mL de penicilina-estreptomicina y 50 mL de suero fetal bovino a ....

Resultados

Para determinar la concentración adecuada de bicarbonato, preparamos DMEM en el rango de 0 - 8 mM NaHCO₃ (concentración final en el medio de cultivo) y tuvo éxito en la preparación de medios de cultivo con pH entre 6.4-7.4 (figura 1). Preparamos DMEM con 8 mM NaHCO₃ (pH 7.4) como medio de control y 2 mM NaHCO₃ (pH 6.8) como un medio con pH ácido, según un informe anterior indicando que el pH extracelular llegue a pH 6.8 para t.......

Discusión

Aquí, describimos un sistema de cultivo simple pH ácido y su proceso de evaluación. La combinación de tres métodos de acidificación del medio, es decir, concentración de bicarbonato menor, adición de lactato y adición de HCl, nos permitió investigar el mecanismo de respuesta de pH fondo y comparar la respuesta celular a otro tumor microambiental condiciones como hipoxia o alimento del hambre.

La clave de este método es determinar las concentraciones apropiadas de ácido clorhídrico, bi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
reactivos
Medio de águila modificado de Dulbecco" Nissui" 2	Nissui	05919
Suero fetal bovino	Thermo Fisher	10438
NaHCO3	Wako	191-01305
Solución de L-glutamina	Thermo Fisher	25030-081
Solución mixta de penicilina-estreptomicina (estabilizada)	Nacalai	09367-34
0,5 g / l-tripsina / 0,53 mmol / l-EDTA solución, con rojo de fenol	Nacalai	32778-05
Solución de tinción de azul de tripano al 0,5%	Nacalai	29853-34
Solución de ácido láctico	Sigma-Aldrich	252476
Solución de ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	H9892
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	74134
SuperScript IV Sistema de síntesis de primera cadena	Thermo Fisher	18091
Mezcla maestra de PCR verde SYBR de potencia	Biosistemas Aplicados	4368702
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Líneas celulares
PANC-1	ATCC	CRL-1469
AsPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	Banco de células JCRB
TIG	JCRB Banco
MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
NanoDrop One Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen con Wi-Fi	Thermo Fisher	ND-ONE-W
QuantStudio 5	Thermo Fisher	CRL-1682

JCRB0432de Células Sistema de PCR en tiempo real