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Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

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DOI:

10.3791/56662

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13 de diciembre de 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

En este artículo

Resumen

Presentamos los protocolos para el aislamiento de estructuras 3D intestinales del tejido en vivo y en vitro matriz sótano integrado organoides y fijación diversos detalles y protocolos optimizados para el inmuno-etiquetado de microtúbulos, la coloración proteínas centrosómicas y Unión, así como la célula de marcadores como la proteína de la célula de vástago Lgr5.

Resumen

La llegada de las 3D en vitro organoides que imitan la arquitectura de tejido en vivo y la morfogénesis ha avanzado enormemente la capacidad para el estudio de cuestiones biológicas fundamentales en biología celular y del desarrollo. Además, organitas junto con los últimos avances técnicos en la edición de genes y genes virales se compromete a avanzar en la investigación médica y desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de enfermedades. Organoides en vitro en matriz de sótano proporcionan sistemas potente modelo para estudiar el comportamiento y función de proteínas diferentes y se adaptan bien para vivir-la proyección de imagen de proteínas fluorescentes etiquetadas. Sin embargo, establecer la expresión y localización de las proteínas endógenas en tejido ex vivo y in vitro es importante verificar el comportamiento de las proteínas etiquetados organitas. Con este fin hemos desarrollado y modificado aislamiento de tejido, la fijación y el inmuno-etiquetado protocolos para localización de microtúbulos, proteínas centrosómicas y asociados en tejido intestinal ex vivo y en vitro intestinal organitas. El objetivo fue para que el fijador preservar la arquitectura 3D de organoides y tejidos también preservando la antigenicidad de anticuerpo y permitir la buena penetración y remoción de anticuerpos y fijador. Exposición al frío depolymerizes todos pero los microtúbulos estables y esto fue un factor clave cuando se modifica los distintos protocolos. Se encontró que aumentando la concentración de (EDTA) ácida etilendiaminotetracético de 3 mM a 30 mM dio la separación eficiente de las vellosidades y las criptas en el intestino, mientras que 3 mM EDTA era suficiente para las criptas colónicas. El protocolo de fijación formaldehído/metanol desarrollado dio muy buena conservación estructural también conservando antigenicidad de etiquetado eficaz de microtúbulos, actina y las proteínas (EB) final. También trabajó para el ninein proteínas centrosómicas a pesar del Protocolo de metanol más consistentemente. Además establecimos que pueden lograrse la fijación y el inmuno-etiquetado de microtúbulos y proteínas asociadas con organoides aislados o permanecer dentro de la matriz de sótano.

Introducción

Formación de epitelios polaridad apico-basal es un proceso fundamental en el desarrollo e implica una dramática reorganización de los microtúbulos y proteínas centrosómicas. Una matriz de microtúbulos radiales que emanan de un microtúbulos se encuentra organización de centro (COMT) es prominente en muchas células animales y esto es ideal para células relativamente planas. En contraste, las células epiteliales columnares, como las del intestino, montan no radiales transcelular microtubulares que soportan mejor la forma y funciones especializadas de estas células. Esta dramática reorganización de los microtúbulos es alcanzada por el centrosoma hacia el ápice y COMTs no centrosómicos apicales (n-MTOCs) formando, que se convierte en responsable de anclaje de los microtúbulos transcelular1,2 , 3 , 4 , 5.

Gran parte de nuestro conocimiento de la diferenciación epitelial y la reorganización de microtúbulos asociados proviene de las investigaciones de 2D en vitro capas celulares que se muestra la arquitectura de tejidos en vivo . Desarrollo de 3D en vitro organoide culturas por Clevers y colaboradores6, representa un gran avance tecnológico ya que imitan en vivo arquitectura y desarrollo. Una jerarquía de diferenciación epitelial es evidente en el intestino; las células de vástago en la parte inferior de las criptas dan lugar a inmaduro tránsito amplificando células que proliferan y diferencian gradualmente mientras migran hasta la cripta en la pequeña vellosidad intestinal o la superficie colónica, donde ser distinguidos completamente antes de ser arrojar sobre el lumen7. Lo importante, esto se repite en organoides intestinal donde las células del nicho de células madre proliferan formando quistes que posteriormente generan brotes de la cripta-como con las células de vástago en la parte inferior y avanzando gradualmente hacia la región del quiste, la diferenciación que se convierte en vellosidad como8. El organoide intestinal por lo tanto representa un poderoso modelo para el estudio no sólo de microtúbulos y se reorganización durante la diferenciación epitelial pero numerosas otras proteínas, así como proporcionar una plataforma ideal para la detección de drogas y alimentos compuestos de potencial terapéutico beneficia a9,10.

Organoides se adaptan bien para vivir-la proyección de imagen de proteínas fluorescentes etiquetadas y tanto golpe y organoides de knock-out pueden ser generada usando gene CRISPR/Cas9 edición11,12. Sin embargo, establecer la expresión y localización de las proteínas endógenas a estudiar es importante, especialmente para comprobar el comportamiento de las proteínas etiquetados. Inmuno-etiquetado 3D organitas en matriz de sótano o ex vivo aislado el tejido es más complejo que las células cultivadas en platos de la cultura en 2D. El protocolo de fijación debe preservar la delicada arquitectura 3D de organoides todavía conservando antigenicidad de anticuerpos (es decir, los epitopos para atar los anticuerpos). Por ejemplo, 4% paraformaldehido (PFA) es comúnmente usado como un fijador pero mientras que es relativamente rápida fijador y da buena preservación morfológica, en nuestra experiencia con frecuencia resulta en la pérdida de antigenicidad y no es conveniente para muchos anticuerpos se. También debe considerarse la capacidad de los anticuerpos y fijador para penetrar el tejido y las estructuras 3D. Con este fin, hemos modificado y desarrollados protocolos para el aislamiento de tejido y el inmuno-etiquetado indirecto de organoides 3D en vitro y ex vivo aislaron de tejido intestinal. Describimos Cómo aislar pequeñas criptas intestinales y vellosidades y tejido colónico e incluir un protocolo para el aislamiento de organoides 3D como alternativa a la fijación e inmuno-etiquetado dentro de la matriz de sótano. Presentamos tres protocolos de fijación alternativos para el inmuno-etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas, como ninein y proteínas de plus-rastreo de microtúbulos (+ consejos), como las proteínas de la EB y CLIP-170 (véase también referencias8, 13). También discutimos los pros y los contras asociados a cada protocolo.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos fueron realizados según directrices de la Universidad de East Anglia de licencia institucional.

1. aislamiento del tejido Intestinal

  1. Aislamiento de las criptas colónicas para el inmuno-etiquetado (ver figura 1, esquema)
    1. Eutanasia el ratón (con CO2 asfixia) y quitar los dos puntos (comenzando en el intestino ciego y caudal de extracción) con tijeras y pinzas14de disección.
    2. Descarga el contenido del colon con tampón fosfato salino (PBS) con una pipeta de vidrio con bulbo de goma. PBS: cloruro de sodio (8.0 g/L), cloruro de potasio (0,2 g/L), fosfato de hidrógeno disódico (1,15 g/L) y fosfato de biácido del potasio (0,2 g/L), a pH 7,3.
    3. Utilizando una barra de metal (2,4 mm de diámetro) o al final de una pipeta de vidrio, sujete un extremo del tubo colónico deslizando suavemente el tejido sobre la barra/pipeta así vuelco el tejido colónico, por lo que el epitelio está ahora en el exterior.
      Nota: Si esto no es posible abrir entonces el colon con tijeras y rebanada en pedazos de 5 mm.
    4. Transferencia de colon evertidos o piezas a un tubo cónico de 50 mL que contiene 40 mL de PBS.
    5. Invertir el tubo varias veces más quitar contenido intestinal, moco, etc.
    6. Transferir las piezas de colon a 40 mL de EDTA en PBS de 3 mM e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos.
      Nota: Diluir 0.5 M la acción de EDTA pH 8.0 con PBS.
    7. Sacuda para eliminar el moco y las piezas de dos puntos de transferencia a un tubo cónico de 50 mL que contiene 40 mL fresco de 3 mM de EDTA en PBS. Incubar durante 35 min a TA.
    8. Las piezas de dos puntos de transferencia a 10 mL de PBS en un tubo cónico de 50 mL y agitar vigorosamente durante 30 s para liberar las criptas (fracción de la cripta).
    9. Quitar las piezas de dos puntos del tubo y vuelva a colocar 3 mM EDTA en caso de que se requiere aislamiento adicional. Centrifugar la fracción restante de la cripta a 300 x g durante 5 minutos.
    10. Saque 5 mL del sobrenadante y resuspender el precipitado de la cripta en el restante volumen de 5 mL.
    11. Observar bajo un estereomicroscopio con zoom (aumento de 50-100 X) para verificar la presencia de criptas colónicas.
      Nota: Si hay no hay criptas presentes entonces incuban el colon/piezas en 3 mM EDTA en PBS durante otros 30 minutos y luego repiten los pasos 1.1.8 - 1.1.11.
    12. Centrifugar la fracción de la cripta a 300 x g durante 5 minutos.
    13. Retire el sobrenadante de todos para obtener un pellet de cripta y proceder inmediatamente a la fijación (sección 3).
  2. Aislamiento de las criptas intestinales pequeñas y vellosidades para el inmuno-etiquetado (figura 2)
    1. Eutanasia del ratón (con CO2 asfixia) y retire el intestino delgado (duodeno proximal al íleon terminal) con tijeras y pinzas14de disección.
      Nota: para ver diferentes secciones del intestino delgado y en este momento separar y tratar por separado. Ver figura 1 y tabla 1 para un diagrama de flujo y tiempos.
    2. Vaciar el contenido del intestino delgado con PBS utilizando una pipeta de vidrio con bulbo de goma.
    3. Abrir el intestino con tijeras de disección y colocar en 15 mL de PBS en una placa Petri.
    4. Lave suavemente el intestino en PBS para eliminar el contenido luminal y no dañar la superficie de la mucosa. Transferir el tejido a un plato de Petri fresca y repetir el lavado PBS.
    5. Corte el intestino en trozos de 3-5 mm y transferir a un plato de Petri que contiene 15 mL de EDTA en PBS de 30 mM de 100 mm e incubar por 5 min a TA. alternativamente incubar en 3 mM EDTA en PBS durante 30 minutos.
    6. Fracción 1 (aislamiento de vellosidades): transfiera las piezas intestinales en 10 mL de PBS en un tubo cónico de 50 mL, agitar vigorosamente durante 10 s y vierta en una placa de Petri de 100 mm. Compruebe la fracción para aisladas vellosidades bajo un estereomicroscopio. En esta etapa, sobre todo las vellosidades deben estar presentes pero puede variar entre aislamientos.
      Nota: Para evitar aisladas vellosidades/criptas que se pega al plástico, platos de Petri y tubos de recogida debe ser prelacado con suero bovino Fetal (FBS). Vierta FBS en platos o tubos y retírela inmediatamente. Vea la tabla 1 para guia de sincronización para cada fracción.
    7. Transferir las piezas intestinales 30 mM EDTA en PBS e incubar durante 5 minutos. Durante la incubación, recoger fracción 1 en un tubo cónico de 15 mL (cubierto primero con FBS) y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
    8. Fracción 2: Transferencia de piezas intestinales a un tubo cónico de 50 mL que contiene 10 mL de PBS, agitar vigorosamente durante 20 s y luego verter en una placa de Petri de 100 mm. Compruebe la fracción bajo el microscopio. Por lo general, en esta etapa un cultivo mixto de las vellosidades y las criptas están presentes (figura 2A).
    9. Transferencia de piezas intestinales en 30 mM EDTA en PBS e incubar durante un 5 minutos más. Durante la incubación, pellets fracción 2 en un tubo cónico de 15 mL (cubierto primero con FBS) a 300 x g por 5 minutos Retire el sobrenadante de fracciones 1 y 2 sin perturbar el pellet y proceder inmediatamente a la fijación (paso 3).
    10. Fracción 3 (aislamiento de la cripta): transfiera las piezas intestinales en 10 mL de PBS en tubo de 50 mL, agitar durante 20 s y vierta en una placa de Petri de 100 mm. Fracción de cheque bajo el microscopio. En esta etapa, la fracción contendrá predominantemente criptas (figura 2B).
    11. Fracción 4: Transferir las piezas intestinales en 10 mL de PBS, agitar durante 20 s y vierta en una placa de Petri de 100 mm. Fracción de cheque bajo el microscopio. En esta etapa sólo criptas deben estar presentes.
    12. Fracción 5: Transferir las piezas intestinales en 10 mL de PBS, agitar durante 20 s y vierta en una placa de Petri de 100 mm. Fracción de cheque bajo el microscopio. Generalmente, en esta etapa, se extraen las criptas muy pocos. Si se extraen las criptas más de unos pocos, luego continuar con una fracciónXX 6.
      Nota: Si se desea una población pura cripta (por ejemplo, para la generación de organoide), entonces use un colador de célula 70 de μm para remover cualquier vellosidades intactas de la fracción enriquecida de cripta.
    13. Recoger fracciones 3-5 en tubos cónicos de 15 mL separados y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
    14. Compruebe las pelotillas de fracciones 3 - 5 y retire el sobrenadante sin molestar a los pellets y proceder inmediatamente a la fijación (sección 3).

2.Aislamiento de organoides Intestinal de sótano matriz domos en placas de 24 pocillos

Nota: La formación de organoides en sótano matriz cúpulas ha sido descrito en otra parte12.

  1. Capa de pozos con sótano bóveda de matriz según las instrucciones del fabricante.
  2. Pozos de lavado que contiene sótano matriz domos con 500 μl de PBS.
  3. Añadir frío 250 μl de solución de recuperación de la célula (4 ° C) a cada pozo (véase Tabla de materiales).
    Nota: La solución de recuperación celular frío a despolimerizar microtúbulos todo pero estables.
  4. Raspar las cúpulas de la matriz de sótano utilizando una micropipeta P1000 y cuidadosamente pipetee hacia arriba y hacia abajo en el pozo a la desintegración y quitar la matriz sótano de plástico.
  5. Recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL baja obligatoria.
  6. Invertir el tubo de 1,5 mL vinculante bajo varias veces y comprobar bajo el microscopio si el organitas han sido aislados y están libres en movimiento y no en grupos. Sostenga el tubo bajo un estereomicroscopio y vista con aumento de bajas (50 X).
  7. Los organoides de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a TA.
  8. Eliminar el reactivo de recuperación y proceder inmediatamente a la fijación (paso 3).

3. fijación del tejido Intestinal aislado y organitas

  1. Fijación de metanol
    1. Resuspender la fracción de la cripta/vellosidad intestinal aislado en 10 mL y organitas en 1 mL de metanol a-20 ° C.
    2. Incubar las criptas, vellosidades/organitas a-20 ° C en un congelador durante 15 minutos e invierta los tubos cada 5 min.
    3. Las criptas/vellosidades/organoides de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos.
    4. Eliminar el metanol y agregar solución de lavado (1 mL de organoides y 10 mL para las fracciones aisladas de la cripta/vellosidad). La solución de lavado puede o bien consistir en PBS con 1% de suero o PBS con 0,1% detergente y 1% de suero.
      Nota: Use el suero de la misma especie que la de los anticuerpos secundarios. Por ejemplo, si los anticuerpos secundarios se obtuvieron en cabra luego usar suero de cabra.
    5. Centrifugar inmediatamente, las criptas, vellosidades/organitas a 1.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten.
    6. Retire la solución de lavado y resuspender las criptas/vellosidades/organoides en solución de lavado fresca.
    7. Coloque en un tubo de los rotadores con la velocidad a 20 rpm. Lavar las células para un total de 1 h, granulación criptas/vellosidades/organoides por centrifugación (1.000 x g durante 5 min) cada 15 minutos y reemplazar la solución de lavado.
      Nota: Si no se dispone de un agitador de tubo entonces invierta los tubos manualmente cada 5 min para resuspender las culturas aisladas.
  2. Fijación de formaldehído/metanol
    Nota: Maneje los fijadores y formaldehído en una campana de humos.
    1. Resuspender las criptas/vellosidades aisladas en 10 mL u organitas en 1 mL de solución fijadora de-20 ° C (9,2 mL de metanol con 800 μl de solución de formaldehído).
    2. Fijar las criptas/vellosidades/organitas a-20 ° C en un congelador durante 15 minutos e invierta el tubo cada 5 min.
    3. Las criptas/vellosidades/organoides de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos.
    4. Eliminar el formaldehído/metanol y agregar solución de lavado (1 mL para organoides o 10 mL para las fracciones aisladas criptas/vellosidad). La solución de lavado puede o bien consistir en PBS con 1% de suero de cabra o PBS con 0,1% detergente y 1% de suero.
    5. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las criptas/vellosidades/organitas.
    6. Retire la solución de lavado y resuspender en solución de lavado fresca.
    7. Coloque en un tubo de los rotadores con la velocidad a 20 rpm. Lavar las células para un total de 1 h, granulación criptas/vellosidades/organoides por centrifugación (1.000 x g durante 5 min) cada 15 minutos y reemplazar la solución de lavado.
  3. Fijación de PFA
    PRECAUCIÓN: Polvo PFA y soluciones deben manejarse en una campana de humos.
    Nota: En la mayoría de los casos 4% se utiliza PFA en PBS pero dependiendo de la preservación de la antigenicidad de anticuerpo, se pueden utilizar concentraciones más bajas.
    1. Resuspender las criptas/vellosidades pildoradas aisladas en 10 mL 4% PFA e incube a temperatura ambiente durante 1 h, y los aislados peleteado organitas en 1 mL 4% PFA e incube durante 30 minutos. En ambos casos invertir los tubos cada 10 minutos.
    2. Las criptas/vellosidades/organoides de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos.
    3. Quite la PFA y agregue solución de lavado (1 mL de organoides y 10 mL para criptas aisladas/vellosidades). La solución de lavado consiste en PBS con 0,1% detergente y 1% de suero.
    4. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las criptas/vellosidades/organitas.
    5. Retire la solución de lavado y resuspender en solución de lavado fresca.
    6. Coloque en un tubo de los rotadores con velocidad a 20 rpm. Lavar las células para un total de 1 h, granulación criptas/vellosidades/organoides por centrifugación (1.000 x g durante 5 min) cada 15 minutos y reemplazar la solución de lavado.
      Nota: Si no se dispone de un agitador de tubo entonces invertir los tubos manualmente cada 5 min para resuspender las culturas aisladas.
    7. Recuperación de antígeno (paso opcional recomendado para la fijación de la PFA)
      1. Las criptas/vellosidades/organoides de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
      2. Añadir de 1 a 10 mL de 10 mM de citrato de sodio de pH 6.0 (previamente calentado a 80 ° C) e incubar a 80 ° C por 20 minutos.
      3. Las criptas/vellosidades/organoides de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
      4. Añadir de 1 a 10 mL de dulce mM 10 de citrato de sodio pH 6.0 (previamente calentado a 80 ° C) e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
      5. Las criptas/vellosidades/organoides de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
      6. Lave 1-10 mL de PBS con 1% de suero y repetir una más 3 veces granulación criptas/vellosidades/organoides por centrifugación (1.000 x g durante 5 min) antes de agregar la solución de lavado fresca.

4. bloqueo de paso

  1. La solución de bloqueo: Añadir suero de especie de anticuerpo secundario de 10% en PBS (opcional: Añadir 0,1% detergente).
  2. Las criptas/vellosidades/organoides de pellets por centrifugación (1.000 x g durante 5 min) y eliminar el sobrenadante.
  3. Añadir 5-10 mL de la solución de bloqueo según número de muestras necesarias (ver nota más abajo). En esta etapa, divide la solución criptas/vellosidades/organoides en tubos individuales (tubos de enlace baja 1,5 mL microcentrífuga con cada tubo que contiene de 0.2 - 1 mL) para la tinción con los anticuerpos diferentes.
    Nota: Cada fracción de criptas aisladas/vellosidades dará entre 5-10 muestras que pueden ser utilizadas para diferentes combinaciones de etiquetado dependiendo del tamaño de la pelotilla. Lo ideal es un tamaño de pellet entre 2-4 mm se requiere para cada muestra.
Diferentes fracciones pueden ser combinados en esta etapa como criptas y vellosidades pueden ser fácilmente identificados (figura 2).
  • Incubar en el bloqueo de la solución a temperatura ambiente en un agitador de tubo para 1 h.

    • 5. primaria del anticuerpo incubación

    1. Diluir los anticuerpos primarios (véase Tabla de materiales) en PBS con 10% suero y 0.1% de detergente. Entre 100 a 200 μL solución de anticuerpo primario se requiere muestra de tubo de microcentrífuga.
    2. Retirar la solución de bloqueo por centrifugación (1.000 x g durante 5 min).
    3. Resuspender el precipitado de criptas/vellosidades/organoide en la solución de anticuerpo primario e incube a 4 ° C durante la noche con un agitador de tubos (20 RPM) para mantener las criptas/vellosidades/organoides en suspensión.
    4. Al día siguiente: traer las muestras a RT para 1 h en el rotador de tubos (20 rpm).
    5. Pellet de la muestra por centrifugación (1.000 x g durante 5 minutos) y retire la solución de anticuerpo primario.
    6. Añadir 1 mL de solución de lavado y resuspender las pelotillas de la cripta/vellosidad/organoide.
    7. Retire inmediatamente la solución por centrifugación (1.000 x g durante 5 min).
    8. Añadir 1 mL de solución de lavado fresca y centrifugar las células en un tubo de los rotadores (20 rpm) durante 2 horas. Cambiar la solución de lavado por centrifugación cada 30 minutos como en el paso 5.7.

    6 incubación del anticuerpo secundario

    1. Diluir los anticuerpos secundarios (véase Tabla de materiales) en PBS con 10% suero y 0,1% detergente. Cerca de 200 μL de solución de anticuerpo secundario se requiere muestra de tubo de microcentrífuga.
      Nota: Anticuerpos altamente absorbida de Cruz deben utilizarse para reducir la reactividad de anticuerpos secundarios en ratón cripta/vellosidad/organoide.
    2. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min de la pelotilla de la criptas/vellosidades/organoides y resuspender el pellet en 200 μL de solución de anticuerpo secundario.
    3. Girar los tubos en un tubo de los rotadores (20 rpm) a temperatura ambiente durante 1 hora.
    4. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min de la pelotilla de la criptas/vellosidades/organoides y quitar los sobrenadantes (anticuerpos secundarios no enlazado).
    5. Resuspender el precipitado en la solución de lavado y centrifugar inmediatamente a 1.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las criptas/vellosidades/organitas.
    6. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de solución de lavado fresca.
    7. Girar en un tubo de los rotadores (20 rpm) a temperatura ambiente para 1.5-2 h, cambiando la solución de lavado cada 20-30 min como se describió anteriormente en los pasos 6.6 6.3.

    7. nuclear mancha

    1. Diluir el colorante nuclear en la solución de lavado (según protocolo del fabricante), como DAPI o Hoechst. Por ejemplo: solución madre de DAPI (20 mg/mL) es diluido 1:10, 000. La solución se puede guardar en alícuotas a-20 ° C.
    2. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min de la pelotilla de la criptas/vellosidades/organoides y quitar la solución de lavado.
    3. Resuspender el precipitado en la solución de contratinción nuclear.
    4. Girar en un tubo de los rotadores (20 rpm) a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    5. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a criptas/vellosidades/organoides de la pelotilla, retirar la solución de tinción nuclear y resuspender el precipitado en la solución de lavado.
    6. Girar en un tubo de los rotadores (20 rpm) a temperatura ambiente durante 30-60 min, cambiando la solución de lavado cada 10 minutos.

    8. montaje aislado criptas, vellosidades y organitas

    1. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min de la pelotilla de la criptas/vellosidades/organoides y quitar toda la solución de lavado.
      Nota: Si el pellet se dispersa, luego centrifugar nuevamente.
    2. Añadir 2 gotas de duro ajuste montaje medios con agente antifade a la pelotilla.
    3. Corte el extremo de una micropipeta de P200 y cuidadosamente Resuspender el precipitado en el medio de montaje. Evitar la generación de burbujas.
      Nota: Las culturas aisladas organoides son muy pegajosas; Asegúrese de volver a suspender plenamente.
    4. Uso de la micropipeta para transferir la mezcla de vellosidades/criptas/organoides en la solución de medios de montaje y dispensar en una línea por el centro de un portaobjetos de microscopio.
      Nota: La línea no debe ser más larga que la cubierta de vidrio que debe ser utilizado. Comprobar mediante un estereomicroscopio si criptas/vellosidades/organoides son bien extendidos sobre portaobjetos y no agrupados.
    5. Con cuidado, coloque un cubierta de vidrio sobre la parte superior; evitar la generación de burbujas.
    6. Coloque el portaobjetos de cristal en una diapositiva y almacenar en un refrigerador durante la noche para los medios de montaje antes de analizar en un microscopio confocal.
      Nota: Para el anticuerpo de ratón manchas en tejidos de ratón, utilice la inmunofluorescencia comercial kit (véase Tabla de materiales). Vuelva a colocar el paso de bloqueo (sección 4) con un bloque de 10 minutos con solución de bloqueo, seguido por una incubación de 1 h con el reactivo de bloqueo que viene con el kit de la proteína. Entonces a paso 5.8 (en el centro de lavado) Agregue una 1 h de incubación con el reactivo de potenciador de señal de fluorescencia. Luego use el reactivo del kit en fluorescentes diluyentes (otros anticuerpos secundarios pueden usarse en combinación con este reactivo). Incubar como se indica arriba y proceder desde el paso 6 con el resto del protocolo.

    9. fijación y el inmuno-etiquetado de organoides dentro de matriz de sótano

    Nota: Organoides destinados para la fijación e inmuno-etiquetado permaneciendo dentro de la matriz de sótano se generaron en sótano matriz cúpulas en la parte superior redonda de vidrio cubreobjetos en un plato 24-well (un domo por pozo). Las cúpulas de matriz del sótano de organoide se procesaron dentro de la placa de 24 pocillos por la adición y la eliminación de las distintas soluciones.

    1. Retire el medio de pozos y añadir este fijador; dejar durante 1 hora.
    2. Retirar el fijador y lavado en PBS con 1% de suero y 0,1% detergente por 2 h, cambiando cada 30 minutos.
    3. Retire la solución de lavado y bloquear en PBS con 10% suero y 0,1% detergente durante 1 hora.
    4. Diluir los anticuerpos en PBS con 1% de suero o PBS con 1% suero y 0,1% detergente.
    5. Retirar la solución de bloqueo y añadir anticuerpo primario de 100-200 μL solución (véase Tabla de materiales) a cada pocillo.
      Nota: es importante quitar toda la solución de bloqueo para no diluir más los anticuerpos.
    6. Coloque la placa en la nevera e incubar durante una noche a 4 ° C
    7. A continuación dejo a temperatura ambiente durante 1-2 h.
    8. Retire la solución de anticuerpo y lavado para 2-3 h cambio de la solución de lavado cada 20 minutos.
    9. Retire toda la solución colada y añadir 100-200 μL anticuerpos secundarios diluido (véase Tabla de materiales) en PBS con 1% de suero; Incubar durante 1 h a TA.
    10. Retire la solución de anticuerpo secundario y lavado por 2 h, cambiando cada 20 minutos.
    11. Retirar la solución de lavado y añadir solución DAPI; dejar durante 10 minutos en solución RT. uso DAPI (20 mg/mL) diluido al 1:10, 000.
    La solución se puede guardar en alícuotas a-20 ° C.
  • Retire la solución DAPI y lavado durante 40 minutos, cambiando cada 10 minutos.
  • Con unas pinzas, quitar el cubreobjetos de vidrio con la cúpula de la matriz de sótano y colocar sobre un portaobjetos con la cúpula de la matriz de sótano hacia arriba; Añadir unas gotas de medio de montaje y luego un cubreobjetos de cristal en la parte superior.
  • Coloque el portaobjeto en un libro de diapositiva y dejar en la nevera durante la noche para los medios de montaje fijar.

    • Resultados

    Aislamiento de tejido intestinal para el inmuno-etiquetado
    Los protocolos de aislamiento de tejido descrito para el colon y el intestino se optimizaron para la preservación y el inmuno-etiquetado de microtúbulos y proteínas asociadas, pero no para la viabilidad de la célula de vástago y generación de organoides (figura 1 y tabla 1 ). El objetivo fue generar la cripta y las facciones de vellosidad que eran como limpiar (carente de mucosa y otros tejidos) como sea posible, reduciendo al mínimo la exposición al EDTA y al frío para preservar la estructura y evitar la despolimerización de los microtúbulos con soluciones frías de hielo, que inducen despolimerización de los microtúbulos todo pero estables. La figura 2 muestra ejemplos de imágenes de fracciones 2 y 3 de tejido intestinal pequeña aislado, con fracción 2 que contiene una mezcla de vellosidades y criptas (figura 2A, B), mientras que la fracción 3 contiene principalmente las criptas (figura 2 D).

    Fijación y el inmuno-etiquetado de tejido intestinal aislado
    Las fracciones individuales o combinadas entonces fueron procesadas para la fijación y el inmuno-etiquetado a través de una serie de pasos, incluyendo fijación, detergente, bloqueo, anticuerpo y soluciones de lavado antes de volver a suspender las finales vellosidades/criptas pellets en medios de montaje, transfiriendo a las diapositivas y cubrir con cubreobjetos de vidrio. Las criptas y vellosidades fueron luego reflejadas en un microscopio confocal.

    Buena conservación y etiquetado de microtúbulos y actina en las vellosidades y criptas fue alcanzada por el siguiente: una combinación de fijación formaldehído/metanol a-20 ° C, repetir el lavado en PBS con 0,1% detergente y 1% suero y bloqueo en PBS con un 0.1% detergente y 10% suero, seguido por la incubación a 4 ° C en anticuerpos primarios y luego de 2 h en secundarios anticuerpos a temperatura ambiente (figura 3). Fijación formaldehído/metanol también trabajó bien para etiquetar + consejos como el EBs y el CLIP-170 en aislados criptas y vellosidades (figura 4). EB3 acumulaciones en el más extremo de los microtúbulos (conocidos como cometas) eran evidentes en las criptas (Figura 4A), mientras que la asociación a lo largo de la red de microtúbulos estables podría verse en las muestras de las vellosidades (figura 4). Distinta localización del CLIP-170 y p150laminada (subunidad de dynactin) era claramente evidente en las n-COMTs apicales en aisladas vellosidades (Figura 4B). Fijación con el protocolo de formaldehído/metanol no funcionaba constantemente para ninein localización en tejido intestinal aislado usando nuestro anticuerpo Pep3 contra ratón ninein. Sin embargo, fijación de metanol a-20 ° C seguido por el mismo lavado y bloqueo de soluciones en cuanto a formaldehído/metanol dio muy buena localización de ninein dentro de criptas aisladas y las vellosidades (figura 5, referencia8). Curiosamente, mientras se concentra en los centrosomas apicales ninein algunos acumulación en la base de la célula era evidente en algunas células dentro de criptas aisladas (figura 5). Si esto es debido a etiquetado inespecífica o una consecuencia de la demora del procedimiento de aislamiento fijación (y así afectar la preservación) necesitará más investigación. Sin embargo, secciones de criostato de metanol fija (-20 ° C) de las vellosidades (véase figura 3bi en8) también revelaron ninein en la célula de base en algunas células sugiriendo ninein también puede asociarse a una población básica de los microtúbulos.

    Fijación y el inmuno-etiquetado de organitas aislado de matriz de sótano
    Pequeños organoides intestinales se genera y cultivadas en matriz sótano durante tres semanas o más (figura 6A,6,de referencia15). Un frío (4 ° C) solución de recuperación de la célula fue utilizada para aislar organoides de la matriz de sótano. La solución matriz de sótano depolimerizada con organoides fue transferida a tubos y centrifugada antes de la fijación y el inmuno-etiquetado. Esto produce preparaciones muy limpias y permite buen acceso a los organoides de las distintas soluciones. Las células diferenciadas dentro de los dominios de la vellosidad de organoides contienen microtúbulos apico-basal estables; estos etiquetados así en la mayoría de los casos (Figura 6B, C) y EB1 también pudo verse a lo largo de la red de microtúbulos (figura 6E; referencia13). Sin embargo, la solución de recuperación de frío celular puede resultar en la despolimerización de los microtúbulos dinámicos, que era evidente en algunas muestras de la falta de EB1 cometas (que se unen al más extremo de microtúbulos creciente) dentro de los dominios de la cripta basal (figura 6F ). En otras muestras, astrales microtúbulos (dinámicos) se conservan (figura 6). Organoide de aislamiento antes de la fijación y el inmuno-etiquetado también trabajó para proteínas de Unión, ninein, CLIP-170 y marcadores de la célula, como la mucina por las células caliciformes y el chromogranin A por células enteroendocrinas.

    Fijación y el inmuno-etiquetado de organitas dentro de matriz de sótano
    Figura 7     un organoide se muestra en la fase de quiste (A–C) y en una etapa temprana del desarrollo de la cripta (D), fijado en formaldehído/metanol e inmuno-etiquetado de microtúbulos y ninein. Microtúbulos buena preservación y etiquetado así como la etiqueta para ninein en apicales n-COMTs era evidente. Figura 8A, B muestra un dominio de cripta dentro de un día 6 organoide fijo con el protocolo de metanol y etiquetados para los microtúbulos y EB1. Buena conservación de los microtúbulos y EB1 cometas era evidente que sugiere la preservación de los microtúbulos dinámicos.

    Organoides también eran fijos e inmuno-etiquetado permaneciendo dentro de la matriz de sótano. Las desventajas de este procedimiento pueden ser pobre penetración del fijador y la captura de anticuerpos dentro de la matriz de sótano (figura 8B), aunque en ambos casos menos frecuentemente cuando 0,1% detergente fue incluido en el fijador o soluciones de lavado. Además, 4% PFA no preservar la matriz de sótano bien pero hizo disolver, aunque éste era menos que 1% PFA.Fijación de metanol, por otro lado, a veces inducida por colapso de organoide.

    Etiquetado con algunos anticuerpos como contra la célula de vástago marcador Lgr5 y Paneth células marcador CD24 fracasado probada con los protocolos PFA, metanol o formaldehído/metanol de 4%. Sin embargo, los organoides de fijación dentro de la matriz de sótano con 1% PFA en PBS con 0,1% detergente a temperatura ambiente produjo etiquetado para Lgr5 y CD24 (figura 9).

    Diagrama del proceso de aislamiento de criptas del intestino delgado; Lavado PBS, tratamiento con EDTA, análisis de fracciones.
    Figura 1: aislamiento de pequeñas vellosidades intestinales y criptas. Diagrama de flujo de los pasos claves de pequeñas vellosidades intestinales y el aislamiento de la cripta antes de la fijación y el inmuno-etiquetado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Imágenes microscópicas de vellosidades intestinales y criptas en el experimento de fraccionamiento; Detalle de la estructura del tejido.
    Figura 2: aisladas vellosidades y criptas de intestino de ratón pequeño. Imágenes de microscopio de Brightfield de fracciones intestinales mostrando (flechas grandes) las vellosidades y criptas (flechas pequeñas). (A, B) Fracción 2 contiene una mezcla de vellosidades y criptas, y preservación de la morfología de las vellosidades y la cripta es evidente en B. (C, D) Fracción 3 muestra el aislamiento de las criptas y ausencia de vellosidades y criptas intactas incluyendo una cripta bifurcada en C. Barras de escala = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Diagrama del intestino delgado que muestra vellosidades, diferenciación de criptas y células epiteliales; resultados de microscopía.
    Figura 3: aisladas pequeñas vellosidades intestinales y cripta fijado en formaldehído/metanol y el inmuno-etiquetado de microtúbulos y actina. (A) esquema del epitelio de la vellosidad y la cripta con diferentes tipos de células indicados. Los cuadros resaltados indican las regiones representativas imágenes en B y C. (B, C) Secciones ópticas confocales por parte de una vellosidad (B) y basal cripta (C) aislado del intestino utilizando 30 mM EDTA y fijado en formaldehído/metanol, lavado en PBS con 1% cabra suero y 0,1% detergente, bloqueados en PBS que contiene 10% de suero de cabra y 0,1% detergente y etiquetada microtúbulos con anticuerpo monoclonal de anti-tubulina de rata (verde) y actina con anticuerpo policlonal de conejo anti-β-actina (rojo). Bien conservado apico-basal paquetes de microtúbulos son evidentes en las células de la vellosidad y la cripta, y la actinia se aprecia concentrado en la región apical hacia el lumen (flecha). Barras de la escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Microscopía confocal de cripta intestinal y vellosidades con microtúbulos, tinción CLIP-170, EB3 y DAPI.
    Figura 4: Aislada pequeña cripta intestinal y las vellosidades fijas en formaldehído/metanol y el inmuno-etiquetado de microtúbulos, EB3, p150laminaday CLIP-170. Secciones ópticas confocales de cripta y vellosidades regiones aisladas del intestino utilizando 30 mM EDTA y fijado en formaldehído/metanol, lavado en PBS con 10% de suero de cabra y 0,1% detergente, bloqueado en PBS con 10% de suero de cabra y 0,1% detergente, y inmuno-etiquetado. (A) cripta marcados con anticuerpos policlonales de α-tubulina (rojo) y el anticuerpo monoclonal de rata EB3KT36 (verde) y teñidos para DNA con DAPI (azul) que muestra los microtúbulos apico-basal y EB3 cometas. La imagen de canal invertido muestra claramente EB3 cometas a lo largo de las células basales de la cripta sugiriendo la buena preservación de la dinámica así como microtúbulos estables. Vellosidad (B) células epiteliales marcadas con anticuerpo policlonal de conejo CLIP-170 (ver rojo, también referencia16) y co-localización de anticuerpos (verde) muestra apical delaminada p150 monoclonal del ratón. Imágenes de canal invertido se muestran a continuación. (C) células de la vellosidad marcada con anticuerpos policlonales de α-tubulina (rojo) y el anticuerpo monoclonal de rata EB3-KT36 (verde) y teñidos para DNA con DAPI (azul) con microtúbulos apico-basal con EB3 a lo largo de la red. La Asociación de enrejado de EB3 está resaltada en la imagen ampliada mientras que la imagen invertida solo canal sugiere Asociación de enrejado y EB3 cometas. Barras de la escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Imágenes celulares de inmunofluorescencia, marcadores de nineína / E-cadherina / DAPI, análisis de localización de proteínas.
    Figura 5: cripta de colon aislado fijadas en metanol, inmuno-etiquetado para ninein y E-cadherina y teñidas con DAPI. Sección óptica confocal de la basal y tránsito amplificando la región de una cripta aislado del colon usando 3 mM EDTA y fijadas en metanol, lavado en PBS con suero de cabra de 1% y 0,1% detergente y bloqueado en PBS con 10% cabra suero y 0,1% detergente. La cripta fue etiquetada con anticuerpos de conejo policlonales ninein (Pep3, véase también la referencia8, rojo) y anticuerpo monoclonal de la E-cadherina (verde) del ratón y teñidas con DAPI (azul). La imagen de canal invertido muestra ninein solamente. La imagen muestra una cripta muy bien conservada con E-cadherina revelar el contorno de las células individuales y ninein concentrado en los centrosomas apicales. Sugiere buena penetración del fijador y los anticuerpos y la preservación de antigenicidad. Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Diagrama de desarrollo de organoides; las imágenes de microscopía muestran etapas de crecimiento, tinción de B-catenina y estructuras.
    Figura 6: organoide desarrollo, fijación y el inmuno-etiquetado de aislaron organitas. (A) fase contraste imágenes mostrando diferentes etapas de desarrollo de organoide de agregados de células quiste con la iniciación del brote y completamente formado organoides con dominios de cripta y vellosidad.(B–F) Confocales secciones ópticas a través de organoides de matriz de sótano utilizando solución de recuperación de células a 4 ° C (10 min) seguido de fijación formaldehído/metanol, lavado en PBS con 10% de suero de cabra y 0,1% detergente, bloqueo en PBS con 10% de cabra suero y el 0,1% detergente, inmuno-etiquetado de microtúbulos, β-catenina y EB1. (B) Quiste organoide por microtúbulos (azul) y β-catenina (rojo) revelando la preservación buena microtúbulos y etiquetado en la mayoría de las células. (C) distintos microtúbulos apico-basal son evidentes en estas células epiteliales agrandadas de un quiste de organoide. (D) División de células para los microtúbulos mostrando ejes incluyendo microtúbulos astrales (dinámicos) (flecha). (E, F) Dominio de la vellosidad (E) y cripta dominio (F) organoide regiones mostrando algunos EB1 etiquetado a lo largo del entramado de microtúbulos estables, especialmente en las vellosidades, mientras que muy pocos cometas EB1 se ven incluso dentro de la cripta basal, sugiriendo esa dinámica microtúbulos no se han conservado. Barras de escala = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E y F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Microscopía de quistes organoides; teñido con Ninein, MT, DAPI; desarrollar la estructura del quiste; Análisis de fluorescencia.
    Figura 7: organoides fijo dentro de la matriz de sótano en formaldehído/metanol y el inmuno-etiquetado de microtúbulos y ninein. Secciones ópticas confocales de organoides fijado en formaldehído/metanol, lavaron y bloquearon en PBS con 10% de suero de cabra y 0,1% detergente y etiquetado permaneciendo en la matriz de sótano. (A–C) Organoide etiquetados para los microtúbulos (verde) y ninein (Pep3; referencia8, rojo) y teñidos con DAPI (azul) que muestra la imagen fusionada en y había invertida imágenes de canal único de microtúbulos (B) y ninein (C). Las imágenes muestran los microtúbulos apico-basal y apical ninein localización, sugiriendo muy buena conservación estructural de los organoides y penetración de anticuerpos así como compensación de los anticuerpos no Unidos. (D, E) Organoide con desarrollo de cripta fijo y marcado como el anterior y otra vez mostrando excelente preservación estructural, etiquetado y eliminación de anticuerpos. Distintos microtúbulos apico-basal y apical n-COMT ninein localización es evidente y destacada en la imagen ampliada (E) de la región en caja en D. Barras de la escala = 10 μm (A-d); 5 μm (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Diagrama de cripta organoide; microscopía de fluorescencia; tinción EB1, MT, DAPI; detalle estructural.
    Figura 8: organoides fijo dentro de la matriz de sótano en metanol y el inmuno-etiquetado de microtúbulos y EB1. Secciones ópticas confocales de organoides fijadas en metanol, lavaron y bloquearon en PBS con suero de cabra 10% y 0,1% detergente y marcados, permaneciendo en la matriz de sótano. (A) dominio de un completamente desarrollado organoides marcado con conejo policlonal α-tubulina (rojo) y ratón anticuerpos monoclonales EB1 (verde) que muestra los microtúbulos apico-basal, husos (flecha) en dos células divisorias y distintas cometas de EB1. Algunas captura de anticuerpos no Unidos EB1 es evidente. Sin embargo, se observa buena conservación estructural y etiquetado de microtúbulos y EB1. La presencia de cometas EB1 sugiere que se han conservado los microtúbulos dinámicos (una, invertir). (B) imagen invertida de organoide región de quiste con α-tubulina anticuerpo etiquetado con anticuerpos considerable atrapados dentro de la matriz circundante del sótano (flecha). Barras de la escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Tinción de organoides; marcadores CD24, Lgr5; imagen de microscopía; Análisis de diferenciación celular.
    Figura 9: organoides fijada dentro de la matriz del sótano en el 1% PFA y el inmuno-etiquetado para Lgr5 y CD24. Secciones ópticas confocales de organoides fijo dentro de la matriz del sótano en el 1% PFA en PBS con un 0.1% detergente, lavar en PBS con 1% de suero de cabra y 0,1% detergente y marcado con anticuerpos contra Lgr5 y CD24. (A, B) Nicho de células madre dentro de un dominio de cripta mostrando células de Paneth positivo para CD24 (rojo). Las imágenes de contraste de fase y confocales se han fusionado en el A. B muestra el etiquetado de canal único de CD24. Región de la célula de vástago (C) dentro de un dominio de cripta mostrando un Lrg5 positivo de la célula madre. Barras de la escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Gráfico del proceso de fraccionamiento celular; cronograma para EDTA, tratamientos PBS, pasos de centrifugación.
    Tabla 1: cronograma del pequeño aislamiento cripta y las vellosidades intestinal y fijación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Discusión

    Aislamiento del tejido intestinal
    Aislamiento de pequeñas criptas intestinales, las vellosidades y criptas colónicas consiste en exponer la superficie de la mucosa, el tratamiento con solución de EDTA para aflojar la centrifugación, fraccionamiento (temblor) y contacto. Se ha modificado el protocolo de aislamiento intestinal presentan vellosidad/cripta de Belshaw et al. y Whitehead et al. 17 , 18

    Exponer la superficie de la mucosa
    Hemos experimentado con un número de enfoques para exponer la superficie mucosa del tracto intestinal en el desarrollo de este procedimiento. Un enfoque clásico es evert (vuelta adentro hacia fuera) el tubo, generalmente en segmentos de aproximadamente 100 mm de largo, con una varilla metálica que está atrapada en un pliegue del tejido en un extremo y luego el tubo restante se deslizó sobre el tubo19. Para el tejido del ratón, una barra de metal (2,4 mm de diámetro) con los extremos redondeados es ideal. Este enfoque tiene la ventaja de ampliar la superficie de la mucosa que permite el acceso a la PBS y EDTA. Al principio utiliza este enfoque pero se trasladó a cortar el tubo de corta longitud (unos 5 cm) y apertura de cada sección con tijeras de disección como esto resultó más fácil. Este enfoque es apropiado si sólo tienen unos intestinos; pero si más animales debían ser utilizados en un experimento entonces un dispositivo especialmente diseñado para corte abierto el tubo longitudinalmente, como se describe por Yoneda et al. 14 sería más eficiente.

    Separación de las vellosidades y las criptas de la capa muscular
    Inicialmente se utilizó EDTA en PBS y tiempos de incubación relativamente largo de hasta 60 min de 3 mM para aflojar la superficie de la mucosa de la subyacente tejido17,18. En esta concentración de EDTA encontramos que un tiempo de incubación de 30 min era suficiente para aflojar las criptas del colon de ratón. Sin embargo, para el aislamiento de cripta/vellosidad del intestino intentamos utilizando EDTA concentrado para un tiempo más corto, que ha demostrado para ser un enfoque eficaz. Se realizó todo el trabajo posterior con el tejido extraído mediante la técnica de EDTA 30 mM generando importantes fracciones de las vellosidades o criptas. Para criptas, normalmente se agruparon fracciones 3-5 antes de fijar, pero es importante verificar si estos son las fracciones adecuadas según los tiempos dependerá de una serie de factores como la posición a lo largo del tracto intestinal, la edad del ratón, la inflamación, la dieta anterior , etc. de manera similar, la longitud del tiempo el tejido necesita ser sacudido tras el tratamiento de EDTA sea eficaz puede variar bajo diferentes condiciones. El resultado es fracciones de tejido aislado que contiene una mezcla de vellosidades y criptas o principalmente las vellosidades o criptas (figura 2). Como en el colon no hay vellosidades, la extracción de la cripta puede ser posible en un solo paso sacudiendo el tejido en tubo de 30 s. Estas fracciones pueden fijarse y procesadas para el inmuno-etiquetado.

    Aislamiento de organoides intestinal de matriz de sótano
    Aislamiento de organoides de sótano matriz cúpulas se logra mediante el uso de solución de recuperación de la célula. La solución trabaja por depolymerizing la matriz gelificada sótano pero el temperatura debe ser entre 2-8 ° C. Una nota de precaución es que los microtúbulos dinámicos no pueden ser preservados. Así, para el inmuno-etiquetado de microtúbulos dinámicos y + consejos como la celda EBs, recuperación de la matriz basal antes de la fijación no es recomendable. Sin embargo, la mayoría de los microtúbulos en las células diferenciadoras del organoide es relativamente estable y estos fueron preservados (figura 6). También trabajó bien para el inmuno-etiquetado de proteínas centrosómicas y Unión como marcadores de la célula.

    Protocolos de fijación
    Formaldehído (recién hecha de PFA) es un fijador de acción relativamente rápida que forma reversible aglutina y 4% PFA funciona bien por ejemplo, en el inmuno-etiquetado microtúbulos y gamma tubulina y filamentos de actina tinción con Phalloidin. Más diluído soluciones PFA como 1% trabajado bien para el inmuno-etiquetado por ejemplo, con el marcador de célula de los marcadores Lgr5 y Paneth células CD24 dentro del nicho de células madre de cripta, mientras que concentraciones más altas de la PFA no funcionaba.

    La adición de glutaraldehído da mejor preservación de los microtúbulos y la llamada fijación de PHEMO que consiste en una mezcla de 3,7% PFA, 0.05% glutaraldehído y 0.5% de detergente PHEMO tampón (tubos de 68 mM, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA y 3 mM MgCl2)2 da preservación excelente de microtúbulos sin comprometer la antigenicidad. También funciona bien para el inmuno-etiquetado gamma-tubulina β-catenina y E-cadherina y tinción filamentos de actina con phalloidin. Sin embargo, en culturas de organoides y tejido 3D, la fijación de PHEMO produce resultados inconsistentes y por lo tanto no se utilizó.

    El metanol es un fijador coagulante relativamente buena penetración y tiende a preservar la antigenicidad. Fijación con metanol al 100% (-20 ° C) introduce alguna contracción da preservación de morfología moderada y funciona para muchos anticuerpos se incluyendo ninein en cultivos celulares 2D + consejos y microtúbulos. Sin embargo, algunos organoides se derrumbaron cuando se utiliza este método de fijación. Además, penetración de anticuerpos a través de criptas, vellosidades u organitas todo era inicialmente un problema, pero la adición de 0,1% detergente para la solución de lavado y lavado prolongado logra mejores resultados.

    Una combinación de formaldehído y metanol había sido utilizada previamente por Rogers et al. 20 a inmuno-etiqueta EB1 en Drosophila. Un protocolo de fijación basado en una mezcla de formaldehído y metanol fue desarrollado por lo tanto para tejido intestinal y organitas basado en 3% metanol formaldehído y 97% frío a-20 ° C, pero omitiendo el carbonato de sodio 5 mM de la mezcla que fue utilizada por Rogers et al. 20 además, las muestras se fijaron en el congelador a-20 ° C. Esto trabajó particularmente bien para el inmuno-etiquetado + consejos, tales como CLIP-170 y el EBs, pero también resultó excelente para la fijación y el inmuno-etiquetado microtúbulos y actina dentro de tejido y 3D organitas. Muy buena conservación estructural era evidente y antigenicidad fue preservada por varias proteínas citoesqueléticas y asociadas así como proteínas centrosómicas como gamma tubulina y ninein, aunque etiquetado para ninein trabajó más consistentemente con metanol fijación.

    Divulgaciones

    Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

    Agradecimientos

    Los autores agradecen a Paul Thomas de microscopio asesoramiento y asistencia. Este trabajo trata fue financiado por el BBSRC (subsidio no. BB/J009040/1 a M.M.M. y T.W.).

    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)SigmaD8537-500ML solución delavado y
    recuperación celularPFA Corning354253aislado organoides
    tubos de microcentrífugaEppendorf30108116evitar que las células se peguen
    0,5 M solución de EDTA, pH 8,0Sigma03690-100ML Aislamiento decripta
    70 μ colador de células mFisher Scientific11517532Aislar criptas de vellosidades
    Triton X-100SigmaT8787detergente
    suero de cabraSigmaG6767agente bloqueante
    Suero fetal bovino (FBS)Sigmautilizado como agente antiadherente
    Paraformaldehído, 4% en PBSAlfa AesarJ61899fijador
    Solución de formaldehído (36.5– 38% en H2O)SigmaF8775utilizado como fijador
    Metanol 99,9% de grado analíticoFisherM/4000/17utilizado como fijador
    MaxFluor Ratón en ratón Kit de detección de inmunofluorescencia Maxvision
    Biosciences    		MF01-Skit de inmunofluorescencia comercial; para reducir el marcaje inespecífico
    Rotator SB2 o SB3Stuartrotor de tubo de microcentrífuga
    Recuperación de antígenos decitrato
    HydromountNational DiagnosticsHS-106montante
    DABCO - 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octanoSigmaD27802agente antidecoloración
    Carga positiva permanente, prelavado, bordes rectificados de 90 gradosClarityN/C366
    Portaobjetos Cubreobjetos de vidrio - espesor n.º 1, 22 x 50 mmClarityNQS13/2250cubreobjetos
    MatrigelCorning356231Matriz basal para el cultivo de organoides en 3D
    Tubos cónicos de 50 mLSarstedt62.547.254para el procesamiento de tejidos/organoides
    Tubos cónicos de 15 mLSarstedt62.554.502para el procesamiento de tejidos/organoides
    Tubos LoBind de 1,5 mLEppendorf30108051para organoides aislados
    Anticuerpo monoclonal anti-E-cadherinade ratón BD Biosciences610181anticuerpo primario 1:500
    Rata monoclonal anti-tubulina YL1/2 anticuerpoAbcamAB6160anticuerpo primario 1:100
    Conejo Anticuerpo alfa-tubulinaAbcamAB15246anticuerpo primario 1:100
    Conejo anticuerpo anti-beta-actinaAbcamab8227anticuerpo primario 1:100
    anti-p150 monoclonal para ratasAnticuerpo pegadoBD Bioscience610473/4anticuerpo primario 1:100
    Anticuerpo EB3KT36 monoclonal para ratasAbcamAB53360Anticuerpo primario 1:200
    Anticuerpo monoclonal EB1 deratón BD Bioscience610535anticuerpo primario 1:200
    Anticuerpo anti-Lgr5 para conejosAbgentAP2745dAnticuerpo primario 1:100
    Dylight anti-rata 488Jackson112545167seconday anticuerpo 1:400
    Dylight anti-ratón 488JacksonST115545166seconday anticuerpo 1:400
    Dylight anti-conejo 647Jackson111605144seconday anticuerpo 1:400
    de sodio

    Referencias

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