Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Resumen

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Resumen

Atrofia geográfica (GA), la última etapa de degeneración macular seca relacionada con la edad se caracteriza por la pérdida de la capa de (RPE) epitelial del pigmento retiniano, que conduce a la degeneración subsecuente de estructuras vitales de la retinales (e.g., fotorreceptores) causando debilitación severa de la visión. Del mismo modo, RPE-pérdida y disminución de la agudeza visual se ve en el seguimiento a largo plazo a de pacientes con avanzada degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) que reciben tratamiento de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) intravítreos. Por lo tanto, por un lado, es fundamental para derivar eficazmente las células RPE de una fuente ilimitada que podría servir como terapia de reemplazo. Por otro lado, es importante evaluar el comportamiento y la integración de las células derivadas de un modelo de la enfermedad que implique quirúrgicas y métodos de imagen como cerrar como sea posible a las que se aplican en los seres humanos. Presentamos un protocolo detallado basado en nuestras publicaciones anteriores que describe la generación de un modelo preclínico de GA con el ojo de conejo albino, para la evaluación de las células madre embrionarias derivadas de las células epiteliales del pigmento retiniano (hESC-RPE) en un ajuste clínicamente relevante. Células diferenciada-RPE son transplantadas en ojos de ingenuo o con NaIO₃-inducida por GA-como la degeneración retiniana con técnica 25 G transvitreal pars plana. Se realiza evaluación de zonas degeneradas y trasplantadas por multimodal proyección en tiempo real de imagen no invasiva alta resolución.

Introducción

Este protocolo describe la generación de un modelo preclínico de grandes ojos de atrofia geográfica (GA) que permite la evaluación de la integración de células transplantada-RPE en el espacio subretinal. Se han utilizado los métodos descritos en detalle aquí en 3 publicaciones recientes que demuestran la producción de una población enriquecida, pura y funcional de las células RPE de hESCs¹, así como la creación de daño retiniano externo y un GA-como fenotipo inducida por la inyección subretinal de soluciones salinas fisiológicas (es decir, BSS y PBS) o NaIO₃ en el conejo ojo^2,3. Hemos demostrado además que trasplantes de sub-retinal de la suspensión de células RPE forman monocapas funcionales extensa con fotorreceptor rescate capacidad².

Varias ventajas acompañarán el uso del ojo del conejo para la generación de un modelo de GA de la enfermedad. En primer lugar, el tamaño del ojo del conejo, que es el 70% del volumen de un ojo humano adulto, permite trasplante clínicamente significativo con una densidad celular que es mucho más baja que utiliza habitualmente en ojos pequeños roedores (1.000 células/μl frente a 50.000 células/μl)^{4 , 5}. en segundo lugar, la cirugía en roedores suele transscleral a través de la coroides, que compromete la barrera retiniana y potencialmente desencadena una respuesta inflamatoria y un posible rechazo⁶. Ambos factores juntos pueden conducir a multilayering y aglutinación de las células trasplantadas y una integración general deficiente de las células trasplantadas en un tejido retiniano nativa interrumpido. Sin embargo, el modelo de conejo grande-eyed permite la realización de una técnica quirúrgica con instrumentación idéntica a un ajuste clínico. En tercer lugar, un modelo de grandes ojos también permite alta resolución en vivo la proyección de imagen y control de las células trasplantadas y la retina suprayacente al tiempo^1,2,3. Así, describimos un modelo preclínico clínico relevante y rentable que debe ser una alternativa atractiva a los roedores para cualquier persona con un interés en la investigación de la retina normal y enferma y el espacio sub-retinal.

Protocolo

El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de Karolinska Instituet. Los experimentos en animales utilizando conejos albinos de Nueva Zelanda (Tabla de materiales) han sido aprobados por el Comité de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permiso: dnr 56/15). El uso de hESCs (dnr 2011/745-31/3) y la transferencia y manipulación de células-RPE (dnr 2013/813-31/2) es también conforme a la legislación sueca y las regulaciones del Karolinska Institutet y ha sido aprobado por el (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm).

1. subretinal inyección de cloruro de sodio (NaIO₃) en un modelo Animal grande-eyed

1. Anestesiar animales por administración intramuscular en el muslo con una mezcla de 35 mg/kg ketamina y xilacina de 5 mg/kg en solución salina utilizando una jeringa de 30 G, y dilatar las pupilas con gotas tópico usando una mezcla de 0,75% ciclopentolato y 2.5% fenilefrina. Anestesia adecuada se confirma si el animal no reacciona ante una pizca dura de su pata trasera.
2. Coloque el conejo en el microscopio quirúrgico con la cabeza hacia al cirujano (figura 1A). Utilice un retractor de la tapa para retirar membrana párpados y nictitans con un paño estéril para reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Utilización equilibrada solución de sal (BSS) para evitar la sequedad bajo anestesia en ambos ojos.
3. Para microcirugía, uso un puerto 2 (o 3-puerto opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica con trócares sin válvula para la inserción de instrumentos de microcirugía (figura 1B). La máquina de múltiples funciones de la vitrectomía tiene puertos para conectar una cánula de infusión, endoillumination, vitrector y endolaser. Para inyección subretinal, sólo el endoillumination es obligatorio, que hace un montaje de 2 puertos suficientes. Inserte el endoillumation a través del trocar izquierdo superior y el uso del trocar derecho superior de la cánula de inyección subretinal.
   1. Para una configuración de 3 puertos, use el trocar temporal inferior de la cánula de infusión BSS. Si son instrumentos opcionales (tales como un vitrector) usado, insertar a través del trocar derecho superior.
   2. Colocar los 2 trocares superiores 1-2 mm de Limbo con unas pinzas con garras para agarrar y desplazar la conjuntiva que cubre el sitio de inserción.
   3. Asegúrese de que los trocares son transsclerally insertado en un ángulo paralelo del limbus de 30-45° y proceden a la mitad de la punta del trocar. Girar el trócar 90 º y avanzar en el ojo, con el objetivo en el polo posterior del ojo. Este procedimiento evitar fugas post-quirúrgicas de las sclerotomies y también disminuir el riesgo de endoftalmitis (es decir, una infección bacteriana en el ojo). Vea también figura 2B para posiciones de trocar.
   4. Poner una lente de contacto plano de ocupacion en la córnea para visualizar la retina, con lágrimas sintético como gel de contacto entre el ojo y la lente de contacto (figura 1A).
   5. Drenaje 500 μl de NaIO₃ en una jeringa de 1 mL conectada a un tubo de extensión (funcionado por el asistente) y una cánula de polytip 38 G (operado por el cirujano).
   6. Inserte la sonda de endoillumination a través del trocar izquierdo superior y la cánula de inyección a través del trocar derecho superior y avanzar la cánula a través del espacio vítreo hacia la retina, con el objetivo de la zona justo debajo de la cabeza del nervio óptico.
   7. Permitir que la punta de la cánula a tocar poco a poco la retina hasta un blanqueamiento focal es visible. La inyección se penetrará a la retina, lo que permite entrega subretinal. No deje la cánula penetra la retina, ya que esto puede causar hemorragia.
   8. Inyectar 50 μl de NaIO₃ subretinally durante un período de s 5. Ya que existe un plano de la hendidura natural entre la retina y la coroides subyacente, una ampolla visible semitransparente forman gradualmente durante la inyección.
   9. Lentamente durante la inyección, retraer la aguja, pero asegúrese de que la punta se mantiene dentro de la ampolla para minimizar el reflujo.
   10. Después del retiro de la cánula de inyección y endoillumation, quitar los trocares con garras pinzas y aplique presión ligera de 30 s para el cierre automático sclerotomies de sutura menos utilizando la punta o el extremo despuntado de las pinzas.
4. Y dar 10 mL de solución salina por vía subcutánea para evitar la deshidratación. No dan post-surgical esteroides tópicos o antibióticos. Para analgésicos dar 0.5 mL de cirugía por vía subcutánea después de buprenorfina 0.3 mg/ml, así como el día después de la cirugía.
5. Después del uso, lave todos los instrumentos por inmersión les hace un par de segundos en primer lugar en etanol al 70%, en segundo lugar en 45% de etanol y por último en agua destilada. Secarlos bien con una toalla de papel.
6. Asistir a los animales hasta que recupere la suficiente conciencia y colocan todas solo hacinados. Si es necesario (por ejemplo, para propósitos de inmunohistoquímica), eutanasia de animales por la inyección intravenosa de pentobarbital de 100 mg/kg (véase Tabla de materiales).
7. Espere 7 días para proceder con el trasplante de las células hESCs RPE.

2. subretinal trasplante de las células hESCs RPE en animales tratados con

1. Administrar 2 mg (100 μL) de la triamcinolona de intravitreal en animales anestesiados con una aguja 30 g insertada 1-2 mm del limbo en el cuadrante temporal inferior 1 semana antes del trasplante de células RPE y volver a administrar cada 3 meses. Asegúrese de apuntar la punta hacia el polo posterior del ojo para evitar que un toque de lente.
2. La cultura una monocapa de células RPE como se describió anteriormente¹.
3. Eliminar medios de la diferenciación de la célula (véase Tabla de materiales) de una monocapa confluente de 24 pocillos hESC-RPE y lave cada uno con 500 μl de PBS sin Ca^{2 +} y Mg^{2 +}. Repetir esta acción una vez más, para un total de 2 lavados.
4. Deseche el sobrenadante, agregar 500 μl de tripsina por bien e incube durante 12 min a 37 ° C.
5. Inclinación de la placa y retire con cuidado la tripsina (células deberían permanecer pegadas a la placa). Recoger células en 800 μl de fresco 37 º C precalentado diferenciación medios mediante pipeteo suave, o incluso raspado si fuera necesario, para obtener una suspensión unicelular.
   Nota: Utilice un tamiz de 40 μm células si se observan grupos de células.
6. Recuento de células en una cámara del hemocitómetro con 0.2% Trypan azul, según las instrucciones del fabricante.
7. Añadir 5 mL de diferenciación células medios y centrifugar a temperatura ambiente, 300 x g durante 5 minutos.
8. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en recién esterilizado por filtro de PBS (pasado a través de un filtro de jeringa de 25 mm) a una concentración final de 1.000 células/μl.
9. Parte alícuota de la suspensión anterior en 600 alícuotas μl y mantenga en hielo hasta y durante la cirugía.
10. Anestesiar animales por administración intramuscular en el muslo con una mezcla de 35 mg/kg ketamina y 5 mg/kg xilacina en salina utilizando una jeringa de 30 G. Dilatar a las pupilas con colirio tópico usando amix de fenilefrina cyclopentolate y 2.5% 0,75%. Anestesia adecuada se confirma si el animal no reacciona ante una pizca dura en su pata trasera.
11. Colocar el conejo con la cabeza hacia al cirujano. Utilice un retractor de la tapa para retirar membrana párpados y nictitans con un paño estéril para reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Utilizar BSS para evitar la sequedad bajo anestesia en ambos ojos.
12. Para microcirugía, uso un puerto 2 (o 3-puerto opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica con trócares colocados en la misma posición como se describe en el paso 1.3 y figura 2. Si el sclerotomies anteriores son visibles, realizar inserción de trocar a adyacentes, pero no a través de estos, para minimizar el riesgo de fugas postoperatorias.
    1. Poner una lente de contacto plano de ocupacion en la córnea para visualizar la retina, con lágrimas sintético como el gel de contacto entre el ojo y la lente de contacto (figura 1A).
    2. Después de punta adecuado posicionamiento (ver pasos 1.3.5 y 1.3.6), inyectar 50 μl de una suspensión de RPE de hESCs mezclado suavemente (50.000 células) subretinally. Objetivo para el centro de la zona de NaIO₃ pretratados distinguido por un reflejo característico "metálico" endo-iluminación. La retina neurosensorial debe separar fácilmente creando una ampolla visible. Ras la aguja estéril de H₂O entre conejos y después utilizar para evitar obstrucción debido a la célula la aguja produce. Cambiar la aguja cuando la obstrucción se nota.
    3. Durante la inyección lentamente retraer la aguja pero asegúrese de que la punta se mantiene dentro de la ampolla para minimizar el reflujo.
    4. Después del retiro de la cánula de inyección y endoillumation, quitar los trocares con garras pinzas y aplique presión ligera de 30 s para el cierre automático sclerotomies de sutura menos utilizando la punta o el extremo despuntado de las pinzas.
13. Y dar 10 mL de solución salina por vía subcutánea para evitar la deshidratación. No dan post-surgical esteroides tópicos o antibióticos. Para analgésicos dar 0.5 mL de cirugía por vía subcutánea después de buprenorfina 0.3 mg/ml, así como el día después de la cirugía.
14. Después del uso, lave todos los instrumentos por inmersión les hace un par de segundos, en primer lugar en etanol al 70%, en segundo lugar en 45% de etanol y por último en agua destilada. Secarlos bien con una toalla de papel.
15. Asistir a los animales hasta que recupere la suficiente conciencia y colocan todas solo hacinados. Si es necesario (por ejemplo, para propósitos de inmunohistoquímica), eutanasia de animales por la inyección intravenosa de pentobarbital de 100 mg/kg.

3. retina en Vivo y proyección de imagen Subretinal

1. Utilice un dispositivo de (SD-OCT) la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral con el software que lo acompaña (véase tabla de materiales) para obtener la sección transversal b-Scan de los animales tratados, según las instrucciones del fabricante. Para evitar el desenfoque de la imagen, asegúrese de mantener la córnea húmeda mediante lavado con solución salina tópica cada 30-60 s.
   1. Colocar los animales anestesiados y dilata la pupila (véase los pasos 1.1 y 2.10) en una montura ajustable para obtener una trayectoria sin obstáculo de la fuente de luz del instrumento a la retina de conejo.
   2. Obtener al menos 3 OCT exploraciones con oftalmoscopia de láser escaneado confocal infrarroja simultánea imágenes de referencia de reflectancia (IR-cSLO) que representa la parte superior, central e inferior de la zona inyectada.
   3. Obtener imágenes de fondo en cara con cSLO azul, verde, infrarrojo y multicolor láser reflectancia (es decir, múltiples colores láser simultánea), respectivamente.
   4. Capturar imágenes de Autofluorescencia de luz azul (BAF) utilizando la capacidad del láser de luz azul del dispositivo SD-OCT.

Resultados

Representante en vivo imágenes de BAF, cSLO IR y SD-OCT de una retina de conejo albino normal se muestran en la figura 2. Tenga en cuenta las diferentes capas retinianas con sus distintivos niveles de reflexión de la luz capturada por el instrumento de la SD-OCT.

En las figuras 1A y 1B de la figura, se ilustra la configuración para...

Discusión

En este protocolo, se describe la generación de un modelo de grandes ojos de AG y su uso preclínico para evaluar la integración de células RPE en vivo .

Para la traducción de terapias regenerativas para GA y enfermedades relacionadas en la clínica⁷, es importante desarrollar y optimizar métodos que reflejan fielmente los métodos clínicos para el trasplante y la proyección de imagen. El conejo es en este aspecto atractivo: tiene un ojo relativamente grande que p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de diferenciación NutriStem hESC XF – bFGF y – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS sin Ca2+ y Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Filtro de células 40 μ m Nylon	VWR	732-2757
Aguja 30 G 0.5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc Filtro de jeringa de 25 mm	Acrodisc	PN4612
0,4% azul tripán	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Uso al 0,2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% Etanol	Solveco AB	1047
Ketaminol, 100 mg/mL	Intervet, Boxmeer	511519	Uso 35 mg/kg de ketamina
Rompun vet, 20 mg/mL	Bayer Animal Health	22545	Uso 5 mg/kg de xilacina
Triescencia, 40 mg/mL	Alcon Nordic A/S		412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-fenilefrina, 0,75% + 2,5%	APL	321968	Use 1 gota en cada ojo
Viscotears	Laboratoires Thé a	597562
Solución salina tópica	Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	Uso 100 mg/mL de pentobarbital
Tubo de extensión (martillo)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G cánula subretiniana polytip	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Lente plana de un solo uso	Volk
Retractor de tapa Barraquer Colibri	AgnTho's AB	42-020-030
Trócares sin válvulas	Alcon Nordic A/S	8065751448
Pinzas de garra	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Máquina de vitrectomía	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomía TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
Dispositivo SD-OCT	Heidelberg	Engineering Spectralis HRA+OCT	Utilice Heidelberg Eye Explorer versión 1.9.10.0
Placas de 24 pocillos	Sarstedt	83.3922
Hemocitómetro Neubauer	VWR	631-0925
Conejos albinos de Nueva Zelanda	Lidkö pings Granja de conejos, Suecia
		hESC-RPE	Ver número de referencia 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	Utilizar 0,5 mL de buprenorfina por vía subcutánea