Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.
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Artículo de método
Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Atrofia geográfica (GA), la última etapa de degeneración macular seca relacionada con la edad se caracteriza por la pérdida de la capa de (RPE) epitelial del pigmento retiniano, que conduce a la degeneración subsecuente de estructuras vitales de la retinales (e.g., fotorreceptores) causando debilitación severa de la visión. Del mismo modo, RPE-pérdida y disminución de la agudeza visual se ve en el seguimiento a largo plazo a de pacientes con avanzada degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) que reciben tratamiento de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) intravítreos. Por lo tanto, por un lado, es fundamental para derivar eficazmente las células RPE de una fuente ilimitada que podría servir como terapia de reemplazo. Por otro lado, es importante evaluar el comportamiento y la integración de las células derivadas de un modelo de la enfermedad que implique quirúrgicas y métodos de imagen como cerrar como sea posible a las que se aplican en los seres humanos. Presentamos un protocolo detallado basado en nuestras publicaciones anteriores que describe la generación de un modelo preclínico de GA con el ojo de conejo albino, para la evaluación de las células madre embrionarias derivadas de las células epiteliales del pigmento retiniano (hESC-RPE) en un ajuste clínicamente relevante. Células diferenciada-RPE son transplantadas en ojos de ingenuo o con NaIO3-inducida por GA-como la degeneración retiniana con técnica 25 G transvitreal pars plana. Se realiza evaluación de zonas degeneradas y trasplantadas por multimodal proyección en tiempo real de imagen no invasiva alta resolución.
Introducción
Este protocolo describe la generación de un modelo preclínico de grandes ojos de atrofia geográfica (GA) que permite la evaluación de la integración de células transplantada-RPE en el espacio subretinal. Se han utilizado los métodos descritos en detalle aquí en 3 publicaciones recientes que demuestran la producción de una población enriquecida, pura y funcional de las células RPE de hESCs1, así como la creación de daño retiniano externo y un GA-como fenotipo inducida por la inyección subretinal de soluciones salinas fisiológicas (es decir, BSS y PBS) o NaIO3 en el conejo ojo2,
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Protocolo
El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de Karolinska Instituet. Los experimentos en animales utilizando conejos albinos de Nueva Zelanda (Tabla de materiales) han sido aprobados por el Comité de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permiso: dnr 56/15). El uso de hESCs (dnr 2011/745-31/3) y la transferencia y manipulación de células-RPE (dnr 2013/813-31/2) es también conforme a la legislación sueca y las regulaciones del Karolinska Institutet y ha sido aprobado por el (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm).
1. subretinal inyección de....
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Resultados
Representante en vivo imágenes de BAF, cSLO IR y SD-OCT de una retina de conejo albino normal se muestran en la figura 2. Tenga en cuenta las diferentes capas retinianas con sus distintivos niveles de reflexión de la luz capturada por el instrumento de la SD-OCT.
En las figuras 1A y 1B de la figura, se ilustra la configuración para.......
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Discusión
En este protocolo, se describe la generación de un modelo de grandes ojos de AG y su uso preclínico para evaluar la integración de células RPE en vivo .
Para la traducción de terapias regenerativas para GA y enfermedades relacionadas en la clínica7, es importante desarrollar y optimizar métodos que reflejan fielmente los métodos clínicos para el trasplante y la proyección de imagen. El conejo es en este aspecto atractivo: tiene un ojo relativamente grande que p.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tienen intereses en competencia o conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por becas del Instituto Karolinska, Fundación del Crown Princess Margareta para invidentes, la Fundación de investigación oftalmológica, el rey Gustav V Foundation, la Fundación sueca de ojo, el ARMEC Edwin Jordan Fundación de Lindeberg y la Fundación Cronqvist.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio de diferenciación NutriStem hESC XF – bFGF y – TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS sin Ca2+ y Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Filtro de células 40 μ m Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Aguja 30 G 0.5' ’; 0,3 mm x 13 mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc Filtro de jeringa de 25 mm | Acrodisc | PN4612 | |
| 0,4% azul tripán | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Uso al 0,2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Etanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Uso 35 mg/kg de ketamina |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Uso 5 mg/kg de xilacina |
| Triescencia, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 2 mg intraviterial | |
| Cyklopentolat-fenilefrina, 0,75% + 2,5% | APL | 321968 | Use 1 gota en cada ojo |
| Viscotears | Laboratoires Thé a | 597562 | |
| Solución salina tópica | Apotea AB 7053249369080 | ||
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Uso 100 mg/mL de pentobarbital |
| Tubo de extensión (martillo) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25 G/38 G cánula subretiniana polytip | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25 G/38 G |
| Lente plana de un solo uso | Volk | ||
| Retractor de tapa Barraquer Colibri | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Trócares sin válvulas | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Pinzas de garra | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Máquina de vitrectomía | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomía TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| Dispositivo SD-OCT | Heidelberg | Engineering Spectralis HRA+OCT | Utilice Heidelberg Eye Explorer versión 1.9.10.0 |
| Placas de 24 pocillos | Sarstedt | 83.3922 | |
| Hemocitómetro Neubauer | VWR | 631-0925 | |
| Conejos albinos de Nueva Zelanda | Lidkö pings Granja de conejos, Suecia | ||
| hESC-RPE | Ver número de referencia 1 | ||
| Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml | Dechra | 660500 | Utilizar 0,5 mL de buprenorfina por vía subcutánea |
Referencias
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al.
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Reimpresiones y permisos
