Un microcontrolador funciona dispositivo para la generación de extractos líquidos de Aerosol de humo y electrónicos cigarrillo cigarrillo convencional

Summary

Aquí, describimos un aparato de laboratorio programable que puede utilizarse para crear extractos de aerosol de humo y electrónicos del cigarrillo del cigarrillo convencional. Este método proporciona una herramienta útil para hacer comparaciones directas entre cigarrillos convencionales y los cigarrillos electrónicos y es un punto de entrada accesibles a la investigación de cigarrillo electrónico.

Abstract

Los cigarrillos electrónicos son el producto de tabaco más popular entre medio y secundaria y son el producto de tabaco alternativa más popular entre los adultos. Alta calidad, investigación reproducible sobre las consecuencias del uso del cigarrillo electrónico es esencial para la comprensión emergentes problemas de salud pública y elaboración de pruebas basado en normativa. Mientras un número creciente de trabajos discuten los cigarrillos electrónicos, hay poca consistencia en los métodos a través de grupos y muy poco consenso en los resultados. Aquí, describimos un aparato de laboratorio programable que puede utilizarse para crear extractos de aerosol de humo y electrónicos del cigarrillo del cigarrillo convencional. Este protocolo detalla las instrucciones para el montaje y operación de dicho dispositivo y muestra el uso del extracto generado en dos aplicaciones de ejemplo: una en vitro ensayo de viabilidad celular y cromatografía de gases-espectrometría de masas. Este método proporciona una herramienta para hacer comparaciones directas entre cigarrillos convencionales y los cigarrillos electrónicos y es un punto de entrada accesibles a la investigación de cigarrillo electrónico.

Introduction

A pesar de un esfuerzo concentrado por las organizaciones de salud, consumo de productos de tabaco sigue siendo la principal causa de muerte evitable en todo el mundo, con la mayoría de estas muertes atribuidas al cigarrillo fumar¹. Desde su incursión en el mercado en 2003, los cigarrillos electrónicos han ido creciendo en popularidad entre usuarios de productos de tabaco. En la actualidad, los cigarrillos electrónicos son la alternativa más popular a los cigarrillos convencionales entre los estadounidenses adultos (~ 5%)² y el sistema de entrega de nicotina más popular entre medio (~ 5,3%) y secundaria (~ 16%)³. Si continúan las tendencias actuales, los cigarrillos electrónicos pueden esperarse para sustituir cigarrillos convencionales para las generaciones futuras. Sin embargo, las consecuencias para la salud del uso del cigarrillo electrónico todavía no están claros.

Investigación sobre los cigarrillos electrónicos no comenzó en serio hasta que el cigarrillo electrónico renombre aumentó rápidamente en 2013^3,4. Desde entonces, se han empleado un número de diferentes modelos para abordar la cuestión de su toxicidad. Sin embargo, los resultados de muchos estudios son contradictorios, y si bien parece que los cigarrillos electrónicos son generalmente menos tóxicos que los cigarrillos convencionales, no hay ningún consenso actual sobre las consecuencias para la salud del cigarrillo electrónico utilizar^{5, 6 , 7}. nuestros estudios anteriores indican que los cigarrillos electrónicos son significativamente menos tóxicos para el endotelio vascular que los cigarrillos convencionales, a pesar de su capacidad de causar daños en el ADN y la inducción de oxidativa estrés y muerte celular⁸ . Sin embargo, más investigación es necesaria antes de que podemos sacar conclusiones firmes sobre las consecuencias para la salud del uso del cigarrillo electrónico.

Como los cigarrillos convencionales son una causa importante de enfermedad vascular puede prevenir⁹, hay un creciente interés en el riesgo para la salud vascular del cigarrillo electrónico uso^10,11,12. Para estudiar los efectos de los cigarrillos electrónicos en el sistema vascular, nuestro laboratorio desarrolló un microcontrolador funcionado fumar/vaping dispositivo (figura 1)⁸. Este dispositivo es capaz de generar extractos líquidos de cualquier aerosol de humo o electrónicos cigarrillo cigarrillo convencional en solventes orgánicos o acuosos. Flujo de aire es controlada por la combinación de un regulador de flujo de aire ajustable y un programa de sincronización de PBASIC, el dispositivo puede utilizarse para generar extractos según cualquier número de protocolos definidos por el usuario. Aquí detallamos el montaje y funcionamiento de este dispositivo, así como dos posibles aplicaciones: en vitro evaluación de viabilidad celular y cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Figura 1: dispositivo de fumar/Vaping. Esquema para el montaje físico del dispositivo de fumar/vaping cigarrillo como cigarrillo electrónico (e-cig) configuración (A) y la configuración del cigarrillo electrónico de depósito (B). Componente clave: 1) Puerto de inhalación; 2) impactor de colección primaria; 3) impactor desbordamiento; 4) trampa vacío del frasco Buchner; 5) normalmente abierta válvula de solenoide; 6) microcontrolador BS1; 7) regulador de caudal de aire; 8) 510 rosca base de tanque de cigarrillo electrónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. montaje del dispositivo

1. Garantizar un 100 mL frasco de Buchner (figura 1, #4) a un anillo de acero soporte y crear una trampa de vacío relleno con 50 g de cloruro de calcio como un desecante. Sellar el frasco con un tapón de goma por el agujero, envuelva a la Unión del tapón con la película de parafina y ejecutar una pipeta por el orificio.
2. Utilizando tubería de vinilo, conectar la pipeta que se extiende desde el tapón a un conector de manguera t-intersección.
3. Con tubería del vinilo, conectar entre sí los dos impinger (figura 1, #2 y #3) y conecte la salida de impactor segundo a conector de la manguera de intersección t.
4. Con tubería del vinilo, conecte el puerto de entrada de la primer impactor para servir como puerto de inhalación (figura 1, #1).
5. Con tubería del vinilo, conecte el brazo lateral del matraz Buchner al puerto de entrada de un regulador de flujo de aire (figura 1, #7) y el puerto de salida del regulador de flujo de aire a una bomba de vacío.
6. Montar el circuito según el esquema en la figura 2A.
7. Cargar el programa PBASIC SVL.bs1 (figura 2B, también disponible en https://github.com/ChastainAnderson/SVL) para el microcontrolador BS1 (figura 1, #6) por medio de un adaptador serial y software del fabricante.
8. Lugar del 510 base roscada (figura 1 #8) en un anillo de soporte de abrazadera.
9. Con tubería del vinilo, conecte la válvula de solenoide (figura 1, #5) para liberar el extremo del conector de la manguera de la t-intersección.
   Nota: El dispositivo debe ser completo y listo para funcionar, comprobar todas las juntas para asegurarse de que son herméticas y aplique abrazaderas y grasa para vacío según sea necesario.

Figura 2: esquema eléctrico y código PBASIC. Figura 2A muestra el esquema eléctrico para el montaje del circuito eléctrico necesario para activar la válvula de solenoide normalmente abierto y el serpentín de calentamiento botón activado cigarrillos electrónicos (a través de la 510 roscado electrónico cigarrillo el tanque base). Los parámetros eléctricos de la bobina de calefacción (P: potencia; R: resistencia; y I: corriente) se proyectan y deberá verificarse empíricamente con una multímetro post Asamblea. Figura 2B muestra el programa de sincronización de PBASIC necesario para controlar el circuito de la figura 2A (también disponible en https://github.com/ChastainAnderson/SVL). Las constantes de tiempo SVT & IPT (#5 y #6) están en unidades de ms y se establecen para proporcionar un tiempo de activación de 2 segundos y un tiempo de inactividad de 28 s. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. almacenamiento y preparación de la muestra

1. Guarde todas las muestras de cigarrillos convencionales y electrónicos sin abrir en la oscuridad en bolsas de plástico herméticas a temperatura ambiente.
2. Una vez abierto, guardar las muestras en bolsas de plástico herméticas a 4 º c, con una toalla de papel para absorber el exceso de humedad.
3. Pre-equilibrar todas las muestras en un humidor de temperatura ambiente en ~ 60% de humedad de por lo menos 30 minutos antes de usarlo.

3. general funcionamiento del dispositivo de extracción de cigarrillo cigarrillo electrónico humo Aerosol

1. Determinar la masa de cada cigarrillo del cartomizer/tanque pre-vaping utilizando una balanza analítica. La diferencia en peso de pre/post post vaping se utilizará para determinar la dosificación apropiada.
   Nota: se supone que contiene 0,7 mg de nicotina los cigarrillos de referencia 3R4F, y el contenido de nicotina de marcas de cigarrillos comerciales puede ser determinado por métodos analíticos convencionales¹³.
2. Para la aplicación de ejemplo 1, llene el depósito de impactor primaria con 4,3 mL de medio de cultivo de células endoteliales. Para la aplicación de ejemplo 2, llene el depósito con 5 mL de acetona.
3. La preparación del cigarrillo electrónico o cigarrillo convencional para la extracción:
   1. Si utiliza un cigarrillo convencional, aplique un trozo de cinta adhesiva transparente alrededor del filtro y poner una marca fácilmente visible donde el papel de cigarrillo se une con el filtro.
   2. Si se usa un cigarrillo electrónico-cigarrillo, asegúrese de que la batería está bien cargada y el cartomizador firmemente atornillada a la batería.
   3. Si utiliza un tanque de cigarrillo electrónico, asegúrese de que un volumen adecuado de líquido de cigarrillo electrónico en el tanque y atornille el tanque en la base de rosca 510.
4. Inserte la punta del cigarrillo convencional o electrónica en el puerto de inhalación (figura 1, #1) y asegúrelos con una abrazadera de manguera.
5. Encienda la bomba de vacío.
6. Ajustar el medidor de flujo para tirar de 1,65 L/minuto para asegurar un soplo 55 mL durante 2 segundos.
7. Gire en el microcontrolador. Si se usa un cigarrillo convencional, enciende el cigarrillo en la primera bocanada.
8. Ejecutar hasta que proyecta deseada concentración (en partes por millón o % peso/volumen) se logra.
9. Determinar la masa de cada tanque cartomizer cigarrillo electrónico después de la vaporización utilizando una balanza analítica. Comparar esta medida para la medida tomada en el paso 3.1 para determinar el total de masa consumida. Calcular la concentración del consumo masa/volumen de solvente. Utilizar la concentración molar de la nicotina consumida para normalizar entre los productos.
   1. Si se consumía una masa insuficiente, retomar el cigarrillo electrónico en el dispositivo y consumir más.
   2. Si se consumía una masa suficiente o exceso, proceder.

4. filtración y almacenamiento

1. Si el extracto es utilizado para el cultivo celular, filtrar con un filtro de jeringa PES de 0,22 μm.
2. Utilice los extractos inmediatamente o almacenar a-80 º c. Como parte de la preparación de Anderson, et al. ⁸, aerosol de cigarrillo electrónico fue demostrada para ser estable durante al menos dos semanas, y la estabilidad del cigarrillo humo hasta por dos años se ha establecido por estafadores, et al. ¹³.

5. limpieza del dispositivo

1. Después de cada extracción, enjuague la tubería y depósitos del dispositivo con etanol al 70% y agua desionizada para evitar llevan entre muestras.
2. Después de enjuagar, brevemente el equipo puede utilizar vacío para permitir el flujo de aire para el secado de las líneas.

6. ejemplo de aplicación 1: Captación de rojo neutro análisis de viabilidad de la célula

1. Realizar el extracto como arriba en 4,3 mL de medio de cultivo de células endoteliales.
2. Un día antes, sembrar las células endoteliales de vena umbilical humana en 96 placas de pozos a una densidad de 1 x 10⁴ células/wellin 100 μl de medio de cultivo de células endoteliales.
3. Tratar las células sustituyendo el viejo medio de cultivo de células endoteliales por cada 100 μl de medio de cultivo fresco de células endoteliales para servir como un control o 75 μl de medio de cultivo de células endoteliales mezclado con 25 μl de un extracto de concentración de nicotina de 2 mM consumido (1,4 mg consumir nicotina en medio de cultivo de células endoteliales 4,3 mL) para una concentración final de 500 μm a servir como tratamiento.
4. Como muchos de los componentes de ambas cigarrillo cigarrillo electrónico y humo en aerosol son volátiles, use un sello para mantener los pozos herméticos.
5. Incubar la placa de 18 – 24 h a 37 ° C y 5% CO₂.
6. Preparar el rojo neutro solución de tinción:
   1. Crear una solución stock rojo neutro 100 x disolviendo 33 mg de colorante rojo neutro en 10 mL de solución salina tamponada.
   2. Poco antes de su uso, diluir 100 x 1: 100 de solución madre en medio de cultivo celular para crear 1 x rojo neutro solución de tinción.
   3. Incubar el rojo neutro solución a 37 ° C por al menos 30 min antes de uso y el uso de tinción inmediatamente.
      Nota: Es normal que algunos cristales que precipitan durante la incubación. Debe tenerse cuidado para evitar la aplicación de estos cristales a los pozos de la cultura de célula. Si es necesario, puede utilizarse un filtro de.22 μm para filtrar el stock de rojo neutro y soluciones de tinción.
7. Extracto de quitar y añadir 100 μl de rojo neutro solución por exceso de uso, para crear al menos tres pozos en blanco para la correcta cuantificación de la coloración.
8. Incube la placa en 2 – 4 h a 37 ° C y 5% CO₂.
9. Saque neutral red solución de tinción y lavar 3 veces por inmersión en PBS.
10. Rojo neutro se aplica la solución (agua desionizada de 50%, 49% de etanol, ácido acético al 1%) de la mancha.
11. Incubar al menos 10 min a temperatura ambiente con agitación.
12. Leer absorbancia a 540 nm.
13. Analizar datos, restando el valor promedio de los pocillos del blanco y la normalización a la media del valor bien control ajustado en blanco.

7. ejemplo de aplicación 2: cromatografía de gases espectrometría de masas

1. Realizar extracción como por encima en 5 mL de acetona.
2. El equipo puede utilizar para lograr una concentración final de ~ 100 partes por millón (peso del e-líquido consumido/volumen de acetona) de la muestra.
3. Utilizando una jeringa de vidrio de precisión, inyectar 1 μl del inyector de un dispositivo de GC-MS. Inyectar a 250 ° C con un 1:20 dividir la relación en un sistema de cromatografía de gas/cuadrupolo acoplado espectrómetro equipado con una columna de ZB-5 con el siguiente protocolo de horno: 1 min a 50 ° C; rampa de 10 ° C/min a 140 ° C; rampa de 20 º C/min a 300 ° C y mantener durante 10 minutos.
4. Coincidir con espectros de masas resultantes a la biblioteca de destino para identificar los componentes del aerosol.

Results

Dentro de las 24 horas de la exposición de la vena umbilical humana las células endoteliales a Extracto de humo de cigarrillo convencional (CSE) o aerosol de cigarrillo electrónico extracción (EAE), hay un significativo (control vs CSE P < 0.001; control vs EAE P < 0,01; n = 6) reducción de la viabilidad de las células (Figura 3A). Los extractos fueron generados con un perfil que sopla de 2, 2 segundos, soplos de 55 mL por minuto y nor...

Discussion

Los elementos más críticos de este protocolo asegurando que el dispositivo es limpiar al inicio y fin de cada extracción, y asegurando que todos los sellos se mantengan así ese flujo de aire permanece constante. Si el aparato no se limpia correctamente, hay un riesgo de llevar sobre entre las muestras. Además, si el dispositivo se deja impuro durante un largo período de aerosol condensado tiempo y secado solvente puede bloquear el sistema. Tenga en cuenta que es normal que allí para ser una caída de presión al soplar un ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adaptador de montaje en pared de 12 V CA/CC	Digi-Key	T1099-P5P-ND
Resistencias de 2,2 ohmios	Digi-Key	A105635-ND	Se utiliza en conjunto para generar la resistencia de 4,4 ohmios de la Figura 2A
Resistencias de 330 ohmios	Digi-Key	330QBK-ND
510 Base roscada	NJoy	N/A	Recuperado mediante el desmantelamiento de un cigarrillo
electrónico NJoy de segunda generaciónÁcido Acético, Glacial	Sigma-Aldritch	A6283
Acetona (Grado de Cromatografía)	Sigma-Aldritch	34850
Placa de Proyecto de Sello Básico	Digi-Key	27112-ND	Esta placa contiene el microcontrolador BS1, el adaptador serie, el interruptor de alimentación y un conector de clavija de barril para el adaptador de montaje en pared de CA/CC
Adaptador USB a serie de sello básico	Digi-Key	28030-ND	Un componente opcional para permitir que el adaptador serie BS1 se comunique a través de USB
Frasco Buchner (matraz de vacío) 250 mL	VWR	10545-854
Cinta transparente	3M	S-9783
Tubo de vinilo transparente, 3/8" ID	vatios	443064
EGM-2 Medio de cultivo de células endoteliales	Lonza	CC-3162
Etanol	Pharmco-Aaper
Regulador de caudal	Dwyer	VFA-23-BV
Cromatógrafo de gases	Varian	450-GC
Jeringa de vidrio, 10 mL	Sigma-Aldritch	Z314552
Jeringa de vidrio, 10 y micro; L	Hamilton	80300
Grasa de silicona de alto vacío	Dow Corning	146355D
abrazadera de	manguera marca de precisión	35125
células endoteliales de vena umbilical humana	ATCC	PCS-100-013
Espectrómetro de masas	Varian	300-MS
Midget Impinger	Chemglass	CG-1820-01
Rojo Neutro	Sigma-Aldritch	N4638
Película de parafina	3M	PM-992
Rodillo de sellado de placa	BioRad MSR0001
sello de placa; Soporte	de	276014
aluminio de 20"	American Educational Products	7-G15-A
Válvula solenoide (normalmente abierta)	US Solid	USS2-00081
Relé de estado sólido	Digi-Key	CLA279-ND
Abrazadera de soporte	Eisco	CH0688
Filtro de jeringa, PES, 0.22 mmm	Millipore	SLGP033RS
Jeringa, 10 mL	Jeringa BD	309604
tapón de orificio pasante, tamaño 6	VWR	59581-287
Bomba de vacío	KNF Neuberger	N86KTP