Artículo de método

Distinción simultánea de monoespecíficas y patrones mixtos DFS70 durante la proyección de ANA con un sustrato de la novela nocaut en ELITE/DFS70 HEp-2

DOI:

10.3791/56722

⸱

17 de enero de 2018

 , 
1Research & Development, Immco Diagnostics, A Trinity Biotech Company

En este artículo

Resumen

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Autoanticuerpos DFS70 imitan patrones de anticuerpos antinucleares asociados a enfermedad comunes haciendo interpretación desafiante al usar sustratos convencionales de HEp-2. El protocolo describe ventajas de sustrato de HEp-2 Ingeniería novela sobre HEp-2 convencional en ANA screening y distinguir patrones de DFS70 con alta confianza en monoespecíficas y mixtas en casos positivos de ANA.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trastornos autoinmunes sistémicos del tejido conectivo se caracterizan por circulación de los anticuerpos antinucleares (ANA). Aunque hay varias tecnologías disponibles para ANA screening, inmunofluorescencia indirecta (IIF) usando humano (HEp-2) de 2 células epitelial sustrato sigue siendo el método principal y recomendado debido a su sensibilidad superior. HEp-2 sustratos pueden detectar multitud de patrones resultantes de unión de autoanticuerpos a diversos autoantígenos proteína y ácido nucleico, distribuidos por el núcleo y el citoplasma de las células. La gran diversidad de monoespecíficas y patrones mixtos resultantes de las reacciones positivas sobre sustrato HEp-2 también complican la interpretación y precisión de la información. Un ejemplo concreto que recibió mayor atención recientemente es el denso fino 70 (DFS70) patrón moteado por autoanticuerpos que se unen específicamente a una proteína llamada factor de crecimiento derivado del epitelio de lente (LEDGF). Falta de clara asociación con enfermedad autoinmune sistémica específica y alta prevalencia en poblaciones saludables han hecho interpretación del patrón de DFS70 importante. Distinción exacta de DFS70 patrón de patrones asociados a la enfermedad usando sustrato HEp-2 convencional es difícil. Por otra parte, co-ocurrencia frecuente del patrón de DFS70 junto con patrones asociados a la enfermedad como patrones homogéneo moteado homogéneos, moteados y mixtos de complicar la interpretación de IIF. El objetivo de este trabajo es demostrar que la utilidad de una novela de ingeniería sustrato HEp-2 IIF que conserva todas las ventajas del sustrato HEp-2 convencional mientras que al mismo tiempo proporcionando la capacidad de distinguir patrones de DFS70 con alta confianza en ambos monoespecíficas y mixtos ejemplos positivos de ANA. El nuevo substrato es más capaz de desenmascarar patrones ANA asociada a enfermedad ocultados previamente por el patrón de DFS70.

Introducción

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ANAs son un sello de sistémica mediada autoinmunes del tejido conectivo enfermedades1. Se emplean varios métodos para la detección y confirmación de ANAs. Técnica IIF utilizando restos de sustrato HEp-2 el más ampliamente utilizado y método para la detección de ANAs1,2con frecuencia recomendado. A pesar de avances en metodologías de diagnóstico análisis de fase sólida como análisis de enzima ligado del inmunosorbente (ELISA), enzimoinmunoanálisis (EIA), inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA) y ensayos multiplexores de grano, IIF por HEp-2 es la proyección más prevalente método debido a su utilidad diagnóstica y costo efectividad1,2,3. Las tecnologías de análisis antes mencionadas se basan en un conjunto limitado de nativa purificada o autoantígenos recombinantes mientras que las preparaciones de monocapa de células HEp-2 en pozos de portaobjetos de vidrio presentan una amplia gama de autoantígenos en su forma natural, distribuyen en el núcleo y el citoplasma, reaccionan con los autoanticuerpos de sueros de pacientes o de controles positivos, dando por resultado una multitud de patrones que se asocian a varias condiciones autoinmunes. Estos patrones se clasifican en nucleares, citoplasmáticos y mitóticos patrones basados en la localización del antígeno en las células. Cada patrón y los antígenos de antígeno asociados y Estados de enfermedad son bien caracterizado4. En el método IIF, paciente y control de sueros se incuban en pozos de portaobjetos de vidrio que presentan una cultura de la monocapa de células HEp-2 convenientemente fijados para preservar una multitud de autoantígenos en su configuración natural. Los autoanticuerpos en el suero del paciente o en los controles positivos se permiten enlazar a los autoantígenos presentados por células HEp-2 en el substrato (portaobjeto bien) durante la incubación. Post incubación, los anticuerpos no Unidos son lavados apagado y los anticuerpos encuadernados de la clase IgG se detectan con fluoresceína/fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anti humano IgG reactivo. Registrados-conjugado no Unido se lava lejos y el cubreobjetos de vidrio se montan encima de las diapositivas utilizando un medio de montaje que conserva las reacciones y facilita la observación bajo un microscopio de fluorescencia. Las reacciones son observadas bajo un microscopio de fluorescencia equipado con combinación de filtro de emisión excitación apropiada que se configura según el reportero utilizado (reportero de la FITC, un microscopio diagnóstico típicamente utiliza filtros con rango de excitación de 467 -498 nm y una gama de emisión de 513-556 nm). La presencia de ANA es demostrada por una fluorescencia verde brillante de estructuras específicas en las células. A diferencia de plataformas de análisis automatizado, metodología IIF se basa en el laborioso proceso de dilución de los sueros y la determinación positiva visual de los patrones de tinción que requiere usuario importantes conocimientos5,6serial. A pesar de estas limitaciones, IIF por HEp-2 sigue siendo el más utilizado y método para la detección de ANAs debido a los esfuerzos de normalización hacia patrón interpretación y nomenclatura recomendado por el consenso internacional sobre ANA Comité de patrones (ICAP), mayor disponibilidad de soluciones de automatización para IIF Deslice el procesamiento y la interpretación de resultados3.

Entre la multitud de patrones detectó por el método de HEp-2 IIF, autoanticuerpos contra el producto del gene psip1 (también denominado LEDGF/p75/DFS70), han ganado gran interés en los últimos años por varias razones4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 los autoanticuerpos están presentes en altos títulos en controles sanos, y los estudios hasta ahora no han podido demostrar una asociación clínica distinta de la presencia de DFS70 autoanticuerpos7,8,9 ,10,11,12,13. Las tarifas de divulgado resultados positivos para autoanticuerpos DFS70 en varios Estados de la enfermedad y cohortes sanas variadas ampliamente entre los estudios6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. El patrón monoespecíficas DFS70 bien se distingue de un patrón homogéneo o moteado pero interpretación de patrones mixtos homogéneos manchadas y anticuerpos anti-DFS70 Co que ocurre con otras ANAs es un reto incluso para los lectores expertos. La actual generación de IIF DFS70 fase sólida específica análisis y métodos de detección no es capaces de distinguir un monoespecíficas DFS70 reacción de patrones mixtos (figura 1A, zona sombreada amarilla del algoritmo). Interpretación de DFS70 patrón homogéneo, moteado, patrón mezclado o viceversa, puede tener graves consecuencias en el cuidado del paciente. El actual protocolo comúnmente utilizado es el siguiente: los laboratorios clínicos emplean una serie de pruebas confirmatorias de fase sólida para ANAs asociada a enfermedad o un método de immunoadsorption para DFS70/LEDGF cuando denso fino moteado patrón (AC-2) se sospecha (figura 1a)4,5.

El objetivo de este protocolo es demostrar la utilidad de una novela de ingeniería sustrato HEp-2 IIF (HEp-2 ELITE/DFS70 nocaut (KO), se hará referencia a como élite de HEp-2) que conserva todas las ventajas de convencionales HEp-2 para la detección de ANAs, mientras que al mismo tiempo distinguir el patrón de DFS70 con alta confianza en monoespecíficas y mixtas ANA casos positivos (figura 1B, zona sombreada amarilla del algoritmo)5. Sustrato HEp-2 élite está compuesto por una mezcla aproximada de ingeniería células desprovista de antígeno LEDGF/p75/DFS70 en proporción de 1:95y sin modificar células HEp-2 convencionales. El procedimiento de la IIF para ELITE de HEp-2 es idéntico del método convencional de HEp-2. La configuración única de sustrato HEp-2 ELITE no sólo conserva todas las ventajas de HEp2 convencional pero puede distinguir patrones de reacción homogéneo, moteado y mixtos de patrón de DFS70 en la evaluación inicial o prueba de una muestra (figura 1B )5. Suero del paciente a reaccionar en diapositivas con sustrato HEp-2 IIF debe ser diluidas 1:40 dilución de screening o según el criterio de laboratorio individual. Una reacción específica en el 1:40 o título superior se considera positiva.

En este estudio, los sueros positivos para centrómero homogéneo, moteado, nucleolar, citoplasmática reticular/AMA y patrones de DFS70 que produce una señal positiva media (en relación con el control negativo y control positivo de ANA proporcionado por el kit) en proyección dilución de 1:40 fueron seleccionados para simular los patrones mono específicos y mixtos en sustratos HEp-2 (convencionales y HEp-2). La 1:40 diluido DFS70 sueros positivos fueron mezclados con 1:40 diluciones de ANA enfermedad asociado individual patrón controles (homogéneo, moteado, centrómero, nucléolo, o citoplasmático reticular-AMA) en diferentes proporciones (control: DFS70 100: 0, 80: 20, 50: 50, 20:80 y 0:100) y evaluado en convencional y sustratos HEp-2 ELITE siguiendo el procedimiento estándar del IIF se detallan a continuación.

Protocolo

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El protocolo sigue las directrices del Comité de ética de investigación institucionales de Trinity Biotech.

1. muestra y preparación del sustrato

  1. Permitir que las bolsas que contienen diapositivas de sustrato (vidrio portaobjetos con 12 pozos en cada diapositiva que contenga HEp2 o HEp-2 + HEp2 KO la mezcla de células) alcancen la temperatura para un rendimiento óptimo y evitar la condensación de humedad en la superficie de la diapositiva antes el Además de la muestra. Esto debe tomar aproximadamente entre 10-15 minutos.
  2. Una vez equilibrados a temperatura ambiente, cuidadosamente Quite las diapositivas de substrato con los dedos sin ellos tocando los lados de la bolsa.
  3. Etiquete los portaobjetos y colocarlos en una cámara de incubación (a temperatura ambiente) forrado con papel de cocina humedecido con agua para evitar sequedad de diapositivas durante la muestra y la incubación del conjugado.
    Nota: Tinción inespecífica puede resultar de pozos secos; una toalla de papel húmeda dentro de la cámara de incubación proporciona humedad y previene la sequedad bien.

2. adición de controles y muestras

  1. Dispensar aproximadamente 50 μl de los controles negativo, positivo, combinaciones de sueros positivos DFS70-ANA como se describe en este estudio, o las muestras de suero del paciente a pozos individuales de la diapositiva.
  2. Dispensar los controles y las muestras en cada pocillo de la diapositiva.
  3. Para evitar así la contaminación cruzada, evitar transbordar el área. No transbordar área, asegurar la cobertura completa de bien superficie y evitar burbujas de aire.
    Nota: El volumen recomendado es 50 μl según paso 2.1.
  4. Coloque la tapa de la cámara de incubación e Incube los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente. Si hay alguna ANA presentes en el suero del paciente, se unirá a las células presentes en cada pocillo durante este período de incubación.
  5. Una vez terminado el período de incubación, quitar la corredera de la cámara de incubación. Sujete la corredera al final de la ficha y enjuague suavemente con aproximadamente 10 mL con tampón fosfato salino (PBS) tampón de lavado en el juego, utilizando una pipeta o en un vaso llenado de PBS para 10-15 s. transferir inmediatamente el portaobjetos en una jarra de Coplin con tampón de lavado PBS y lavado ( Remoje) durante 10 minutos, repita el proceso con todas las diapositivas restantes.
    Nota: Al poner varias diapositivas en una jarra de Coplin, asegúrese de que el lado de la célula de la diapositiva no tenga contacto con otra diapositiva, ya que ello en dañar las células se adhirieron en el portaobjetos de cristal.

3. adición de conjugado fluorescente

  1. Extraer sólo una diapositiva en un momento de la jarra de Coplin. Para quitar el tampón de lavado PBS sobrante de la diapositiva, suavemente golpee o secar el portaobjetos sobre la toalla de papel. Cada kit se suministra con etiqueta fluorescente conjugado de anti-human IgG FITC. A cada pocillo, suavemente Aplique 1 gota (aproximadamente 50 μL) de conjugado proporcionado.
  2. Incubar los portaobjetos en la cámara de incubación tinción cerrada durante 30 minutos.
    Nota: Se recomienda el uso de Fc específicos IgG conjugado. Si hay alguna ANA presentes en el suero del paciente, el conjugado se unirá a las células presentes en cada pocillo durante este período de la incubación, que se traduce en la fluorescencia específica de las células presentes en los pozos. El conjugado es sensible a la luz. La sala de incubación cerrada ayudarán a evitar la interferencia de la luz con la reacción conjugada de las células presentes en cada pozo.
  3. Una vez terminado el período de incubación, quitar la corredera de la cámara de incubación. Mantenga la diapositiva al final de la ficha y enjuague suavemente con aproximadamente 10 mL de PBS el tampón de lavado suministrado en el kit, con una pipeta o en un vaso de precipitado con PBS. Transfiera el porta inmediatamente en un frasco de Coplin con tampón de lavado PBS y lavado (remojo) para 10 minutos repetir el proceso con diapositivas todo restantes.
    Nota: Al poner varias diapositivas en una jarra de Coplin, asegúrese de que el lado de la célula de la diapositiva no tenga contacto con otra diapositiva, ya que ello en dañar las células se adhirieron en el portaobjetos de cristal.
  4. Coloque el cubreobjetos que se proporcionan en el kit en una toalla de papel seca. Los medios de montaje se suministra con el kit. En el borde inferior del cubreobjetos, se aplican entre 3-4 gotas de los medios de montaje en línea.
  5. Sacar una diapositiva a la vez de la jarra de Coplin que contiene el tampón de lavado. Para quitar el tampón de lavado exceso, suavemente golpee o secar el portaobjetos sobre la toalla de papel.
  6. Bajar la diapositiva suavemente sobre el cubreobjetos, colocando el borde inferior de la diapositiva al borde del cubreobjetos. Esto permite que los medios de montaje presentes en el cubreobjetos de borde inferior al flujo en el borde superior de la diapositiva y minimiza la formación de burbujas de aire, que puede interferir con la lectura de cada pozo del portaobjetos.
    Nota: La presión mínima puede usarse para montar la corredera de cubierta a la diapositiva. Cualquier exceso de presión puede causar un movimiento lateral de la cubierta. Esto puede causar daños a la preparación de la monocapa de la células y resultar en distorsión.
  7. Almacenar las diapositivas en la oscuridad a 2-8 ° C. Examinar las diapositivas tan pronto como se montan o dentro de 48 h.
    Nota: Un almacenaje más largo puede resultar en deterioro de la patrón y la señal fluorescente.

4. identificación de resultados positivos y negativos

  1. Ver las diapositivas con un microscopio de fluorescencia utilizando un sistema de filtro FITC, situado en un cuarto oscuro.
  2. Examinar para fluorescencia verde brillante específica bajo el microscopio de fluorescencia en un aumento de 200 X o más hacer la interpretación final en cuanto a positividad y patrón. Observar los controles positivos y negativos.
    Nota: El control positivo muestra fluorescencia verde brillante en el núcleo (figura 2A, homogeneidad). El control negativo mostrará ninguna fluorescencia verde específica bajo el microscopio de fluorescencia.
  3. Anote el resultado de positivo/negativo para cada bien e incluyen el patrón de ANA para casos positivos.

Resultados

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Sustrato hEp-2 ELITE/DFS70 KO conserva patrones clásicos ANA y facilita la distinción clara del patrón de DFS70:

Las células convencionales y modificadas en sustrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO son idénticas, preservando todos los autoantígenos excepto LEDGF/p75. El control negativo suministrado con el kit establece la señal de línea de base fluorescente. Controles positivos para patrones nucleolar y mitocondrial homogéneo, moteado, centrómero, en ELITE de HEp-2 producen un patrón idéntico a patrones esperados en sustrato HEp-2 IIF convencional (figura 2A). Estos patrones de referencia se han descrito en detalle junto con la Asociación de antígeno y la enfermedad de cada patrón previamente4,29. Una breve descripción de los patrones observados en la figura 2A se proporcionan en la tabla 1.

DFS70 patrón en HEp-2 ELITE:

Aproximadamente el 10% de las células en cada bien mostrar un patrón moteado fino denso (ICAP asignado nomenclatura: AC-2) que se observan en el núcleo de interfase, y tinción de la cromatina asociada se ve en el núcleo mitótico (figura 2B). Sobre un sustrato HEp-2 convencional, todas las celdas tendrán este patrón cuando reaccionó con una muestra positiva de DFS70. El ~ 90% restante de las células HEp-2 tiene el gen psip1 codificación del antígeno LEDGF noqueado y por lo tanto no producirá una señal patrón cuando reaccionó con un monoespecíficas DFS70 Suero positivo (figura 2B). Si el 10% de las células HEp-2 tiene más brillante fluorescencia correspondiente al patrón de DFS70 y resto de los células adicionales patrones presentes (por ejemplo, bien manchado o nucleolar), esto indica la presencia de patrones mixtos. Examen más detenido de estos patrones es esencial para confirmar todas las especificidades de autoanticuerpos están presentes además el patrón de DFS70. Para demostrar la capacidad del sustrato HEp-2 ELITE, un panel de sueros muestras fue creado con diferentes concentraciones de DFS70 y ANA positivos sueros de control y probaron en convencional y sustratos HEp-2 ELITE utilizando un IIF estándar protocolo (figura 3 , Figura 4, figura 5, figura 6, figura 7).

Interpretación de DFS70 monoespecíficas y mixtas reacciones en sustratos de élite convencionales y HEp-2:

Para cada patrón de ANA asociado a enfermedad específica (en la figura 3, figura 4, figura 5, figura 6, figura 7), un monoespecíficas ANA patrón izquierda columna más y un monoespecíficas DFS70 patrón de derecha columna más se puede observar. Las tres columnas en el centro representan diferentes proporciones de enfermedad asociada y controles positivos de patrón DFS70. Los patrones mixtos resultantes son desafiantes para discernir sobre convencional sustrato HEp-2 (figura 3, figura 4, figura 5, figura 6, figura 7, fila superior). Sin embargo, con el sustrato Hep-2 ELITE novela, en la mayoría de las muestras, la diferencia de intensidades entre las células sin modificar y de ingeniería es distinto que no sólo confirma la presencia de autoanticuerpos DFS70 (cuando la relación de más a menos células brillantes 1:9) pero también revela un patrón secundario de ANA. En el caso de DFS70 homogéneo o moteado-DFS70 mezclada de reacciones, es imposible predecir con confianza el patrón correcto que lleva a los laboratorios optan por ejecutar una serie de ensayos adicionales (figura 1A). En el caso del centrómero-DFS70 y DFS70 nucleolar mezclan reacciones, sospechar positividad de DFS70 es muy difícil (figura 5, figura 6). Con reacciones nucleolares y citoplasmáticos reticular/AMA, la DFS70 no es dominante hasta que el cociente sera llegue al 50%. En todos los ejemplos, el sustrato HEp-2 ELITE puede presentar el patrón de DFS70 y el patrón subyacente secundario sobre una gama más amplia de la intensidad de los niveles y así facilita una interpretación más exacta de ANA.

Para observar de cerca los patrones mixtos, resultados de varias combinaciones de 50: 50 de ANA y DFS70 positivos controles fueron agrandados (figura 8) para convencional y sustratos HEp-2 ELITE. Se recomienda observar la interfase y coloración mitotic para todos los patrones de ANA incluyendo DFS70 sobre sustratos HEp-2 para mejorar la interpretación y la exactitud del patrón reportado. Sin embargo, para los patrones mixtos, el patrón diferencial de presentado por la división de núcleos celulares puede no ser suficiente para facilitar la interpretación. Flechas rojas (figura 8) indican los núcleos mitóticos en celular convencional y de ingeniería. Puede observarse que mezcla DFS70 reacciones en dividir las células no cumplen con el conjunto establecido de reglas de interpretación de la enfermedad asociada ANA patrones. Amarillas y azules las flechas indican núcleo de celular HEp-2 (DFS70 KO) sin modificar y de ingeniería, respectivamente. En todas las combinaciones (figura 8), se observa una diferencia de intensidad clara entre el sin modificar la célula nuclear tinción (~ 10%) y nuclear (~ 90%) patrón de ingeniería de la célula en el mismo campo de vista microscópico, que permite la detección simultánea y confirmación de la pauta de DFS70.

diagrama de algoritmos de detección de ANA utilizando métodos HEp-2, DFS70 IIF; ELISA, EIA para diagnóstico.
Figura 1: ANA screening algoritmos usando métodos convencionales HEp-2 y HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) esquema desentraña la deficiencia de IIF de HEp-2 convencional en la identificación de monoespecíficas y mixtas DFS70 patrones positivos en la etapa de investigación (área sombreada de amarillo) y su incapacidad para descartar una secundaria asociada a la enfermedad de ANA patrón que puede se oculta por el patrón de DFS70. Además, la generación actual de fase sólida específica DFS70 pruebas confirmatorias no son capaces de confirmar la positividad de DFS70 monoespecíficas que conduce a las pruebas adicionales de confirmación para ANAs. (B) esquema revela las capacidades de la élite de HEp-2 para la detección de ANAs, distinción simultánea de monoespecíficas y mixtas reacciones DFS70, y eliminando la necesidad de fase sólida DFS70 ensayos de confirmación. Algoritmo utilizando a HEp-2 ELITE significativamente simplifica la detección de ANA y reduce el número de ensayos de confirmación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de patrones ANA de sustrato HEp-2; microscopía, identificación de patrones, comparación de células DFS70.
Figura 2: patrón clásico ANA y DFS70 en sustrato HEp-2 KO ELITE/DFS70. (A) sustrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO conserva patrones clásicos de ANA. Clásica reacción homogénea y DFS70 reacciones positivas fueron producidas usando los controles positivos proporcionados por el kit. Otras reacciones fueron producidos usando sueros control positivos previamente establecidas para moteado, centrómero, nucleolares y citoplasmáticos reticular/AMA reacciones5. (B) sustrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO proporciona las células convencionales y modificadas, lo que facilita la fácil distinción de patrón DFS70. Esquema muestra la resultante DFS70 monoespecíficas reacción coloración patrón en interfase y división de núcleos celulares para las células (DFS70-KO) convencionales y de ingeniería. Células HEp-2 Ingeniería carezcan de antígeno LEDGF/p75/DFS70 que permite la detección simultánea de patrones secundarios que generalmente están ocultas por la reacción de autoanticuerpos DFS70 sobre sustratos convencionales de HEp-2. Flechas (amarillo) indican ejemplos de núcleos de célula mitotic. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Microscopía de fluorescencia, comparación de tinción celular, células HEP-2, detección de autoanticuerpos DFS70.
Figura 3: DFS70 y sera homogénea en combinación. Sueros monoespecíficos de DFS70 combinados con un control positivo patrón homogéneo en diferentes proporciones (100: 0, 80: 20, 50: 50, 20:80 y 0:100) y probados en sustratos HEp-2 (DFS70-KO) convencionales y modificados. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

microscopía de fluorescencia de células Hep-2; localización de proteínas; resultados de experimentos; núcleos celulares; patrón moteado.
Figura 4: DFS70 y moteadas de sueros en combinación. Sueros monoespecíficos de DFS70 combinados con un control positivo patrón moteado en diferentes proporciones (100: 0, 80: 20, 50: 50, 20:80 y 0:100) y probados en sustratos HEp-2 (DFS70-KO) convencionales y modificados. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Microscopía de inmunofluorescencia, células HEP-2, tinción de centrómero vs anticuerpo DFS70, intensidad de fluorescencia.
Figura 5: sera DFS70 y centrómero en combinación. Los sueros monoespecíficos DFS 70 combinados con un control de patrón centrómero positivos en diferentes proporciones (100: 0, 80: 20, 50: 50, 20:80 y 0:100) y probados en sustratos HEp-2 (DFS70-KO) convencionales y modificados. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Microscopía de fluorescencia de células HEP-2 con tinción nucleolar DF570; resultados de experimentos y análisis.
Figura 6: DFS70 y sera nucleolar en combinación. Los sueros monoespecíficos DFS 70 combinados con un control positivo patrón nucleolar en diferentes proporciones (100: 0, 80: 20, 50: 50, 20:80 y 0:100) y probados en sustratos HEp-2 (DFS70-KO) convencionales y modificados. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Inmunofluorescencia de células Hep-2, patrón reticular citoplasmático, anticuerpo DFS70, resultados de microscopía.
Figura 7: DFS70 y citoplasmático reticular/AMA sera en combinación. Sueros monoespecíficos de DFS70 combinados con un control positivo patrón mitocondrial en diferentes proporciones (100: 0, 80: 20, 50: 50, 20:80 y 0:100) y probados en sustratos HEp-2 (DFS70-KO) convencionales y modificados. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Comparación de microscopía de fluorescencia de células HEp-2 y DFS70-KO, analizando patrones de tinción nuclear.
Figura 8: mezcla patrones (proporción 50: 50) producidos en convencional y sustratos de ELITE de HEp-2. Se revelan las diferencias entre los dos sustratos. Flechas rojas indican los núcleos mitóticos en las células convencionales y modificados en ambos sustratos. Para estas combinaciones, el patrón diferencial de presentado por la división de núcleos celulares en sustrato HEp-2 convencional no es suficiente para la interpretación de patrones mixtos. Se puede observar que diversas reacciones DFS70 en dividir las células pueden perturbar el conjunto establecido de reglas de interpretación de la enfermedad asociada ANA patrones. Amarillas y azules las flechas indican núcleo de celular HEp-2 (DFS70 KO) sin modificar y de ingeniería, respectivamente. Resultados obtenidos para todas las combinaciones probaron en el substrato de la ingeniería: una diferencia de intensidad clara entre el patrón nuclear de interfase que sin modificar las células (~ 10%) y células Ingeniería (~ 90%) se observó, que permitió a simultánea detección y confirmación del patrón de DFS70. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Patrón de ANADescripción
HomogéneaEl núcleo entero es uniformemente con un patrón de tinción difuso.
Moteadas deDiscreta, de grueso a fino puntos de fluorescencia a lo largo del núcleo.  Se han descrito patrones moteados moteados y gruesos finos.
NucleolarLos nucleolos se manchan como múltiples cuerpos sólidos o manchados dentro del núcleo. Anteriormente se han descrito subtipos.
CentrómeroManchas grandes de número finito. Reactivo antígeno segrega con condensado cromosomas en las células que experimentan mitosis.
Citoplásmica reticulares/AMAEl citoplasma aparece granular con la coloración positiva de las mitocondrias.
DFS70Las células sufre HEp-2: un patrón moteado fino denso se observa en el núcleo de interfase y cromatina asociada la coloración se observa en núcleos mitóticos.
Administré células DFS70 KO: anticuerpos Anti-DFS70 producen Tinción negativa
HEp-2 Elite DFS70 KO tiene células (DFS70 KO) convencionales y de ingeniería en relación de 1:9 aproximadamente. Las células convencionales producen patrón típico de DFS70 y células ingeniería producen un patrón negativo cuando reaccionó con un DFS70 monoespecíficas/aislado las reacciones positivas.

Tabla 1: Descripción de patrones de ANA.

Discusión

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Autoanticuerpos a los antígenos nucleares y citoplasmáticos son altamente prevalentes en enfermedades autoinmunes sistémicas. Aunque no solo análisis proporciona la mejor sensibilidad y especificidad, IIF por HEp-2 es ampliamente considerado como un método de detección altamente sensible y rentable para las enfermedades autoinmunes sistémicas2,3,4 . A pesar de la prevalencia de protocolo de la IIF para más de 50 años, exactitud del ensayo IIF es altamente dependiente de la habilidad del técnico, la ejecución cuidadosa de cada paso del protocolo y precisa interpretación de los resultados con un buen mantenimiento microscopio de fluorescencia. Diagnóstico de enfermedad autoinmune sistémica no debía basarse en los resultados de una sola prueba serológica como IIF por HEp-2.

Reconstitución de los reactivos con alta calidad de agua (agua destilada/desionizada), el uso de componentes estandarizados (diapositivas con monocapas de células HEp-2, diluyente de muestra, controles positivos y negativos, previamente diluido conjugado FITC optimizado y el medio de montaje) tener un impacto positivo en los resultados. Omitiendo la adición de controles o las muestras de pozos puede fomentar falsas interpretaciones negativas. De secado de diapositivas en cualquier momento después de la adición de la muestra o control puede ocasionar reacciones positivas falsas artifactual y/o patrones incorrectos. Sobre diapositiva demasiado tampón de lavado o secado de los pozos de la diapositiva antes de la dispensación de medio de montaje puede resultar en artefactos. Agregar suficiente cantidad de medio de montaje o generación de burbujas en la superficie de la diapositiva antes de colocar un cubreobjetos puede provocar reacciones que se ven borrosas o fuera de foco cuando se observa bajo el microscopio. Diapositivas montadas deben ser almacenadas a 2-8 ° C y analizados dentro de la ventana recomendada de tiempo para minimizar falsos negativos o artifactual.

Utilizando un microscopio epi-fluorescente bien conservado que alberga una fuente de luz apropiada de Hg/LED/xenón y ópticos limpio componentes incluyendo filtros de excitación y de emisión que no estén dañados es fundamental para obtener resultados precisos de IIF. Usuario final para discriminar intensidades de reacción positiva/negativa e interpretación de patrones de entrenamiento es fundamental. Ensayos de IIF de HEp-2 son vulnerables a la falta de estandarización de procedimientos, configuración del microscopio y formación del usuario final o habilidad. Los patrones de nomenclatura y representante de consenso y ejemplos de imágenes adquiridas con distintos fabricantes son hechos disponibles por ICAP (< www.ANApatterns.org>) para fines didácticos4. Un árbol de clasificación de patrón celular HEp-2 proporcionado por ICAP para varios patrones nucleares, citoplasmáticos y mitóticos es un valioso recurso para aprender las diferencias sutiles entre varios patrones que pueden parecerse a los ojos inexpertos4. Uno de los principales ejemplos de un patrón desafiante es el DFS70 que también carece de una clara asociación con una condición autoinmune, y como comentamos en secciones anteriores este patrón es altamente prevalente en poblaciones saludables5.

Según el estudio, la prevalencia de autoanticuerpos anti-DFS70 varían entre cohortes sanas, ANA proyección de poblaciones y personas positivas de ANA sin evidencia de enfermedad autoinmune sistémica9,16,20 ,30,31. DFS70 autoanticuerpos se han divulgado para ocurrir en el aislamiento, así como con otros patrones de ANA enfermedad asociada. Aislado o monoespecíficas DFS70 patrón se reporta en el 2-22% de controles sanos, pero en menos del 1% de los casos con enfermedad reumática autoinmune32. Partiendo de estas tendencias, DFS70 patrón de mono-positivo fue propuesto como un criterio para excluir en las enfermedades reumáticas autoinmunes por ICAP Comité3,31,32. El Comité ICAP, creado para promover la armonización de la nomenclatura de la prueba de autoanticuerpos y la interpretación de los resultados de HEp-2 IIF, recomienda informar positividad DFS70 mientras informes ANA proyección de resultados4.

Antes de descartar una enfermedad autoinmune sistémica basada en DFS70 mono-positividad, es vital revisar el estado de los actuales métodos de cribado y confirmación (particularmente las específicas para DFS70). Acuerdo entre positividad por IIF HEp-2 y ensayos confirmatorios fase sólida: ELISA DFS70, CLIA y línea inmunoensayo/dot blot métodos) varió ampliamente entre distintos estudios13,22,25,33 . Interpretación del IIF y ensayo confirmatorio parámetros que contribuyen a este desacuerdo han sido discutieron previamente5,13,34. Un enfoque del immunoadsorption recientemente propuestos para la confirmación de anticuerpos anti-DFS70 aborda algunas de las deficiencias de los ensayos actuales de fase sólida (para DFS70) pero requiere de los laboratorios para realizar un paso adicional en el procedimiento IIF en muestras sospechosas, que aumenta el tiempo costo y entrega de informes de resultados13. Este paso adicional no es necesaria cuando se utilizan células HEp-2 ELITE/DFS70 KO para el cribado de rutina ANA. Esto reduce los costos y además no hay ningún impacto en el tiempo de respuesta como patrón DFS70 es discernir en la investigación inicial paso27. Una desventaja adicional del método convencional de HEp-2 si es que es incapaz de distinguir el patrón de DFS70 Co que ocurre con otros ANA patrones en la etapa de proyección. Sin embargo, esta desventaja es superada por el uso de las células HEp-2 KO ELITE/DFS7027.

Evaluación comparativa de convencionales HEp-2 y la nueva ingeniería HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) utilizando controles positivos de ANA y sus combinaciones con un control de DFS70 mono-positivo, demostrar la utilidad de la capacidad del nuevo sustrato simultáneamente pantalla para ANAs y confirmar el patrón de DFS70 (figura 1). El protocolo IIF para el substrato nuevo es idéntico del método convencional de IIF de HEp-2. Esquema de interpretación para patrones todo asociada a la enfermedad de ANA es idéntico a excepción del patrón de DFS70 (tabla 1). Interpretación de patrones de DFS70 mono-positivo y mixtos era relativamente más fácil utilizando el nuevo método y no garantiza ensayos adicionales (figura 1B). Implementación de este nuevo método en el laboratorio clínico simplifica el reto asociado con la interpretación del patrón de DFS70 y mejora la precisión de la ANA screening revelando más asociada a la enfermedad de ANA patrones previamente ocultados por DFS70 (mezclada de patrones).

Divulgaciones

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Los autores Kishore Malyavantham y Lakshmanan Suresh son empleados de Trinity Biotech, Estados Unidos.

Agradecimientos

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Agradecemos a Andrew Zenger para realizar los experimentos de la IIF y la recolección de imágenes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HEp-2 ELITE / DFS70-KO Portaobjetos de 12 pocillos sellado individualmente en bolsaTrinity Biotechparte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240
ANA control positivoTrinity Biotech parte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
positivo de anticuerpos DFS70Trinity Biotechparte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240
Control negativoTrinity Biotechparte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Conjugado IgG FITC antihumano que contiene la contratinción azul de EvanTrinity Biotechparte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Diluyente tampón para sueroTrinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Trinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Medio de montajeTrinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Cubreobjetos Trinity Biotechparte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 pocillos deslizan sellados individualmente en bolsaTrinity Biotechparte del kit # 1103, 1103-240
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Materiales utilizados en el estudio pero no proporcionados por los kits
laboratorio general
n/aSuministros generales de laboratorio
agua destilada/desionizadan/aSuministros generales de laboratorio
Control Microscopio fluorescente de diagnóstico Nikon Eclipse 50i Equipado con una cámara dignóstica puntual, modelo 2.2.1 Cámara de incubación Trinity Biotech proporcionada a los clientes (sin catálogo #)Tarro Coplin n/a Material de Toallas de papel

Referencias

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