Colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de ADN fúngico

Resumen

Determinación de la diversidad fúngica dentro de un entorno es un método utilizado en los estudios de salud ocupacional para identificar riesgos para la salud. Este protocolo describe la extracción de ADN de muestras de aire ocupacional para la amplificación y secuenciación de regiones ITS hongos. Este método detecta muchas especies de hongos que pueden ser pasada por alto por los métodos de evaluación tradicionales.

Resumen

Los métodos tradicionales de identificación de hongos exposición en ambientes laborales, como cultura y enfoques basados en la microscopía, tienen varias limitaciones que han dado lugar a la exclusión de muchas especies. Avances en el campo durante las últimas dos décadas han llevado a los investigadores de salud recurrir a enfoques moleculares para la identificación de riesgos de hongos. Estos métodos han resultado en la detección de muchas especies dentro de ambientes de interiores y profesionales que no han sido detectados usando métodos tradicionales. Los datos de este protocolo muestras un enfoque para determinar la diversidad fúngica en aire a través de la extracción de ADN genómica, amplificación, secuenciación identificación taxonómica de hongos interno transcribieron regiones del espaciador (ITS). LOS resultados de la secuenciación en la detección de muchas especies de hongos que son no detectado o difíciles de identificar a nivel de especie mediante cultivo o microscopia. Mientras que estos métodos no proporcionan medidas cuantitativas de la carga fúngica, ofrecen un nuevo enfoque para la identificación de los peligros y puede utilizarse para determinar la riqueza total de especies y la diversidad dentro de un entorno laboral.

Introducción

Exposiciones de hongos en ambientes de interior y trabajo pueden causar morbilidades respiratorias, incluida la sensibilización alérgica y asma¹. Identificación de los riesgos de hongos es importante para evaluar el riesgo y prevenir la exposición de los trabajadores. Estos peligros de hongos pueden ser el resultado de contaminación interior, intrusión de aire exterior o perturbaciones ambientales ocurridos en el transporte de materiales fungicidos en áreas donde los trabajadores están presentes². Métodos para evaluar la exposición de hongos han incluido muestreo de cultura viable así como identificación microscópica de ....

Protocolo

1. preparación de la muestra de aerosol NIOSH

Nota: La muestra de aerosol NIOSH es un dechado de aerosol de ciclón de dos etapas que recoge bioaerosoles utilizando dos tubos de muestreo y un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE).

1. Antes del montaje, inspeccione con cuidado el muestreador. Compruebe el sampler para asegurarse de que no se daña, todos los tornillos estén colocadas y esté ajustada y el precinto alrededor de la costura formado por las dos mitades está intacta. Inspeccione el dechado junta tórica para que no tengan cualquier mellas, grietas o desgarros y que tiene una muy ligera capa de grasa de silicona.
   Nota: El ....

Resultados

Puede evaluarse la distribución de las especies dentro de un entorno con abundancia relativa en la determinación de la cantidad de clones de cada OTU identificados en las muestras de aire. Figura 6 es un gráfico de la corona que representan las especies taxonómicamente colocadas dentro de un ambiente interior después de 60 min de muestreo de aire. Se puede observar que el entorno contiene una variedad de especies dentro de dos grande phyla fungicida, Ascomyco.......

Discusión

Determinar la diversidad fúngica dentro de un entorno de trabajo utilizando enfoques basados en la secuenciación ha mejorado la evaluación de identificación y exposición de peligro de hongos. Con este enfoque ha permitido la detección de muchas otras especies fúngicas que a menudo no se detectan mediante cultivo o métodos de evaluación basados en la microscopía. Aquí se presenta un método para el muestreo de bioaerosoles de ambientes interiores y en el trabajo y la extracción de DNA genómico de muestras de aire para su a.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Muestreador ciclónico de bioaerosoles NIOSH BC251	NIOSH	BC251	El muestreador de NIOSH aún no está disponible comercialmente. Póngase en contacto con William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) para obtener información sobre cómo obtener el muestreador de NIOSH
Tubos de microcentrífuga estériles de Fisherbrand con tapones de rosca	Fisher Scientific	02-681-373 Tubos de	microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL para muestreo de aire; la rosca superior debe coincidir con la rosca del muestreador de NIOSH
Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 15 mL	Corning	352096	15 mL para muestreo de aire
Cinta de vinilo para sala limpia, fácil de quitar, 1/4" de ancho	Cinta de sellado	McMaster-Carr	76505A1
Casete de filtro, estireno transparente, 37 mm	SKC Inc.	225-3LF	Casete de muestreo de 3 piezas (sin filtro). Contiene: base de cassette, cubierta de extensión, tapa de cassette y tapones de entrada/salida filtros de
membrana de fluoroporo hidrófobo de PTFE, 3.0 y micro; m, 37 mm	EMD Millipore	FSLW03700	Contiene: 37 mm, 3.0 y micro; m Filtros de PTFE y almohadillas de soporte Pinzas de
filtro Fisherbrand	Pinza de filtro	Fisher Scientific	09-753-50
Modelo 502 Precision PanaPress	PanaVise	502	está construida a partir de esta prensa de eje de precisión
Cinta aislante de vinilo Scotch Super 33+ Cinta de 19		mm Cinta
calibración multiusos	Inc.	225-112	tarro de calibración
Universal PCXR4 Bomba de muestras SKC	Inc.	Bomba de muestreo	224-PCXR4
Caudalímetro másico 4140	TSI Inc.	Caudalímetro 4140
Roche High Pure PCR Template Kit Roche	Diagnostics	11796828001	Kit utilizado para la extracción de ADN genómico. Contiene: Tampón de lisis, tampón de unión, proteinasa K, tampón de eliminación de inhibidores, tampón de lavado, tampón de elución, tubos de filtro de fibra de vidrio y tubos de recolección de 2 ml
Fisherbrand Tubos de tapón de rosca de polipropileno reforzado de 2 mL con tapas	Fisher Scientific	15340162	Tubos reforzados de 2 mL para la homogeneización de perlas
de vidrio, lavadas con ácido, 212-300 y micro; m	Sigma-Aldrich	G1277	perlas de vidrio
Fisher Scientific Molino de perlas 24 Homogeneizador	Fisher Scientific	15-340-163	homogeneizador de perlas
CelLytic Reactivo de lisis de células B, 10X	Sigma-Aldrich	C8740	reactivo de lisis
Platinum Taq polimerasa	Invitrogen	10966-018	Contiene: Platino Taq polimerasa, 10X tampón PCR (sin MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Diluyente
dNTP Mix	Invitrogen	18427-088	10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Kit de purificación	Qiagen	28106	Kit utilizado para purificar amplicones fúngicos. Contiene: Tampón PB (tampón de unión), Tampón PE (tampón de lavado), Tampón EB (tampón de elución), colorante indicador de pH (opcional) y colorante de carga GelPilot
Owl EasyCast Mini Gel Sistema de electroforesis	Thermo Fisher	B1 o B2
TrackIt 1 KB Plus Escalera	ADN	Thermo Fisher	10488-085

Tubos de polipropileno La prensa neumática de cassette de de