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Artículo de método

Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

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DOI:

10.3791/56742

⸱

12 de enero de 2018

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para lograr la integración estable del gen de interés en el genoma humano por el sistema transcripcionalmente regulado de La bella durmiente . Preparación de la integración de vectores lentivirales defectuosos, la transducción en vitro de las células humanas y el análisis molecular de células transduced se divulgan.

Resumen

El transposón Durmiente (SB) es un sistema integrador no virales con eficacia demostrada para la transferencia génica y genómica funcional. Para optimizar la maquinaria de transposon de SB, se emplean una transposasa hiperactiva transcripcionalmente regulada (SB100X) y transposones basada en T2. Típicamente, la transposasa y transposon transitoriamente por la transfección del plásmido y SB100X expresión es conducida por un promotor constitutivo. Aquí, describimos un método eficiente para entregar los componentes de la SB a las células humanas que son resistentes a varios métodos de transfección física y química, para controlar la expresión de SB100X y estable integrar un gen de interés (GOI) a través de un "cortar y pegar" SB mecanismo. La expresión de la transposasa hiperactiva es estrechamente controlada por el sistema de Tet-ON, ampliamente utilizado para controlar la expresión génica desde 1992. El gen de interés es flanqueado por repeticiones invertidas (IR) de los transposones de T2. Ambos componentes SB vienen en vectores lentivirales defectuosos transitorio producidos en células HEK293T integración. Las células humanas, líneas celulares o células primarias del tejido humano, están en vitro transduced transitoriamente con vectores virales. Además de doxiciclina (dox, análogo de la tetraciclina) en el medio de cultivo, un ajuste fino de la transposasa expresión se mide y da lugar a una integración duradera del gen de interés en el genoma de las células tratadas. Este método es eficaz y aplicable a la línea celular (por ejemplo, las células HeLa) y células primarias (por ejemplo, keratinocytes humanos primarios) y así representa una valiosa herramienta para la ingeniería genética y transferencia de genes terapéuticos.

Introducción

La transposasa hiperactiva de SB100X juntada al transposon basada en T2 ya se ha utilizado en preclínica gene terapia aplicaciones1,2,3, genoma modificaciones4,5, y célula de vástago pluripotent inducidas (iPSC) reprogramación6,7. Típicamente, los componentes del SB son provistos transitoriamente por transfección del plásmido y un fuerte promotor constitutivo conduce la expresión de la transposasa. Sin embargo, a pesar de los nuevos métodos de mejora de la transfección, entrega del sistema de dos componentes sigue siendo un desafío para muchas aplicaciones. Así, el desarrollo de un nuevo protocolo de entrega tiene creciente interés. Además de métodos de transfección de plásmidos8 y mRNA9, entrega viral basado en adenoviral10,11, adeno-associated virus (AAV)12, Baculovirus13gammaretroviral14 y vectores lentivirales15 ha sido propuesto en el pasado. En particular, el sistema de elección debe garantizar una entrega transitoria de los componentes del SB sin integración del vector viral. Sin embargo, la expresión constitutiva de la transposasa plantea preocupaciones de seguridad debido al riesgo de rehopping incontrolable de los transposones.

Por lo tanto, la regulación transcripcional de SB100X por un refinado sistema de Tet-ON es el primer desafío. Se clona un promotor TTE responden modificado, obtenido mediante la sustitución del original promotor desarrollado mínimo citomegalovirus (CMV) con el promotor mínimo (-81) del gen Timidine quinasa (TK) del Virus del Herpes simple 1 (HSV-1)16, aguas arriba de la CDNA de SB100X (pTetOTKSB100X). La transformada inversa-tetraciclina-transactivator rtTA2s-M217 se expresa bajo el control del promotor constitutivo fuerte (fosfoglicerato promotor, PGK) clonado en un plásmido diferentes (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Cuando se añade al medio de cultivo, dox une el rtTA2s-modulador M2 y anclar el promotor de Tet o complejo, dando como resultado una inducción bien regulada de SB100X expresión18.

El segundo gran reto surge de la ineficiente de la transfección de células primarias humanas por varios métodos físicos y químicos. Para administrar transposasa en células humanas resistentes a la transfección, la SB100X y la rtTA2s-cassettes de expresión M2 vienen en dos integración vectores lentivirales defectuoso (IDLVs)19: IDLVTKSB y IDLVrtTA2s- M2. Vectores virales se producen transitoriamente como tercer vectores de generación de células HEK293T20 y pseudotyped con la glicoproteína G del Virus de la estomatitis Vescicular (VSV-G), que le confiere un amplio espectro de la infección. Las partículas de vector son concentradas por ultracentrifugación y graduadas por Inmunocaptura p24 de HIV-1 Gag. Para transducir las líneas celulares y células primarias, las partículas de vector son complexed con polibreno y se incuban con las células Diana en la presencia o ausencia de dox. Activación dependiente de la droga de SB100X expresión en células transduced se mide por RT-PCR (qRT-PCR) cuantitativa18.

Una vez que se demuestra expresión regulada de Tet SB100X, transposición de lo GOI (p. ej., proteína verde fluorescente, GFP) en el genoma de la célula objetivo sigue los eventos moleculares claramente esquematizados por Bak y Mikkelsen21. Un tercer IDLV vector llevar un casete de expresión para el GOI clonado entre el IRs transposon T2 (IDLVT2) tiene que ser construido y empaquetado como se mencionó anteriormente. Por último, los tres vectores IDLV pueden utilizarse para transducir las células humanas (por ejemplo, queratinocitos primarios) en vitro e integrar el GOI en presencia de doxiciclina18.

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Protocolo

1. los plásmidos empleados

Nota: Plásmido pCCL-PGKrtTA2S-M2 fue amablemente proporcionado por Prof. Zappavigna (Universidad de Modena y Reggio Emilia, Módena, Italia). El plásmido de pCMVSB100X llevando la secuencia de codificación de la transposasa hiperactiva y el plásmido de transposon pT2/BH fueron amablemente proporcionadas por Prof Z. Ivics (Instituto de Paul Ehrlich, Langen, Alemania) y Prof. Z. Izvak (Max Delbruck centro de Medicina Molecular, Berlín, Alemania).

  1. De todo clonado en Escherichia Coli (e. coli), siga la estrategia de clonación del proceso de elección y enzima de la restricción o amplificación por PCR del fragmento a ser clonados.
    Nota: La tabla 1 resume todos la plásmidos empleada en el presente Protocolo. Se ofrecen una descripción y las referencias de cada plásmido.

2. producción del vector viral

Nota: Todos los vectores virales se producen en una campana de biohazard en un nivel de contención de bioseguridad BSL2, según normas institucionales.

  1. Células HEK293T adherentes en cultivo en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero HyClone, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina y glutamina 2 mM.
  2. Día 0: Preparar cinco preparación viral placas de 15 cm y semilla 5.5x106 células en 30 mL de medio.
  3. Día 1: transfección
    1. Antes de comenzar la transfección, preparar 100 mL de solución salina 2 x HEPES buffer (HBS):
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10,0 mL
      Na2HPO4 (0,5 M) 0,3 mL
      Estéril de agua mL 84,1
      Ajustar el pH a 7.1 con 37% HCl.
      Nota: 2 x HBS pueden almacenarse a 4 ° C. Un pH exacto es muy importante para la transfección eficiente. El rango de pH óptimo es de 7.10 a 7.12.
    2. Retirar el medio y añadir 22,5 mL/placa de fresco mediano 4 h antes de la transfección.
    3. Transfectar las células HEK293T con el plásmido de la transferencia, el plásmido de empaquetado de pMD.Lg/pRRE.D64VInt, el plásmido pMD2.G de codificación envolvente y pRSV-Rev (tabla 1) según la siguiente cantidad/placa:
      transferencia de μg de plásmido 25.00
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 μg
      pMD2.G 8.75 μg
      pRSV-Rev 6,25 μg
      Nota: El plásmido DNAs se preparan según el protocolo de CsCl descrito por Maniatis22 o mediante un kit de purificación del plásmido libre de endotoxinas.
      1. Suspender 56.25 μg de DNA (mezcla de 4 plásmidos) de 1,125 mL de agua estéril y añadir 125 μl de 2.5 M CaCl2 (solución A).
      2. Añadir a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL estéril (solución B) 1,250 mL de 2 x HBS.
      3. Añadir solución un 1,250 mL a B (1,250 mL) gota a gota mientras burbujea con una pipeta de 1 ó 2 mL (solución de transfección, volumen total 2,500 mL).
      4. Incubar por 20 min a temperatura ambiente (RT).
      5. Usando una micropipeta P1000, distribuir todo de la solución de transfección (2,500 mL) a la monocapa celular gota a gota.
    4. Incubar durante una noche en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C, 5% CO2.
  4. Día 2: Quite el medio y añadir 15 mL de medio fresco (vea el paso 2.1).
  5. Día 3: Recoger y concentrar el sobrenadante que contiene partículas lentivirales.
    1. Recoger sobrenadante (~ 70 mL) de todos (n = 5) placas de células transfected, filtrar a través de un 0.45 μm PESS filtrar y llenar 2 tubos de polyallomer (1 pulgadas x 3.5 pulgadas) / viral preparación.
    2. Concentrar las partículas de vector por ultracentrifugación a 106.000 g x 2,5 h, a 15 ° C con freno.
    3. Inmediatamente después de dejar la ultracentrifugación (para evitar la resuspensión del precipitado en el tubo), suavemente Vierta el sobrenadante en un recipiente que contiene 10% de lejía y suspender las pastillas apenas visibles 2 en 100 μl de PBS 1 x (+ 1% BSA). Esto es normal como el pellet es claro y muy pequeñas. Utilizar el vector concentrado recién preparado o alícuota y almacenar las preparaciones virales a-80 ° C.
      PRECAUCIÓN: El sobrenadante contiene partículas lentivirales que deben ser blanqueadas minuciosamente antes de deshacerse de los residuos de riesgo biológico.
  6. Para valorar la preparación de vectores virales, utilice un kit de Inmunocaptura p24 Gag de VIH-1 según protocolo del fabricante.
    Nota: Para estandarizar la producción de vectores virales, podrían emplearse reactivos basados en liposomas. Sin embargo, el título del vector viral es altamente dependiente en la eficiencia de transfección y pureza del ADN del plásmido.

3. transducción de líneas celulares humanas (por ejemplo, las células HeLa)

Nota: Las células HeLa son cultivadas en medio modificado Eagle de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal de ternera, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina y 2 mM glutamina. La tabla 1 resume todos los vectores empleados en el presente Protocolo. Se proporciona una descripción para cada vector. Transducción de células HeLa permite la verificación de la regulación transcripcional de la transposasa de SB en la mejor combinación de dosis de los dos vectores IDLV. Variación de dosis IDLV puede estar relacionado con vector valoración de partícula y tipo de la célula blanco.

  1. Día 0: Semilla 2 x 105 células en 3 mL de medio para cada pocillo de una placa de 6 pozos. Preparar 4 pozos.
  2. Día 1: Transducción de células HeLa.
    1. Para cada condición, diluir vectores lentivirales para un volumen final de 1 mL medio (ver nota anterior) en presencia de 10 μL de polibreno (concentración final 8 μg/mL):
      Dilución para el pozo #1: burlarse de células transduced (control negativo).
      Dilución para el pozo #2: vector IDLVTKSB (2.600 ng de p24).
      Dilución para los pozos #3, #4: vector IDLVTKSB (2.600 ng de p24) + IDLVrtTA2s-vector M2 (9.600 ng de p24).
    2. Retire el medio de cada pozo donde las células HeLa fueron plateadas en el día 0 y agregar diluciones de vectores lentivirales para el correspondiente bien.
    3. Spinoculate la placa de 6 pozos en 754 x g durante 45 minutos a 20-25 ° C y entonces traslado la placa de 6 pozos a una incubadora de cultivo celular en 37 ° C y 5% CO2.
    4. Después de 6 h, sustituir los vectores que contienen medio por medio fresco en todos los pozos y añadir doxiciclina a 1 μM en el pozo #4. Poner la placa en una célula cultura la incubadora a 37 ° C durante 48 h.
  3. Día 3: Preparación de pellets celulares para extracción de RNA.
    1. Antes de desmontar las células, prepare una solución de trabajo de tripsina (1 x):
      2.5% tripsina (10 x) 5,0 mL
      500 mM EDTA (concentración final = 5 mM) 0,5 mL
      1 x PBS 44,5 mL
    2. Solución de trabajo de tripsina caliente a 37 ° C antes de usar. Solución de trabajo de tripsina a 4 ° C.
    3. Medio de quitar y lavar las células con PBS 1 x. Agregar 0,5 mL de solución de trabajo de tripsina con 37 ° C en cada pocillo e incubar a 37 ° C por 7 min (en una incubadora de cultivo celular).
    4. Después de la incubación, Añadir 0,5 mL de suero que contienen media a cada pocillo para inactivar células recogemos en un tubo de centrífuga y tripsina. Enjuagar bien una vez con 3 mL de PBS 1 x y Centrifugue la suspensión celular por 5 min a 240 x g.
    5. Lavar las células con 5 mL de 1 x PBS, centrifugar durante 5 min a 240 x g y descartar el sobrenadante. Use perdigones recién recogidos de la célula o almacenar a-80 ° C. Extraer ARN de pellets para realizar RT-PCR semicuantitativa (ver paso 6).

4. transducción de células primarias humanas (por ejemplo, queratinocitos)

Nota: Keratinocytes humanos primarios se siembran sobre 3T3-J2 irradiados letalmente células (capa de alimentador)23, un amable regalo de Yan Barrandon (EPFL, Lausana, Suiza).

  1. Crecer células de ratón Swiss 3T3-J2 en modificado Eagle suplementado de Dulbecco con 10% suero bovino de donantes, 50 U/mL de penicilina-estreptomicina y glutamina 4 mM (3T3 medio).
  2. Crecimiento de queratinocitos plateado en células 3T3-J2 irradiados letalmente cFAD, medio de Eagle modificado de Dulbecco y mezcla de medios Ham F12 (3:1) que contenga suero fetal bovino (10%), penicilina-estreptomicina (1%), glutamina (2%), insulina (5 μg/mL), adenina ( de 0.18 m m), hidrocortisona (0,4 μg/mL), la toxina del cólera (0.1 nanómetro) y la triyodotironina (2 nM).
  3. Día 0: Semilla 3 x 105 letalmente irradiadas las células 3T3-J2, previamente diluidas en medio 3T3 a una concentración final de 1 X 105 células/mL, en cada pocillo de la placa de 6 pozos. Preparar 9 pozos.
  4. Día 1: Transducción de los queratinocitos primarios
    Nota: Transducción de keratinocytes permite cuantificación de la regulación transcripcional de la transposasa de SB en la mejor combinación de dosis de los dos vectores IDLV (qRT-PCR) y verificar la integración de GOI (GFP) en las células diana (cytofluorimetric Análisis).
    1. Antes de desmontar las células, preparar la solución de trabajo de la tripsina:
      0.5% tripsina-EDTA (10 x) 5,0 mL
      500mM EDTA (concentración final = 5 mM) 0,5 mL
      1 x PBS 44,5 mL
    2. Solución de trabajo de tripsina caliente a 37 ° C antes de usar. Solución de trabajo de tripsina a 4 ° C.
    3. Para desasociar subconfluente queratinocitos en cultivo, quiten medio las células con PBS 1 x y añadir 1 mL de solución de trabajo de tripsina precalentado a cada pocillo. Incubar a 37 ° C durante 15 min en la incubadora de la cultura de célula.
    4. Después de la incubación, resuspender las células de un pozo bien y transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga que contiene 2 mL de suero que contiene medio (si muchas células estén fijadas, incubar durante un minuto adicional a 37 ° C). Enjuagar bien una vez con 3 mL de 1 x PBS o medio fresco y añadir la solución de enjuague para el tubo de centrífuga con la suspensión de células.
    5. Centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante.
    6. Lavar las células con 5 mL de 1 x PBS, centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante.
    7. En un tubo de polipropileno de 15 mL, diluir 1.6x105 keratinocytes en 1 mL de medio de cFAD, una dilución para cada condición.
    8. Diluir vectores lentivirales en 1 mL de medio de cFAD en presencia de 20 μL de polibreno (concentración final de 8 μg/mL en un volumen final de 2 mL):
      Diluciones para los pozos #1, #2, #3: burlarse de células transduced (control negativo sin vectores).
      Diluciones para los pozos #4, #5: vectores IDLVTKSB (13.000 ng de p24) + IDLVrtTA2s-vector M2 (48.000 ng de p24).
      Diluciones para los pozos #6, #7, #8, #9: vector IDLVTKSB (13.000 ng de p24) + IDLVrtTA2s-vector M2 (48.000 ng de p24) + vector IDLVT2 (9.160 ng de p24).
    9. Transducir las células en suspensión mediante la adición de cada dilución de vectores lentivirales (1 mL) a la correspondiente suspensión de queratinocitos (1.6x105 keratinocytes en 1 mL).
    10. Retire el medio de las células 3T3-J2 irradiados letalmente sembradas en el día 0 y placa transduced queratinocitos (1.6x105 keratinocytes en 2 mL) en ellos. Después transducing bien proceder con la siguiente.
    11. Incubar a 25 ° C por 30 min y luego se transfieren las células a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular de 6 h.
      Nota: No spinoculate queratinocitos primarios, como la viabilidad y proliferación serán fuertemente afectados.
    12. Después de 6 h, añadir 1 mL de medio de cFAD a cada pocillo. Añadir doxiciclina μM 1 (concentración final) en los pozos #5, #8 y #9. Volver a las células a 37 ° C.
  5. Día 2: Reemplazar cFAD mediano con 3 mL de medio KC con EGF de 10 ng/mL.
  6. Día 3: Trypsinize y lavar las células de los pozos #1, #4 y #5 como se describe antes (véase 4.4.1 a 4.4.6). Congelación de gránulos de la célula a-80 ° C para extraer ARN total para análisis de qRT-PCR (ver paso 7).
  7. Trypsinize células de pozo #2, #6 y #8 como se describe en pasos 4.4.1 a 4.4.5 y realizar análisis cytofluorimetric para la expresión de GFP (ver paso 5).
  8. Mantener la cultura de los pozos #3, #7 y #9 para doblajes de al menos 3-4, suficientes para diluir no integrados IDLVT2 vector (5 días de keratinocytes humanos primarios sobre capa de alimentador).
  9. Día 6: Aproximadamente 5 días post transducción, trypsinize las células (ver pasos 4.4.1 a 4.4.5) de los pozos #3, #7 y #9 para realizar análisis de cytofluorimetric para la expresión de GFP (ver paso 5).
    Nota: Eficiencia de sincronización y transducción de experimento están influenciados altamente por tipo la célula primaria y por la variabilidad de muestras colectadas.

5. Cytofluorimetric análisis de transduced queratinocitos primarios

Nota: Un citómetro de flujo configurado un láser azul (488 nm), un láser rojo (633 nm) y filtros para la detección de la fluorescencia de GFP y APC es empleada (véase Tabla de materiales).

  1. Discriminar los queratinocitos de la capa de alimentador 3T3-J2, etiqueta transduced queratinocitos separados en día 3 y 6 (ver pasos 4.7 y 4.9) con mouse APC monoclonal-anticuerpo conjugado de anti-alimentador.
    1. Preparar 4 mL de buffer para cada muestra la coloración:
      5% FBS 200 ΜL
      500 mM EDTA (concentración final = 2.5 mM) 20 μL
      ΜL de PBS 1 x 3780
    2. Lavar las células separadas con 1 mL de tampón de tinción. Centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante.
    3. En un tubo para la adquisición de la citometría de flujo, suspender 5 x 104 células en 100 μL de tampón de tinción y añadir 2 μL de anticuerpo anti-alimentador (1:50). Mezclar bien e incubar durante 30 min en hielo en la oscuridad.
    4. Después de 30 min, lavar con 2 mL de tampón de tinción. Centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante. Resuspender en 200 μL de tampón de tinción.
    5. Adquirir señales de APC y GFP por cytofluorimetric análisis18. La fracción de células GFP+ de la población de células APC– indica queratinocitos transduced.
      Nota: Si se desea, fijar la muestra teñida antes de citometría de flujo con paraformaldehído al 2% en PBS 1 x y almacenar a 4 ° C en la oscuridad hasta la ejecución.
  2. Analizar datos de citometría de flujo mediante el trazado de la relación entre el porcentaje de GFP+las células en el extremo (5 días) y el porcentaje de GFP+células 2 días post transducción, normalizado a nivel residual de IDLVT2-transduced células.

6. semi-cuantitativa de RT-PCR

Nota: Use un termociclador PCR.

  1. Extracto total de RNA de transduced o controlar las células usando un kit de purificación de RNA, según protocolo del fabricante.
    Nota: El ARN Total se puede almacenar a-80 ° C.
  2. Sintetizar el cDNA en una reacción de 20 μl usando 100 ng de RNA total y un kit de la transcriptasa reversa, según protocolo del fabricante.
    Nota: cDNA puede ser almacenado a-20 ° C.
  3. Diseño de cebadores específicos para SB100X, rtTA2s-M2 y GAPDH (un gen de la limpieza).
    Diseños sugeridos:
    SB hacia delante la cartilla: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB inversa cartilla: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 hacia delante la cartilla: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    rtTAM2 inversa cartilla: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH adelante cartilla: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH inversa cartilla: 5'––CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3'
  4. Realizar PCR en un volumen final de reacción de 50 μl. En particular, montar en cada tubo PCR la reacción siguiente:
    cDNA (dilución 1:5) (desde el paso 6.2) 1.00 μl
    Adelante la cartilla (stock de 10 μm) 1.00 μl
    Revertir la cartilla (stock de 10 μm) 1.00 μl
    dNTPs (10 acciones de μm) 1.00 μl
    Buffer (+ MgCl2) (10 x stock) 5,00 μl
    Taq polimerasa (stock de 5 U/μL) 0.25 μl
    Μl de agua estéril 40,75
  5. Utilizar el siguiente programa en el termociclador: 1 ciclo a 95 ° C por 5 min luego proceder a 95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s y 72 ° C por 30 s para 34 ciclos de SB100X, 32 ciclos de rtTA2s-M2 y 25 ciclos de GAPDH.
  6. Preparar el gel de agarosa al 1%. Disolver 1 g de agarosa en 100 mL de TBE 1 x (10 x población diluido en agua estéril), en un vaso de precipitados o matraz. Derretir en el microondas, se arremolinan cada minuto hasta que la agarosa se disuelva completamente. Enfriar la agarosa fundida hasta que llegue aproximadamente a 50 ° C y luego añadir 5 μl de bromuro de etidio (bolsa de 10 mg/mL). Verter la agarosa fundida en una bandeja de gel montado con un peine, gel de fundición de.
  7. Muestras (10 μl) de la carga en el gel de agarosa y realizar la electroforesis.
  8. Si lo desea, adquirir imagen de gel y realizar análisis densitométrico en las bandas PCR.

7. RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)

Nota: Se emplea un sistema comercial de detección de secuencia. Cebadores PCR y sonda 6-carboxyfluorescein (FAM) para el gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) son adquiridos comercialmente.

  1. Para retro-transcripción, vea paso 6.2.
  2. Utilizar software para diseño de primers y sondas específicas para SB100X.
    Diseño sugerido:
    SB.2 hacia delante la cartilla: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    SB.2 inversa cartilla: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    sonda de SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. Realizar PCR en tiempo real en placas de 96 pocillos con un PCR Master Mix y mezcla de cebadores + sonda, en un volumen final de reacción de 25 μl. En particular, considere la siguiente reacción para cada bien:
    cDNA (1:10 dilución en agua estéril) 1.00 μl
    2 μl de la Master Mix 12.50
    Cebadores + sonda x 20 1.25 μl de la mezcla
    Μl de agua estéril 10.25
    Nota: Realice todas las reacciones por triplicado. Para evitar errores de pipeteo, preparar una mezcla de por lo menos n + 3 reacciones (sin cDNA). Alicuotar con una pipeta multicanal.
  4. Ejecutar mediante el siguiente programa PCR en tiempo real: 1 ciclo a 95 ° C por 10 minutos, luego de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 1 min y mantener a 4 ° C.
  5. Analizar datos de qRT-PCR, normalizando la expresión relativa (valor RQ) de la SB100X al nivel de la GAPDH de la misma muestra de cDNA por la cuantificación de 2–CT ΔΔ, utilizando el software de análisis de datos típicos.

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Resultados

Utilizando el procedimiento presentado aquí, tres vectores IDLV llevar los componentes regulados de SB (SB100X, rtTA2S-transposon M2 y T2-GFP) eran empaquetados y brindar de manera eficiente y regular bien el sistema de SB en células humanas. Figura 1A se muestra un esquema para en vitro la transducción de las células HeLa, que fue realizada para evaluar la regulación transcripcional de la transposasa de SB con la mejor combinación de dosi...

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Discusión

Aquí, describimos una metodología ampliamente accesible para integrar estable un GOI en el genoma de las células de la blanco de La bella durmiente-mediada por transposición. Aunque el sistema de SB fue desarrollado para proporcionar un método nonviral para la edición del genoma, una entrega eficiente de la maquinaria de integración (transposasa y T2 transposon) es obligatoria. Por lo tanto, para utilizar el sistema de SB en células primarias apenas transfectable, una entrega viral de los componentes del SB fue ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Prof. Zappavigna, Universidad de Módena y Reggio Emilia, Módena, Italia por facilitarnos el pCCL-PGKrtTA2S-plásmido M2. También reconocemos Prof Z. Ivics (Instituto de Paul Ehlrich, Langen, Alemania) y Prof. Z. Izvak (Max Delbruck centro de Medicina Molecular, Berlín, Alemania) para plásmidos pCMVSB100X y pT2/BH. Este trabajo fue apoyado por DEBRA internacional y Ministerio de Universidad e investigación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco' Águila modificada' s con 4,5 g/L de glucosa sin L-GlutaminaLonzaBE12-614F Medio decultivo celular.
HyClone Fetal Bovine Serum (EE. UU.), caracterizadoHealthcare Life SciencesSH30071.03Suero utilizado HEK293T cultivo celular para la producción de partículas lentivirales.
Penicilina 10.000 UI/ml Estreptomicina 10.000 UI/mlLonzaDE17-602EReactivos para medio de cultivo celular.
L-Glutamina 200mMLonzaBE17-605EReactivo para medio de cultivo celular.
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-AldrichS7653Reactivo para la preparación de HBS 2X.
Tampón HEPES, Stock 1M en solución salina normalLonzaBE17-737Epara la preparación de HBS 2X.
Hidrogenofosfato disódico dihidratado (Na2HPO4· 2H2O), 99,5%Reactivo Merck106580para la preparación de HBS 2X.
Ácido clorhídrico - Reactivo ACS 37% (HCl)Sigma-Aldrich320331Reactivo para la preparación de HBS 2X.
Agua estéril para inyecciónFresenius Kabi-Reactivopara la preparación de HBS 2X.
0,45 y micro; m Filtro PESSWhatman10462100Filtros utilizados para eliminar los restos celulares del sobrenadante viral.
Tubos de polialómero BeckmanCoulter326823Tubos para la concentración de vectores IDLV por ultracentrifugación.
PBS-1X sin Ca, MgLonzaBE17-516FTampón para lavado celular y resuspensión de partículas lentivirales.
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153(Opcional) Tampón para la resuspensión de partículas lentivirales.
Kit de inmunocaptura HIV-1 Gag p24Perkin ElmerNEK50001KTKit para la valoración de partículas IDLV.
Reactivo de 107689 PolybreneSigma-Aldrichpara mejorar la eficiencia de la transducción.
Tripsina (10X) 2,5% en HBSS sin Ca, MgGIBCOBE17-160EReactivo para separar células HeLa (solución madre, a diluir).
Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)100938BAnalaR BDHReactivo para la preparación de soluciones de trabajo de tripsina.
0,5% Tripsina-EDTA, sin rojo de fenol (10X)GIBCO15400-054Reactivo para desprender queratinocitos (solución madre, a diluir).
Suero bovino donante, origen neozelandésGIBCO16030-074Suero para el cultivo celular 3T3-J2 de ratón suizo (capa alimentadora).
Jamón' s F12 mediaGIBCO21765Medio para queratinocitos.
Suero fetal bovinoLonzaDE14-801FSuero para medio de cultivo celular HeLa.
Suero fetal bovino, calificado, origen australianoGIBCO10099-141Suero para medio de cultivo de queratinocitos primarios humanos.
Insulina de páncreas bovinoSigma-AldrichI5500Reactivos para el crecimiento de queratinocitos.
AdeninaVWR1152-25Reactivos para el crecimiento de queratinocitos.
HidrocortisonaVWR3867-1Reactivos para el crecimiento de queratinocitos.
Toxina del cólera de Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052Reactivos para el crecimiento de queratinocitos.
TriyodotironinaSigma-AldrichT5516Reactivos para el crecimiento de queratinocitos.
Reactivos biológicos humanos EGFAustralGF-010-9para el crecimiento de queratinocitos.
Anticuerpo anti-Feeder monoclonal conjugado con APC de ratónMiltenyi Biotech130-096-099Para etiquetar la capa de alimentación.
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Kit de purificación de ARN.
SuperScript III Transcriptasa inversaLife Technologies 18080051kit de transcriptasa inversa.
Mezcla de desoxinucleótidos, 10 mM (dNTP)Sigma-AldrichD7295Reactivo para PCR semicuantitativa.
Reactivo ultrapuro de agua destilada sin DNasa/RNasapara PCR semicuantitativa y para qRT-PCR.
GoTaq G2 Polimerasa de arranque en calientePromegaM740BTaq polimerasa.
Agarosa, para biología molecularSigma-AldrichA9539Reactivo para electroforesis en gel de agarosa.
Tampón UltraPure TBE, 10XInvitrogen15581028Reactivo para electroforesis en gel de agarosa, a diluir (1X) en ddH2O.
Bromuro de etidioSigma-AldrichE1510Reactivo para electroforesis en gel de agarosa.
Doxiciclina: fármaco Sigma-AldrichD-9891para inducir la expresión de transposasa en células HeLa y en queratinocitos
: TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystem4304437TaqMan Universal PCR Master Mix, incluyendo cebadores y sonda.
Tubo centrífugo de polipropileno de alta claridad de 15 ml, fondo cónico, con tapón de rosca de sello de cúpula, tubos de352096Falcon Corningestériles para la recolección de células y la preparación de dilución de vectores.
Placa de cultivo celular tratada con TC de 150 mm con rejilla de 20 mm,Falcon estéril Corning353025placa de cultivo celular para producción viral.
Placa de cultivo celular multipocillo de fondo plano transparente de 6 pocillos, tratada con TC, con tapa, envuelta individualmente, Placa de cultivo celular estérilFalcon Corning353046para la transducción de queratinocitos primarios humanos y HeLa.
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, volumen 1,5 mLEppendorf0030 120.086Tubos para la preparación de diluciones.
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, volumen 2 mLEppendorf0030 120.094Tubos para la preparación de diluciones.
Tubos de PCR de 0,2 ml con tapas planas, tubos sin RNasa, DNasa, ADN e inhibidores de PCRpara PCR semicuantitativa.
Placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos con código de barras, 0,1 mlde biosistema aplicado434690696 pocillos para qRT-PCR.
Tubo de Poliestireno de Fondo Redondo de 5mL, sin TapaBD Falcon352052Tubos para la adquisición de citometría de flujo.
Pipetas serológicas desechables, poliestireno, envueltas individualmente, estériles (diferentes volúmenes)cualquiera)-pipetas para aplicaciones de cultivo de tejidos estériles.
Puntas de filtro, estériles y libres de RNasa, DNasa, ADN y pirógenos (diferentes volúmenes)(cualquiera)-Puntas de filtro para aplicaciones de biología molecular y colura de tejidos estériles.
Medidor de pH(cualquiera)-Equipo para la medición de HBS 2X pH.
PCR Termociclador(cualquiera)-Equipo para PCR semicuantitativa.
Equipo de electroforesis en gel de agarosa(cualquiera)-Equipo para la electroforesis en gel de agarosa de PCR semicuantitativa.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2BD-Citómetrodeflujo.
7900HT Sistema rápido de PCR en tiempo realBiosistema aplicado7900HTEquipo para qRT-PCR.
Centrífugas de sobremesa para el procesamiento eficiente de muestras en aplicaciones de cultivo celular, refrigeradas, con cubos de microplacas.(cualquiera)-Centrífuga para el procesamiento de cultivos celulares y espinoculación.
Ultracentrífuga Optima L-90K equipada con rotor SW32TIBeckman Coulter-Ultracentrífugapara la producción de partículas lentivirales.
Equipo para cultivo celular y laboratorio de biología molecular (por ejemplo, campana de flujo laminar de clase II diseñada para trabajos con materiales BSL2, incubadora de cultivos celulares, refrigeradores y congeladores (+4 ° C, -20 y grados; C, -80 y grados; C), micropipetas y pipete-aid).
Batas protectoras de laboratorio, guantes, protección facial de acuerdo con las normas y reglamentos del Instituto, en particular para la producción y transducción de partículas lentivirales.
GE Reactivo , (

Referencias

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712(2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344(2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771(2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

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