Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Resumen

Este protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.

Resumen

Soluble N- etilmaleimida sensible proteína (NSF) accesorio proteína del receptor (trampa) proteínas de fusión son clave para el tráfico de la membrana, ya que catalizan la fusión de la membrana en las células eucariotas. La familia de proteínas SNARE consiste en alrededor de 36 miembros. Rutas de transporte intracelulares específicos son catalizadas por conjuntos específicos de 3 o 4 proteínas SNARE que contribuyan a la especificidad y fidelidad de la membrana trata. Sin embargo, estudiar la función precisa de proteínas SNARE es técnicamente difícil, porque trampas son muy abundantes y funcionalmente redundante, con más trampas que múltiples y superposición de funciones. En este protocolo, se describe un nuevo método para la visualización de la formación de complejos de trampa en células vivas. Este método se basa en la expresión de proteínas SNARE C-terminal Unidas a proteínas fluorescentes y medir su interacción por energía de resonancia Förster transferencia (traste) empleando vida de fluorescencia microscopía (FLIM) la proyección de imagen. Encajando los histogramas de por vida de fluorescencia con un modelo de decaimiento multicomponente, FRET-FLIM permite (semi-) estimación cuantitativa de la fracción de la formación del complejo SNARE en diferentes vesículas. Este protocolo se ha aplicado con éxito para visualizar la formación compleja de la trampa en la membrana plasmática y en compartimientos endosomal en células mamíferas y las células inmunes primarias y puede ser fácilmente extendido para estudiar funciones de trampa en otros organelos en animal, vegetal y células fúngicas.

Introducción

Trata de la membrana es una característica central de las células eucariotas, donde vesículas de membrana bud apagado de un orgánulo de donantes hacia y del fusible con un organelo blanco^1,2. Excepción de las mitocondrias, todos estos pasos de la fusión de la membrana son catalizados por miembros de la proteína SNARE familia^1,2. La familia de proteínas SNARE consiste en alrededor de 36 miembros en células de mamíferos y cerca de 20 miembros en levadura². Proteínas SNARE contienen uno o dos ~ 52 residuos de largo, nativamente regiones, denominadas SNARE-motivos. Proteínas SNARE son atadas a menudo a las membranas por una hélice transmembrana c-terminal^1,2. Trampas pueden ser categorizados basado en los residuos central contribuyen a la trampa compleja en arginina (R) y glutamina (Q) trampas^1,2. Fusión de membrana está impulsada por la interacción de 3 o 4 trampas cognadas que juntos contribuyen 4 trampa-motivos y se distribuyen sobre el donante y aceptor de^1,de membrana². Un complejo de la trampa consiste en un adorno de lazo R y tres motivos Q-SNARE (llamados Qa, Qb y Qc). Formación de complejos se inicia en el termini N de los motivos de lazo, formando una llamada trans-trampa-complejo y continúa hacia C-termini, formando un apretado haz de en espiral-arrolle α-helicoidal llamado un cis-trampa-complejo. La formación de complejos de incluso una sola trampa compleja arrastra a las membranas del donante y del aceptador y supera la barrera de energía para la fusión de la membrana³.

A menudo técnicamente es difícil asignar distintos complejos SNARE a rutas de transporte específicas dentro de las células. Aunque trampas contribuyen claramente a la especificidad de tráfico de la membrana, son promiscuos, funcionalmente redundante, y sus funciones superponen^1,2. Debido a esto, experimentos de perturbación a trampas, como por knockout de genes, RNA de interferencia, la introducción de anticuerpos de bloqueo o con fragmentos SNARE soluble actúa como negativos dominantes, con frecuencia no resultan en fenotipos claros como otro Trampas compensarán^2,4. Por otra parte, es difícil de distinguir pasos de fusión de membrana específico de eventos de tráfico por aguas arriba, porque de trampas se pueden participar en varias rutas de transporte². Estudios de localización de trampas por microscopia enfoques, mediante inmunomarcación o genética fusión a proteínas fluorescentes reportero, sufren de los problemas que: (i) trampas localizar varios orgánulos como ellos a menudo median varios pasos la trata de personas y (ii) sus localizaciones no significan automáticamente que funcionalmente se dedican a formación complejo SNARE. Finalmente, complejos SNARE pueden identificarse mediante experimentos de inmunoprecipitación utilizando una de las trampas como cebo y las otras trampas como blancos, pero esto no permite la asignación de estos complejos organelos específicos o las rutas de tráfico. Así, actualmente, no hay ninguna técnica alternativa para visualizar complejos SNARE con resolución organellar. Inmunofluorescencia no es capaz de demostrar las interacciones de la trampa pero puede mostrar sólo la presencia o ausencia de co-localización, mientras inmunoprecipitación sólo puede mostrar interacciones trampa en toda la población de la célula pero no asignan los organelos donde estas las interacciones ocurren.

Para superar estas limitaciones, un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de complejos SNARE dentro de células vivas con resolución organellar fue desarrollado recientemente por Verboogen et al. ⁵ este método se basa en la expresión de pares de trampas con proteínas fluorescentes espectralmente desplazadas fusionados con el C-terminal a sus hélices transmembranales. Después de la terminación de la fusión de la membrana y la formación de un cis-encadenar complejo, estos fluoróforos en el termini de C de las hélices transmembranales inmediatamente se yuxtaponen entre sí. Los fluoróforos son entonces dentro de la distancia de Förster (típicamente < 5 nm), resultando en traste de fluoróforo donantes verde-cambiado de puesto al fluoróforo aceptor rojo-cambiado de puesto^5,6. FRET resultados en Temple de fluoróforo donador y una mayor emisión del fluoróforo aceptor que puede ser medida de la proporción de la emisión del donador y aceptor (radiométrica traste). Sin embargo, radiométrica traste entre dos moléculas diferentes es un reto, debido a niveles de diafonía y diferente fluorescencia del donador y aceptor trampas en distintos orgánulos y células^7,8. TRASTE se puede medir también de la vida de la fluorescencia, que es el tiempo entre la excitación y la emisión de un fotón. Si el fluoróforo donador puede liberar su energía por nerviosismo, esta competencia resultado de proceso en un aparente acortamiento de la vida de la fluorescencia. Esto se puede medir por el FLIM^7,8. Vida traste es mucho más sólido que radiométrica traste para medir interacciones entre dos moléculas diferentes, como la vida de la fluorescencia es una propiedad intrínseca de un fluoróforo y es insensible a su concentración. Por otra parte, FRET es aproximación cuantitativa, porque la eficacia de traste es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donador y aceptor fluoróforos (esencialmente una función escalón). Por lo tanto, ajustando los histogramas de por vida de fluorescencia registrados por FLIM con un modelo de decaimiento de doble componente, FRET-FLIM permite la (semi-) estimación cuantitativa de la fracción de moléculas de trampa en trampa formación compleja⁵.

Recientemente, este método de FRET-FLIM fue utilizada por Verboogen et al. para visualizar la formación de complejos SNARE en primarias células dendríticas del sistema inmune⁵. Se ha demostrado que al encontrarse un estímulo patógeno, las células dendríticas redireccionar su tráfico de membrana acompañado por una mayor formación de complejos de la proteína de membrana asociada a vesículas R-SNARE (VAMP) 3 con el Qa-SNARE sintaxina 4 específicamente en el membrana del plasma. Este aumento de la formación complejo trampa es probablemente necesaria para satisfacer el aumento de la capacidad secretora de la secreción de citoquinas proinflamatorias como la interleucina-6⁵. Este protocolo describe los pasos experimentales necesarios para la adquisición de datos de FRET-FLIM para la visualización y (semi-) para la medición cuantitativa de complejos SNARE.Se explica cómo ajustar los histogramas de toda la vida de la fluorescencia de células completas con mono y bi-exponencial decaimiento de funciones, dando por resultado la duración aparente de la fluorescencia como una estimación cuantitativa a las interacciones de la trampa. En este protocolo, se utiliza la línea celular HeLa ampliamente utilizado como un ejemplo, pero el método puede ampliarse fácilmente para estudiar complejos SNARE en otras células eucarióticas.

Protocolo

1. preparación de las muestras del microscopio

1. Expresión de Qa-SNARE sintaxina 4 fundido a mCitrine (sintaxina 4-mCitrine; fluoróforo donador) y el VAMP3 R-caja fundida a mCherry (VAMP3 mCherry)
   Nota: Otras trampas con proteínas fluorescentes fusionados con sus hélices transmembranales c-terminal pueden también utilizarse. En lugar de mCitrine-mCherry, otros pares donador aceptor de fluoróforos espectralmente separado también pueden ser utilizado (e.g., CFP-YFP).
   1. Crecen las células HeLa y dividir células HeLa 900.000 sobre platos de fondo de cristal tres 35 mm de diámetro adecuados para microscopía.
      Nota: En principio, este protocolo puede ser adaptado para otros tipos de células eucariotas y platos de microscopía.
      1. Mantener cultivos de células HeLa en T75 frascos con 10 mL de glucosa alta de Dulbecco suplementado modificado Eagle (DMEM), con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y 1% antibiótico-antimicótico (conteniendo anfotericina B, penicilina y estreptomicina) a 37 ° C y 5% CO ₂ en una incubadora de cultivo celular.
      2. Reponer el medio dos veces una semana y dividir las células 1:10 una vez por semana o cuando las células alcanzan a 85-90% confluency a los nuevos frascos T75 (500.000 células/frasco, en promedio).
      3. Quitar el DMEM y lavar las monocapas de HeLa dos veces con 8 mL de tampón fosfato salina (PBS) durante 3 minutos.
      4. Retirar el PBS y añadir 2 mL de PBS con el ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA).
      5. Incubar las células durante 5 minutos a 37 ° C y 5% de CO₂ en incubadora de cultivo celular y posteriormente ligeramente agite el frasco para separar las células HeLa de la parte inferior del matraz.
      6. Eliminar las células con 10 mL de medio, transfiera la suspensión a un tubo de 15 mL y sacar una alícuota de 10 μL para contar.
      7. Diluir la alícuota 1:1 con tinción de azul de tripano 0.4% y contar las células con un hemocitómetro de Bürker⁹.
         Nota: Cuenta 4 x 4 de dos plazas y múltiples el número de células por 10.000 el número de células/mL.
      8. Después de que célula contando, tomar 900.000 células del tubo de 15 mL, dividirlos en los platos de fondo de 3 cristal (vea el paso 1.1.1) y prepararse para la transfección.
   2. Transfectar las células por electroporación¹⁰ (véase Tabla de materiales) con la sintaxina 4 mCitrine construcción (donante, muestra #1), sintaxina 4-mCitrine junto con VAMP3-mCherry (muestra #2) y la sintaxina 3 fundido a (mCitrine y mCherry Muestra #3).
      Nota: Otros métodos de transfección celular también pueden ser usado¹¹. La construcción de tándem en la muestra #3 es un control positivo para la estimación del más corto tiempo de vida esperable (es decir, máxima esperable traste).
2. Cultura de que las células durante la noche en alta glucosa DMEM suministrado con 10% FCS y 1% antibiótico-antimicótico a 37 ° C con 5% CO₂ en una incubadora de cultivo celular.
3. DMEM de aspirar y lavar las células una vez con el celular en medio de la proyección de imagen (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; véase Tabla de materiales) por 2 min y posteriormente colocar las células en la proyección de imagen fresca medio.

2. registro de los datos FLIM

1. Lugar muestra #2 debajo de un microscopio confocal de dominio de tiempo FLIM con una fuente de excitación pulsada para el fluoróforo donador (es decir, mCitrine) y adquisición de datos de tiempo resuelto. Mantener las células a 37 ° C con una platina calefactada.
   Nota: El microscopio confocal utilizado este protocolo está equipado con un objetivo de inmersión agua de 63 X 1.20 NA, un láser pulsado de luz blanco (80 MHz pulso, < duración de pulso de 100 ps), un tubo multiplicador de fotón (PMT) y un Time-Correlated único fotón contando (TCSPC ) sistema (véase Tabla de materiales para la configuración específica utilizada). Otros microscopios FLIM también pueden ser utilizado (por ejemplo, diodos de avalancha del solo-fotón (SPAD) en lugar de PMT, sola longitud de onda láser pulsada en lugar de un láser pulsado de luz blanca).
2. Seleccione una celda con la expresión visible de la mCitrine y proteínas SNARE mCherry etiquetados y grabar una imagen confocal de 256 × 256 píxeles con excitación simultánea de ambos fluoróforos antes de cada medición del FLIM. Un paso de píxel de aproximadamente 2 más pequeño que la difracción limita la resolución espacial del microscopio (~ 200 nm) debe ser utilizado. Para mCitrine, excitar en 516 nm y cobrar emisión de 521-565 nm; para mCherry, excitar a 610 nm y recoger la emisión de 613-668 nm.
   Nota: No no la posición del plano imagen demasiado cerca de la parte inferior del plato (dentro de ~ 2 μm de distancia), ya que esto resultará en un pico de reflexión en el histograma de toda la vida de la fluorescencia. Excitación simultánea de los fluoróforos donador y aceptor se prefiere, como esto permite superar el problema del movimiento de la muestra. Sin embargo, excitación secuencial puede ser utilizada así.
3. Disco una imagen FLIM haciendo clic en Ejecutar el FLIM con la imagen FLIM se registran con las mismas dimensiones y resolución espacial como la imagen confocal grabada en el paso 2.2. Registrar los fotones de la imagen por lo menos 50.000 para el análisis FLIM de celulares, o por lo menos 400 fotones/pixel. Sólo excitar el fluoróforo donador de mCitrine y no mCherry aceptador fluoróforo y excitar así en 516 nm y recoger la emisión de 521-565 nm.
4. Repita los pasos 2.1-2.3 para varias celdas y para los demás muestra #1 (sólo donante) y la muestra #3 (la construcción del tándem de mCitrine mCherry).
5. Registrar una función de la respuesta del instrumento (IRF). Sintonice el monocromador del detector de emisión de la longitud de onda de excitación (p. ej., emisión récord de 510-550 nm) y luego grabar una imagen FLIM con la dispersión hacia atrás de un cubreobjetos de vidrio limpio haciendo clic en el botón Ejecutar FLIM. Usar la misma longitud de onda de excitación (516 nm) y energía utilizada para registrar los datos del celular a pasos 2.1-2.4.
   Nota: Si varios picos son visibles en el IRF o si no pueden ajustarse la emisión monocromadores, la Fig también se puede medir con una solución de colorante fluorescente con ultrarrápida de vida, por ejemplo de amortiguamiento de la fluorescencia de un colorante orgánico en una saturada acuoso solución de yoduro de potasio. Por otra parte, no es estrictamente necesaria para registrar un IRF, porque la pendiente de decaimiento de los histogramas de fluorescencia se puede también caber sin deconvolución de la IRF. Sin embargo, un IRF permite para corregir las características de la temporización del detector del fotón utilizadas y lo hace más exacto los ajustes de los histogramas de por vida.

3.Conversión de las grabaciones del fotón a las imágenes FLIM

1. Descargar e instalar el PT32ICS conversión software⁵.
   Nota: Los datos de toda la vida también pueden ser analizados por otro software, incluyendo software de varios proveedores de microscopio.
2. Configurar el software de PT32ICS.
   1. Establecer el tamaño de 256 × 256 píxeles de tamaño de imagen via configuración | Tamaño.
   2. La posición del canal 2 través de la configuración de | Tamaño.
      Nota: El canal de la emisión de mCitrine es exclusivamente dependiente de la configuración del microscopio. Un canal mal dará como resultado una imagen FLIM con no fotones (es decir, negro la imagen) y como consecuencia un vacío 'LifetimeTable.txt'-archivo. El canal correcto puede ser identificado por ensayo y error.
   3. Ajustar salida en ImageJ (xyz) (o TRI2 (xyt)) para generar imágenes FLIM (paso 3.4).
3. Presiona convertir y cargar uno o más rastros del fotón (archivos .pt3). Para seleccionar múltiples rastros de fotón, mantenga pulsada la tecla Ctrl .
   Nota: El formato de .ptu de 64 bits más reciente también se puede convertir.
4. Asegurar que el software de PT32ICS genera los siguientes archivos en la misma carpeta donde se guardan los archivos de pt3: un montón de fotones por .pt3 rastro de fotón en formato estándar de citometría de imagen (.ics), un mapa de bits archivo por .pt3 rastro de fotón (.bmp), un archivo de texto por conversión (_Report.txt) que contiene información sobre las estadísticas del fotón (es decir, el número total de fotones en cada rastro de .pt3 del fotón, el tiempo de resolución del detector) y un segundo archivo de texto por conversión (_LifetimeTable.txt) que contiene el total histogramas de por vida de la fluorescencia en formato delimitado por tabulaciones para cada rastro del fotón de .pt3.
   Nota: El archivo .ics puede utilizarse para píxel apropiado para generar imágenes FLIM, por ejemplo con TRI2 software^12,13 o la curva delgada montaje biblioteca en ImageJ FIJI^14,15. Este archivo puede también usarse para análisis de fasores¹⁶, por ejemplo con el plugin de momento cerrada fasor de FIJI de Spechron. El archivo de mapa de bits no contiene ninguna información de toda la vida. El segundo archivo de texto se utiliza para el análisis FLIM de celulares en el paso 4.

4. instalación de histogramas de por vida de la fluorescencia para el análisis de células completas FLIM

Nota: Este paso (instalación de deconvoluted de la fig) requiere software capaz de conexión deconvoluted. Montaje de las pistas de los histogramas de fluorescencia sin deconvolución de la Fig se puede hacer con otros programas así.

1. Abrir el programa de software de análisis de datos capaz de caber con deconvolución (Tabla de materiales) e importar el archivo de texto que contiene el histograma de cada huella de fotones (_LifetimeTable.txt) via archivo | Importación | Solo ASCII.
2. Reorganizar la tabla que el IRF es en la segunda columna de la tabla (mediante copiar y pegar). Lugar de la Fig en la segunda columna B junto a los valores de tiempo en la primera columna A.
3. Determinar la calidad de las huellas registradas del fotón por seleccionar todas las columnas pulsando Ctrl + A y seleccionando parcela | Varios paneles | panel de 9. No analizar rastros de fotón con un pico de alta reflexión (figura 4F).
4. Seleccione todas las columnas que contienen los histogramas de control de calidad de vida que se instalarán así como de la Fig en la columna B usando Ctrl clave y la conexión no lineal a través de análisis de la carga | Montaje | Ajuste no lineal de la curva | Abrir cuadro de diálogo.
5. La función de ajuste deconvoluted (disponible en la archivo adicional 1) la carga añadiendo esta función en el software de análisis (a través de categoría | Definidos por el usuario | Función | Añadir). Seleccione el archivo de ajuste de la función 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Esta función se adapta los histogramas de toda la vida de la fluorescencia con una función del decaimiento exponencial mono deconvoluted con la IRF (es decir, la segunda columna B en la tabla) (ecuación 1):
   (Ecuación 1)
   con t el tiempo, τ la fluorescencia evidente toda la vida, A la amplitud y y₀ el desplazamiento.
   Nota: Otra opción es para ajustar los histogramas de por vida con una función de forma bi-exponencial (ecuación 2):
   (Ecuación 2)
   Mediante la fijación de la duración del componente lento (τ₁) a la condición de donante único (paso 1.1.2: ejemplo #1) y que el componente rápido (τ₂) para la construcción del tándem (muestra #3), esto permite la estimación de la fracción de Proteínas SNARE en complejo (F) de las amplitudes de los componentes rápidos (A₂; ver discusión; y lento (A₁) La ecuación 3):
   (Ecuación 3)
   El archivo de función de ajuste para el ajuste exponencial bi deconvoluted 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' está disponible en el archivo adicional 2.
6. Seleccione equipado curvas | X tipo de datos como mismo como datos de entrada.
   Nota: Esto tendrá como resultado el adecuado x-eje escalado de las curvas de cabida.
7. Ajuste las curvas pulsando el botón ajuste.
   Nota: Esto convertirá el ajuste y generar una 'hoja de informe' en el array con una tabla que contiene los cursos de la vida de la fluorescencia, compensaciones y amplitudes. También generará una hoja de datos con las curvas equipadas y los residuos del ajuste.

Resultados

El fundamento del ensayo para la medición de las interacciones de la trampa por traste-FLIM se muestra en la figura 1. El C-termini de las hélices transmembranales de cognado proteínas SNARE se fusionan a un par de proteínas fluorescentes espectralmente cambiada de puesto (p. ej., mCitrine y mCherry). La formación de un cis-encadenar complejo sobre resultados de fusión de la membrana en estas proteínas fluorescentes inmediatamente ser yuxtapuestas uno al otro y preocuparse. La figura 2 muestra imágenes representativas confocales de células HeLa expresando proteínas SNARE marcada con fluorescencia. Se muestra una célula expresan sintaxina 4-mCitrine (donante fluoróforo) con VAMP3-mCherry (fluoróforo aceptor), así como las condiciones de control de las células que expresan sólo la sintaxina 4 mCitrine construir (donante sólo, sin traste) y sintaxina 3 fusionado a ambos mCitrine y mCherry en tándem (máxima esperable traste). La figura 3 muestra las imágenes FLIM generadas colocando los histogramas de la vida de cada píxel con funciones del decaimiento exponencial mono (Figura 3A–B) y (de las funciones del decaimiento exponencial bi y acompaña toda la vida de la fluorescencia Figura 3 - D). la Figura 4A muestra la Fig de nuestra configuración medido por dispersión detrás de un vidrio de cubierta de microscopio. En la Figura 4B–E, histogramas de vida representativos de la fluorescencia de la célula todo análisis FLIM con acompañamiento de ajuste se muestran curvas para las funciones del decaimiento exponencial de mono. Figura 4F muestra un histograma de vida fluorescente de un experimento que se desliza demasiado cerca de la superficie del vidrio de cubierta de microscopio, lo que resulta en un pico prominente de la reflexión. Figura 4 muestra un histograma de toda la vida con representante de ajuste con una función del decaimiento exponencial bi.

Figura 1: esquema de la lógica para la visualización de complejos SNARE por traste. (A) modelo estructural de la proteína neuronal de trampas (proteína base de datos 3HD7¹⁷) membrana asociada a vesículas (VAMP) 2 (azul; R), sintaxina 1 (rojo; Qa-SNARE) y SNAP25 (verde; contiene tanto un adorno lazo Qb y Qc). El C-terminal de la hélice transmembrana de sintaxina-1 es conjugada con mCitrine (fluoróforo donador; proteína base de datos 3DQ1¹⁸). El C-terminal de la hélice transmembrana de VAMP2 es conjugado a mCherry (fluoróforo aceptor; proteína base de datos 2H5Q¹⁹). (B) esquema de la trampa mediada por fusión de la membrana resultando en traste. Después de la fusión de la membrana por la formación de un cis-complejo de la trampa, las trampas inmediatamente se yuxtaponen entre sí resultando en traste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: expresión de proteínas SNARE fusionados a proteínas fluorescentes. Primera columna: donantes fluoróforo, emocionado al 516 nm. Segunda columna: fluoróforo aceptor, emocionado a 610 nm. (A) donante sólo la condición. Imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando sintaxina 4-mCitrine (fluoróforo donador; verde en combinación). El canal del aceptador (segunda columna) muestra la fluorescencia de la diafonía. (B) control negativo (sin trastes). Imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando ambos sintaxina 4-mCitrine con VAMP3 mCherry (fluoróforo aceptor; magenta en combinación). (C) control positivo (máxima esperable traste). La construcción de imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando la sintaxina 3-mCitrine-mCherry tándem. Tenga en cuenta que la señal de fluorescencia de la mCitrine y mCherry señales hace no totalmente traslapo, probablemente debido a una menor resistencia de mCitrine a la degradación lisosomal comparada mCherry (véase la sección discusión). BF: campo brillante. Escala de barras, 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: imágenes FLIM de formación compleja caja. (A) representante de la fluorescencia de por vida las imágenes de las celdas que se muestra en la figura 2. Las imágenes fueron generadas por la primera conversión de los rastros de fotones por un sistema TCSPC (.pt3) para el estándar de citometría de imagen (.ics) utilizando el software PT32ICS. Píxel dispone de toda la vida de la fluorescencia imágenes luego fueron generadas con el TRI2 software^12,13 de umbralización de 15-100% de intensidad, 7 pixel binning circular y monoexponential algoritmo de ajuste (Marquardt). El color indica la vida fluorescente aparente promedio. (B) FLIM imágenes donde las imágenes de vida de fluorescencia (se muestra en panel A) fueron enrevesadas con las intensidades de fluorescencia de un fluoróforo donador mCitrine (se muestra en la figura 2). La convolución se realizó con ImageJ de FIJI con una macro por encargo (véase Tabla de materiales). (C) vida de fluorescencia e imágenes FLIM de la célula HeLa expresando sintaxina 4-mCitrine y VAMP3 mCherry de paneles A-B, pero ahora con ajuste con las curvas de decaimiento exponencial bi (con cursos de la vida fijados en las condiciones de control; ver paso en 4,4 Protocolo). Los colores de píxel indican las fracciones estimadas F de sintaxina 4 en complejo con VAMP3 (ecuación 3). (D) igual que el panel B, pero para el bi-exponencial ajuste. La convolución se realizó con ImageJ de FIJI con una macro por encargo (véase Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: celda todo análisis FLIM. (A) la función de la respuesta del instrumento (IRF) de la instalación. La IRF se midió usando la dispersión hacia atrás en la interfaz de agua de cristal (con un plato de microscopio limpio de vidrio que contiene agua).(B–E) Toda célula histogramas de vida útil de las celdas que se muestra en la figura 2 y figura 3. Se agruparon todos los fotones presentes en las imágenes. Las curvas se deconvoluted con la IRF y equipadas con funciones del decaimiento exponencial mono (ecuación 1). Para estas células, los cursos de la vida de la fluorescencia se obtuvieron de 2.82 ns (células expresando sólo sintaxina 4-mCitrine; donante sólo panel B), 2.09 ns (las células que expresan Co sintaxina 4-mCitrine con VAMP3 mCherry, panel C) y 2.08 ns (las células que expresan la sintaxina 3 - tándem mCitrine-mCherry construir; máximo control de traste esperable; panel D). Las incrustaciones muestran los gráficos mismo, pero ahora con escala logarítmica del eje y. El panel E muestra una superposición de las curvas de decaimiento de paneles B-D. (F) ejemplo de un histograma de toda la vida fluorescente grabado demasiado cerca a la superficie de la hoja de cubierta de microscopio. Esto resulta en un pico de gran reflexión (representado por el área sombreada de amarillo). (G) mismo grupo C, pero ahora se ajuste con una curva de decaimiento exponencial bi con cursos de la vida fija las condiciones de control (ver paso 4.4 en protocolo). Las amplitudes de la rápida (A₁) y lento (A₂) componentes fueron 14.42 y 0,01, respectivamente, dando por resultado una fracción estimada de trampas en el complejo F de 0.99 (ecuación 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1. Archivo de función FLIM_convoluted_IRF haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2. Archivo de función FLIM_convoluted_IRF_biexp haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo muestra el uso del traste-FLIM para visualización de interacción SNARE sintaxina 4 VAMP3 en vivo células HeLa. Sintaxina 4 es una proteína de Qa-SNARE predominante localización en la membrana plasmática donde media exocitosis^1,2,20,21. VAMP3 es una trampa de R que se describe principalmente para localizar en reciclaje compartimientos endosomal y media trata a otros endosomas, así como a la membrana plasmática^1,2,20. Sin embargo, el ensayo de FLIM traste puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otras proteínas SNARE. La única condición es que estas trampas contienen una hélice transmembrana c-terminal, que es el caso de la mayoría de las proteínas SNARE por lejos^1,2. Además, el protocolo descrito aquí puede ser adaptado para la visualización de complejos SNARE en cualquier tipo de células eucariotas, incluyendo plantas y levaduras. En este protocolo, hemos utilizado el acortamiento de la vida de la fluorescencia del fluoróforo donador como una medida de traste. Como un enfoque complementario, la vida útil del fluoróforo aceptor podría ser examinada, debido a que la emisión sensibilizada provoca una fase de subida distinta que proporciona prueba inequívoca transferencia de energía de resonancia se produce.

Actualmente, la técnica FRET-FLIM no puede visualizar complejos SNARE en compartimientos lysosomal. Para la construcción de 3-mCitrine-mCherry tándem sintaxina, la fluorescencia mCherry puede normalmente encontrarse más acumulada en una zona de juxtanuclear, que probablemente corresponde a compartimentos lysosomal, mientras que la señal mCitrine es más abundante en el celular ⁵de la periferia. Se observó una acumulación similar de juxtanuclear de mCherry comparado con mCitrine, cuando el mismo proteínas SNARE Unidas a estas proteínas fluorescentes se expresa Co⁵. Lisosomas se caracterizan por un pH extremadamente bajo (< 4) y una alta actividad de enzimas proteolíticas. La acumulación de juxtanuclear de mCherry probablemente es causada por una mayor resistencia del fluoróforo mCherry lysosomal degradación en comparación con el fluoróforo mCitrine. No es debido al amortiguamiento de pH de mCitrine, ya juxtanuclear acumulación de mCherry también ocurre en la fijación de las células⁵. Así, la técnica FRET-FLIM subestima la cantidad de trastes en las regiones de juxtanuclear (lisosomal) y esto va a requerir otras proteínas fluorescentes reportero que sobreviven a las duras condiciones dentro de los lúmenes de lisosomas.

El FLIM-FRET en principio permite para obtener una estimación cuantitativa de (semi-) de la fracción de trampas en el complejo⁵. Como explicamos en este protocolo, esto requiere la instalación de los histogramas de por vida de la fluorescencia con funciones del decaimiento exponencial doble (ecuación 2), donde la amplitud de la componente rápida es proporcional a la fracción de trampas en complejo ( La ecuación 3). Sin embargo, tal conexión con un modelo de dos componentes es un desafío técnico. Conexión con múltiples parámetros de ajuste libres (dos cursos de la vida de la fluorescencia y dos amplitudes) requiere un número muy grande de fotones, especialmente puesto que los parámetros influyen entre sí y pequeños errores en la vida afectarán las amplitudes y vice versa. Para superar estos problemas de conexión, la vida de la fluorescencia de la componente lenta puede ser fijada a la duración de la condición de donante único (es decir, sin traste; sólo mCitrine actual) y que el componente rápido de la vida útil del tándem construir) máxima esperable traste). Sin embargo, esto debe también interpretarse con cuidado, porque la vida de la fluorescencia puede no ser la misma que en estos Estados de control y puede desviarse debido a múltiples razones (apagando el auto, orientación del dipolo, las variaciones en el microambiente). Múltiples complejos de trampa en las inmediaciones (< 10 nm) puede resultado en traste dependiente de la distancia, el mismo principio que permite el traste ser utilizado como una "regla molecular", pero en este caso, oscurece la cuantificación de complejos SNARE. Por otra parte, una estimación cuantitativa no siempre es significativa, porque las trampas etiquetadas compiten con trampas (sin etiqueta) endógenas. Como consecuencia, el nivel de expresión de etiquetado mCherry trampa es un determinante principal para el porcentaje del traste⁵. Debido a todas estas advertencias, se recomienda a los histogramas de vida fluorescente con una función del decaimiento exponencial mono (ecuación 1). Esto tiene la ventaja que no requiere ningún conocimiento a priori de la vida y la vida fluorescente media aparente resultante proporciona una medida sólida para trampa secuestrantes⁵.

Sin embargo, se espera que cuantitativa traste-FLIM la proyección de imagen de modelos apropiados de dos componentes tendrá potentes aplicaciones futuras. Codificación de caja genes dentro del cromosoma se pueden fusionar con proteínas fluorescentes reportero, por ejemplo por CRISPR/CAS9. Esto resulta en el etiquetado fluorescente de proteínas endógenas de la trampa, con niveles de proteína endógena y no fondo de trampas sin etiqueta y así permite una estimación cuantitativa significativa de la fracción de complejos SNARE por traste-FLIM. Mientras que los niveles de expresión de trampas endógenos podrían ser bastante bajo y dan relativamente bajo señales fluorescentes, se espera que se puede obtener un número suficiente de fotones, especialmente para las células enteras FLIM (que requiere sólo unos pocos 1,000s de fotones). Además, estas mediciones de FRET-FLIM se pueden realizar con más sensibles detectores de fotodiodo de avalancha que también resultará en mayores señales de fluorescencia y mejores estadísticas de fotón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADN plasmídico 'sintaxina 4-mCitrino'Addgene		ID 92422	También se pueden utilizar otros SNAREs con proteínas fluorescentes fusionadas a sus hélices transmembrana C-terminales. En lugar de mCitrine-mCherry, también se pueden utilizar otros pares donante-aceptor de fluoróforos separados espectralmente (p. ej., CFP-YFP).
ADN plasmídico 'VAMP3-mCherry'Addgene		ID 92423	También se pueden utilizar otros SNAREs con proteínas fluorescentes fusionadas a sus hélices transmembrana C-terminales. En lugar de mCitrine-mCherry, también se pueden utilizar otros pares donante-aceptor de fluoróforos separados espectralmente (p. ej., CFP-YFP).
ADN plasmídico 'sintaxina 3-mCitrino-mCereza'Addgene		ID 92426	Control positivo para el FRET máximo alcanzable.
Celdas
35 mm platos con fondo de vidrio	Willco Wells	HBST-3522	Otras cámaras de imágenes de células vivas funcionarán como sustituto
del medio Eagle modificado de Dulbecco	Gibco, Life Technologies	31966-021
Suero fetal para terneros	Greiner Bio-one	758093
Solución antibiótica-antimicótica	Gibco, Life Technologies	15240-062	Pen/Strep funcionará como sustituto
Imágenes de células vivas medio	Thermo Fisher Scientific	A14291DJ	Cualquier otra solución de adquisición de imágenes de células vivas funcionará, siempre y cuando se evite la fluorescencia del medio
Microscopio confocal Leica SP8 con un objetivo de inmersión en agua de 63x 1,20 NA	Leica	SP8	También se pueden utilizar otros microscopios confocales capaces de FLIM en el dominio del tiempo Láser
luz blanca pulsada	Leica	SP8	También se pueden utilizar
Sistema de conteo de fotón único correlacionado en el tiempo (TCSPC)	PicoQuant	PicoHarp 300
PT32ICS software			disponible en la sección 'Software' de www.membranetrafficking.com programa de
software de análisis de datos capaz de deconvolución	Originlabs OriginPro	2016
Fiji ImageJ
Macro Fiji ImageJ hecha a medida para la convolución de la imagen FLIM con Intensity	Fiji ImageJ		Disponible en la sección 'Software' de www.membranetrafficking.com
Bü rker Hemocitómetro	VWR	630-1541
células HeLa	ATCC	ATCC  CCL-2
PBS	B Braun Melsungen  AG	362 3140
EDTA 2 mM	Merck	108417	CAS: 60-00-4
Tubos de 15 mL	Greiner Bio-one
Azul tripano	Sigma Aldrich	93595	CAS: 72-57-1
Dispositivo de electroporación de celdas NEON	Thermo Fisher Scientific	MPK5000S