Artículo de método

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

DOI:

10.3791/56750

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6 de enero de 2018

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1Maine Medical Center Research Institute

En este artículo

Resumen

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En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Resumen

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Células estromales de la médula ósea (BMSCs) constituyen una población celular que se utilizan habitualmente como una representación de las células madre mesenquimales in vitro. Residen dentro de la cavidad de la médula junto con las células madre hematopoyéticas (HSCs), que puede dar lugar a células de sangre rojas, progenitores inmunes y osteoclastos. Por lo tanto, extracciones de poblaciones celulares de los resultados de la médula ósea en una mezcla muy heterogénea de distintas poblaciones de la célula, que puede presentar desafíos en diseño experimental y confundir la interpretación de los datos. Varios aislamiento y técnicas de cultivo se han desarrollado en los laboratorios para obtener poblaciones más o menos homogéneas de BMSCs y HSCs invitro. Aquí, presentamos dos métodos para el aislamiento de BMSCs y HSCs de huesos largos de ratón: un método que produce una población mixta de BMSCs y HSCs y un método que intenta separar las poblaciones dos celulares basan en la adherencia. Ambos métodos proporcionan las células convenientes para osteogénico y diferenciación adipogenic experimentos ensayos así como funcionales.

Introducción

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Primarias BMSCs murinos se utilizan como un modelo en vitro de las células madre mesenquimales desde su descubrimiento en el temprano de años 19801. De hecho, cultivos de células de plástico adherente lavadas de la cavidad de la médula ósea de los huesos largos mantienen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos, osteoclastos, condrocitos o adipocitos en muchos estudios2,3, 4 , 5. sin embargo, la médula ósea es un tejido único compuesto de muchos diferentes poblaciones celulares incluyendo pero no limitado a, BMSCs, HSCs, células endoteliales e inmunes. Así, el aislamiento y técnicas de cultivo pueden producir poblaciones celulares con diferentes homogeneidad. Utilizando estas técnicas para probar el potencial de diferenciación de las células puede ser difícil. Por ejemplo, al comparar las células de los ratones con diferentes genotipos, a partir de una población celular mixta limita la interpretación de los datos. Por el contrario, obtención de poblaciones homogéneas de BMSCs y HSCs puede ser técnicamente difícil y no pueden estar como representante de un modelo ex vivo .

En nuestro laboratorio, estamos principalmente interesados en la utilización de BMSCs debido a su potencial para diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y osteoclastos. Aquí, presentamos las técnicas de aislamiento BMSCs y HSCs y cultura para evaluar osteoblastogenesis o adipogénesis en vitro, así como culturas de HSCs que se diferencian en osteoclastos. Un método utiliza una población mixta de células de médula ósea (BMC) que contiene BMSCs y HSCs directamente convenientes para la adipogénesis, osteoblastogenesis y osteoclastogénesis (llamado Total BMC). Este método es una representación ex vivo más cercana de la heterogeneidad entre las células del microambiente de la médula ósea. Otro método separa adherente de las células no adherentes en un intento de poblaciones "más puros" cultura de BMSCs y HSCs (llamadas BMSCs adherente). El método más adelante permite la cultura de célula experimentos para iniciar con un número más exacto de BMSCs o HSCs y reduce la posibilidad de efectos indirectos complejos de otras poblaciones de células que permanecen en la cultura. Ambos métodos han sido previamente publicados y utilizado para abordar la investigación preguntas6,7,8,9.

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso en el Instituto de investigación de centro médico de Maine.

1. colección tubos preparación

  1. Hacer los medios de cultivo CMMo complementando α medio esencial mínimo (MEM α) con 10% suero bovino Fetal y 1% de penicilina/estreptomicina.
  2. Coloque 100 μl CMMo de medios de cultivo en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. 3 huesos generalmente caben en un solo tubo así que prepararse por consiguiente.
  3. Corte los extremos de puntas de pipeta de 200 μL lo suficiente como para que encajen en los tubos de la centrífuga. Inserte las puntas dentro de los tubos y asegurarse de que puede cerrar la tapa antes de colocar los tubos en hielo.
    Nota: Alternativamente, tubos de microcentrífuga de 0,75 mL con el corte de puntas pueden insertarse en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.

2. cosecha de huesos de ratones

  1. Eutanasia a los animales con CO2 seguido por dislocación cervical y rociarlas con etanol al 70%.
    Nota: Asegúrese de que se utilicen animales del mismo sexo y preferentemente de la misma edad. Rutinariamente utilizamos animales de 7 a 8 semanas de edad. Se recomienda la agrupación de células de al menos 3 animales por grupos experimentales para obtener una mejor población representativos y reproducibles de la célula.
  2. Coloque el ratón sacrificio sobre su espalda en una mesa de disección. Utilice pinzas para crear una tienda de piel en el abdomen. Haga una incisión pequeña (alrededor de 1 cm) con unas tijeras de disección estériles. Retire la piel hacia las extremidades y los pies del corte para exponer la parte inferior del abdomen y las piernas.
    1. Corte debajo del tobillo para sacar el prensatelas. Corte a lo largo de la cresta ilíaca en la cadera para separar la cabeza del fémur de la cadera. Cuando el ratón está todavía en su parte posterior, hacer una incisión en el centro de la cadera para separar los dos huesos ilíacos.
  3. Utilizar trapos libres de pelusa, retire con cuidado el músculo del fémur, tibia y huesos iliacos.
    Nota: Corte tanto de los tendones y el músculo del hueso como hace posible la limpieza más rápida y fácil con los trapos sin pelusa (por ejemplo, kimwipes). Tenga cuidado al manipular los huesos tienden a romperse fácilmente y su fragilidad puede aumentarse con ciertos genotipos.
  4. Una vez que todas las muestras han sido disectadas, colocarlos en PBS en el hielo y mover a una campana de cultivo estériles para los pasos restantes de aislamiento.
    Nota: Trabajar asépticamente posible reduce la posibilidad de contaminación en los cultivos.
  5. Hacer cortes pequeños (aproximadamente 1 a 2 mm) en los extremos proximales y distales de los huesos antes de colocarlos en las puntas seccionadas dentro de los tubos de la centrífuga.
    Nota: Asegúrese de que para cortar una cantidad suficiente para que la médula ósea puede ser centrifugada sin embargo, debe tenerse cuidado para evitar cortar demasiado como poblaciones celulares tienden a variar basado en proximidad dentro del espacio de la médula ósea.
  6. Centrifugar a 10.000 x g durante 15 s a temperatura ambiente. Asegúrese de que la médula es limpiada y peleteada en la parte inferior del tubo de 1.5 mL, mientras que los huesos están dentro de los partes movibles (o 200 μL pipeta tip o 0,75 mL tubo de microcentrífuga). Una vez que se recoge la médula, remueva la con los huesos de los tubos de la colección.
    Nota: Si se lava la médula, los huesos aparecerán blancos. Sin embargo, si la médula ósea permanece en ciertos huesos, puntas de corte a intentarlo y centrifugue.

3. suspensión

  1. Utilizando una aguja de 25 G, tire el celular bolitas de arriba y abajo lentamente para romper terrones y combinar todas las muestras en un tubo cónico de 15 mL solo. Añadir 10 mL de medio de cultivo CMMo por 500 μl de las muestras.
  2. Coloque un filtro de 70 μm en la parte superior un tubo cónico de 50 mL y pasar la suspensión celular a través de este filtro para eliminar fragmentos de huesos posible.

4. galjanoplastia y la cultura de poblaciones mixtas de células de médula ósea (Total BMC)

Nota: Las células se cultivan a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2.

  1. Calcular el número de células y placa a 1.0 x 106 células/cm2 en medios de cultivo. Permite 72 h de cultivo mixto de células a conectar.
    Nota: Se recomienda diluir la suspensión celular 20 x en medios de cultivo y diluir otra vez en trypan azul antes de contar las células usando un hemocitómetro. De ratones C57Bl6/J machos de 7 semanas de edad, rutinariamente cedemos a un numero de celular de alrededor de 50 x 106 células pero edad, sexo y tensión pueden afectar mucho numero de celular.
    Nota: Una población mezcla de células debe adjuntar en la parte inferior de la cultura bien.
  2. Después de 72 h, eliminar los medios de comunicación y reemplazarlo con medio fresco. Continuar cambiando los medios de comunicación todos los otros días y Compruebe la confluencia. Cuando las células alcanzan confluencia de 80-100%, están listos para la diferenciación.
    Nota: Ya que esta cultura se mezcla con BMSCs y HSCs, se puede utilizar directamente para osteoblastogenesis, adipogénesis y la osteoclastogénesis.

5. galjanoplastia y la cultura de la población de Split de BMSCs (BMSCs adherentes)

Nota: Las células se cultivan a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2.

  1. Todas las células recogidas del fémur, tibia y huesos iliacos de un ratón en una placa de cultivo de 10 cm (55 cm2 de área de la cultura) de la placa.
    Nota: Cuando agrupación de ratones C57BL/6J de 2-3, nosotros normalmente la placa esta población 'total' de la médula en un matraz de 150 cm2 .
  2. Después de 48 h de cultivo mixto, eliminar los medios de cultivo (que contiene la HSCs no adherente). Si osteoclastogénesis experimentos a realizar, establecer esta población de células no adherentes a un lado (véase sección 7), si no, aspirado y desechar estas células.
  3. Lave el matraz y la placa con PBS con cuidado para no molestar las células adjuntas.
  4. Quitar PBS y levantar las células añadiendo 0.25% tripsina y mediante la adición de los medios de comunicación de la célula a la suspensión de células de incubación a 37 ° C durante 1-3 minutos apaga la tripsina. En este punto, BMSCs, que ahora se levantan, pueden ser considerados (previamente hecho en paso 4.1) y plateados de experimentos futuros.
  5. Calcular el número de células necesarias para la galjanoplastia. Centrifugue el volumen requerido de la suspensión celular a 1.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: Las células se platean típicamente basado en experimentos de punto final. Por ejemplo, si la proteína/RNA debe ser aislado típicamente plateamos en una densidad más alta (~1.0-2.0 x 106 células/pozo en placa de 6 pozos).
  6. Retire los medios de comunicación y resuspender el precipitado de células en el volumen de medios de cultivo necesarios para placas. Las células en medios de cultivo según los experimentos de la placa y permitirles conectar durante unos días. Cuando las BMSCs llegar a confluencia, proceder a realizar la diferenciación.

6. diferenciación de BMSCs

  1. Osteoblastos
    1. Hacer medios de diferenciación de osteoblastos añadiendo 800 μl de 1 M β-glicerol fosfato en PBS y 200 μL de ácido ascórbico de 0,5 M en PBS a 99 mL CMMo de medios de cultivo (véase el paso 1.1 para la composición de los medios de cultivo CMMo).
      1. Una vez que las culturas BMSCs (BMC total del paso 4.3) o adherente BMSCs paso 5.6 son confluentes, diferenciarlos en osteoblastos cambiando los medios de cultivo para los medios de diferenciación osteoblástica.
    2. Sustituir los medios de diferenciación cada otro día. Las células comienzan a producir nódulos blancos de mineralización. Visualizar con el ojo desnudo en el fondo del pozo; Este proceso puede ocurrir en unos pocos días a 3 semanas.
      1. Para evaluar osteoblastogenesis, realizar tinción de fosfatasa alcalina o Von Kossa tinción en los pozos como se describe en la sección 8.
        Nota: Cambiar los medios de comunicación cuidadosamente inclinando las placas formando un ligero ángulo con el fin de evitar la interrupción de la monocapa celular.
  2. Adipocitos
    1. Hacer los medios base adipocito mezclando 90 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) glucosa alta, 10 mL de suero bovino Fetal, 1 mL de penicilina/estreptomicina, 20 mM rosiglitazona de 100 μl y 100 μl de 2 mM de insulina. Si es necesario, guarde este medio a 4 ° C para la semana durante el experimento de diferenciación.
    2. Hacer los medios de inducción del adipocito mediante la adición de 200 μL de 62,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y 25 μl de dexametasona de 1 m m a 25 mL de medio de Base del adipocito.
    3. Una vez que las culturas BMSCs (BMC total del paso 4.3) o adherente BMSCs paso 5.6 son confluentes, cambiar los medios de comunicación a medios de inducción del adipocito. Considere este día 0 de la diferenciación.
    4. Después de 48 h, eliminar los medios de comunicación y actualizar la cultura con los medios de inducción de adipocitos.
    5. En el día 4, cambie a media base del adipocito.
      Nota: Las gotitas de lípidos pueden comienzan a aparecer tan pronto como el día 2 o día 4.
    6. El día 7, se observa que las células acumulan gotas lipídicas máximo y mostrar un fenotipo similar a un adipocito maduro. No de la cultura más allá de este punto, ya que puede causar muerte celular/separación.

7. diferenciación de HSCs en osteoclastos

  1. Hacer los medios de diferenciación de osteoclastos mediante la adición de 50 μl de 25 μg/mL del Receptor activador de NFKB ligando (RANKL) y 15 μl de 25 μg/mL de macrófago Factor estimulante de Colonia (mCSF) a 25 mL de medio de cultivo CMMo.
  2. Una vez que el BMC total (desde el paso 4.3) o las células no adherentes (desde el paso 5.2) se unen al pozo, medios de cultivo se puede cambiar a los medios de diferenciación de osteoclastos. Reponer los medios de diferenciación cada otro día.
  3. Observar los cultivos de osteoclastos diariamente al microscopio con 10 aumentos. Observe que los osteoclastos fusión y forman células multinucleadas, generalmente alrededor del día 5-7 de diferenciación.

8. coloración

  1. Osteoblastos
    Nota: Para tinción de fosfatasa alcalina (AP), a menudo uso un AP tinción kit (véase Tabla de materiales) según las directrices.
    1. Realizar tinción de AP, siguiendo las instrucciones del fabricante del kit.
      1. Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células con PBS. Fijar las células con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS durante 12 minutos a temperatura ambiente.
      2. Mientras tanto, que la solución de AP utilizando los reactivos del kit de tinción por agregar 500 μl de AP nitrito de sodio en solución alcalina FRV 500 μl y mezclar suavemente; dejar reposar 2 minutos añadir 22,5 mL dH2O y 500 μl naftol AS-BI alcalina. Mezclar suavemente.
        PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.
      3. Una vez que las células están fijadas, lavar con PBS y agregar solución de AP en cada pocillo (1 a 2 mL por pozo). Cubrir con papel aluminio y dejar manchas durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz. Aspirar la solución, lavar con agua destilada y deje que la plancha secar.
    2. Adquisición de imágenes de colonias teñidas utilizando una cámara para observar las células positivas de la fosfatasa alcalina.
    3. También puede realizar Von Kossa en vez de tinción de fosfatasa alcalina. Para ello, lavar los pocillos con agua destilada como cualquier PBS restante precipita con nitrato de plata.
      1. Fijar las células con 4% PFA en PBS durante 12 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue suficiente solución nitrato de plata al 5% para cubrir el pozo y exponer a la luz fuerte por 1 h a temperatura ambiente.
    4. Retirar la solución de nitrato de plata y lavar cada pocillo con agua destilada. Añadir solución de tiosulfato de sodio 5% a las células y dejar reposar 3 minutos.
    5. Aspire el tiosulfato de sodio y lave con agua destilada. Deje la placa de secar y observar el yacimiento teñido en marrón oscuro/negro con ojo desnudo.
  2. Adipocitos
    1. Para la tinción de aceite rojo O (ORO), fijar las células con 10% neutro tamponado con formol por 1 h a temperatura ambiente.
    2. Mientras tanto, hacen de la solución de Stock de ORO disolviendo 0,035 g en 10 mL de isopropanol. Esto es suficiente para una placa de 6 pozos. Mezclar y pasar la solución utilizando un papel de filtro (tamaño 11 μm de poro).
    3. Hacer la solución de ORO por diluir en 9 mL de solución stock de ORO con 6 mL de agua destilada. Dejar la solución en un rockero hasta que esté listo para su uso.
    4. Preparar isopropanol al 60% en agua destilada (hacer lo necesario para cubrir cada una bien).
    5. Una vez que se fijan las células, eliminar el fijador y lavadora una vez con agua destilada. Reemplace el agua con la solución de isopropanol 60% durante 1 minuto.
      Nota: Añadir líquido lentamente mientras que la placa; adipocitos expulse muy fácilmente.
    6. Retire el isopropanol y agregar suficiente solución de ORO para cubrir todas las celdas. Incubar por 15 min en un eje de balancín de baja velocidad a temperatura ambiente. ORO de quitar y lavar dos veces con agua destilada.
      Nota: en este punto, gotitas de lípidos teñidos de ORO pueden visualizarse bajo el microscopio.
    7. Para cuantificar el ORO, desmanchar el ORO mediante la adición de 1 mL de isopropanol al 100% a cada pocillo y meciendo lentamente durante 10 minutos.
    8. Mientras tanto, preparar una serie de diluciones para crear una curva estándar basada en las siguientes 8 normas con solución de ORO (2.100 μg/mL) y isopropanol como diluyente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 y 0 μg/mL.
    9. 200 μL de los estándares y las muestras destained en triplicado en una placa de carga y leer la absorbancia a 490 nm.
      1. Determinar la concentración de ORO para cada muestra partiendo de la curva estándar.
        Nota: Se recomienda normalizar la concentración de ORO al número de celular. Número de células puede cuantificarse por la tinción de cristal violeta o la cantidad de ADN.
  3. Osteoclastos
    Nota: Cuando esté listo, le sugerimos osteoclastos de la tinción para fosfatasa de ácido tartrato resistente (TRAP) mediante la tinción de la trampa del kit (véase Tabla de materiales).
    1. En la trampa de tinción, fijar células durante 30 min a temperatura ambiente con glutaraldehído al 2.5% en PBS. Mientras tanto, hacer la solución trampa mezclando 50 μl de solución de Base de granates Fast, 50 μl de nitrito de sodio, 4,55 mL de agua destilada, 50 μl de solución de tartrato de 100 μl, 200 μL de solución de acetato de y de Napthol AS-bifosfato.
    2. Aspire de fijador y lavar las células con PBS dos veces antes de añadir la solución trampa durante 1 h a 37 ° C.
    3. Lavar con agua destilada antes de contar los osteoclastos bajo el microscopio (10 X de magnificación). Las células de la trampa+ aparecen púrpuras con 3 o más núcleos.

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Resultados

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Resumen de las culturas de célula
Las técnicas de dos cultivo permiten la evaluación de la diferenciación en una población mixta de BMC de BMSCs y HSCs (BMC Total, figura 1A) o en una población de BMSCs separó de HSCs (BMSCs adherente, figura 1B). 48 horas después de que las células de la médula están aisladas y plateado (figura 1), que rápidamente en las partes inferiores de la p...

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Discusión

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En este artículo, se presentan dos métodos de cultura de BMSCs con sus ventajas y limitaciones. Aislar las células de la médula ósea es un proceso relativamente fácil. Sin embargo, obtener una población celular representativa de las células madre mesenquimales o progenitores osteoclástica puede ser difícil debido al diverso ambiente celular de la cavidad de la médula.

Cultivo de la totalidad de los contenidos de la médula ósea proporciona una representación cercana del microambiente en viv...

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Divulgaciones

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Los autores revelan que no tienen ningún conflicto financiero de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01 AR061164-01A1).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
200μ Puntas de pipeta L TubosRainin 17014401
1,5 mL USAScientific1615-5500
tubo cónico de 15 mL VWR89039-668
Tubo cónico de 50 mLVWR89039-660
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) Sigma-Aldrich21-040-CM
EtanolFisher Science04-355-451
Herramientas
70 μ Filtros mBD Falcon352350
0,25% de tripsinaGibco25200
KimwipeVWR82003-820
Paraformaldehído (PFA)Microscopía electrónica Science15710
Kit de fosfatasa alcalinaSigma-Aldrich86R
Nitrato de plataSigma-AldrichS6506
Tiosulfato de sodioSigma-AldrichS7026
Aceite Rojo OSigma-AldrichO0625
IsopropanolSigma-Aldrich190764
10% Formalina tamponada neutraSigma-AldrichF5554-4L
Filtro Whatman Grado 1Sigma-AldrichZ274852
Kit de fosfatasa ácida resistente al tartratoSigma-Aldrich387A
Electrón de glutaraldehído16220
MEMαGibco12571
Suero fetal bovinoVWR97068-085
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15140-122
β-glicerol fosfatoSigma-AldrichG9891
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA4544
DMEM Alta glucosa Sigma-AldrichD5796
RosiglitazonaCayman Chemical717410
InsulinaSigma-AldrichI6634
IBMXSigma-AldrichI5879
DexametasonaSigma-AldrichD4902
RANKLPeprotech310-01
mCSFPeprotech315-02
Microscopio inverter Axio ObserverZeiss
centrífugos de disección

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
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