Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas

Resumen

Este manuscrito detalla un análisis de blot punto sencillo para la cuantificación de los títulos de virus adeno-asociado (AAV) y su aplicación para estudiar la función de activación de montaje proteínas (AAPs), una nueva clase de proteínas virales no estructurales en los AAV serotipos, en la promoción de la Asamblea de cápsida derivado de serotipos AAV cognados y heterólogos.

Resumen

Mientras que virus adeno-asociado (AAV) es ampliamente aceptado como un atractivo vector para terapia génica, también sirve como un virus modelo para entender la biología del virus. En este último sentido, el reciente descubrimiento de una proteína AAV no estructural, denominado proteína activadora de Asamblea (AAP), ha arrojado nueva luz sobre los procesos implicados en el ensamblaje de las proteínas de la cápside viral VP en una cápside. Aunque muchos serotipos AAV requieren AAP para la Asamblea, recientemente hemos reportado que AAV4, 5, y 11 son excepciones a esta regla. Además, demostramos que la AAPs y cápsida montado de diferentes serotipos localiza a diferentes compartimentos subcelulares. Este inesperada heterogeneidad en las propiedades biológicas y papeles funcional de Fiscalizacion entre AAV diferentes serotipos subraya que la importancia de los estudios sobre fiscalizacion derivada de diversos serotipos. Este manuscrito detalla un análisis de blot de punto sencillo para cuantificación de AAV y su aplicación para evaluar la especificidad de dependencia y serotipo AAP en el ensamblaje de la cápside. Para demostrar la utilidad de este análisis de dot blot, nos propusimos para caracterizar el conjunto de cápside y la dependencia de la AAP de AAV de la serpiente, un reptil previamente desacostumbrado AAV, así como AAV5 y AAV9, que previamente han demostrado ser independiente de la AAP y dependiente de la AAP serotipos, respectivamente. El análisis reveló que AAV serpiente cápside Asamblea requiere serpiente AAP y no puede ser promovido por Fiscalizacion de AAV5 y AAV9. El análisis también demostró que, a diferencia de muchos del serotipo común fiscalizacion que promover el montaje del cápside heteróloga por Cruz-complementación, serpiente AAP no promover el montaje de AAV9 cápsida. Además, nos muestran que la elección de nucleasa afecta significativamente la lectura de la prueba de dot blot, y así, elegir una enzima óptima es crítica para la exitosa evaluación de títulos AAV.

Introducción

Virus adeno-asociado (AAV) es un pequeño, no envuelto, monocatenario DNA virus con un genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). El genoma AAV contiene marcos de lectura abierta (ORFs) para los genes rep y cap . En 2010, una proteína no estructural previamente no identificada codificada por una ORF de marco-cambiado de puesto + 1 dentro del gene de la tapa de AAV2 fue descubierta por Sonntag et al. y encontrada para desempeñar un papel decisivo en el conjunto de proteínas del monómero de la VP de la cápsida de AAV2 en un viral de la cápside¹. Esta nueva proteína nombre proteína activadora de Asamblea (AAP) el papel que desempeña en la promoción de cápside de montaje¹.

Los ORFs para AAP han sido identificado bioinformatically en el genoma del parvovirus todos dentro del género Dependoparvovirus, pero no dentro de los genomas de los virus de diferentes géneros de la parvovirus familia^1,2. Estudios funcionales de esta nueva proteína se centraron inicialmente en la AAP del prototipo AAV2 (AAP2), que ha establecido el papel esencial de AAP2 en contra completamente desmontadas proteínas VP al nucleolo para su acumulación y la formación en montado cápsida^1,3,4. La incapacidad de la cápsida de AAV2 para montar en la ausencia de expresión de la AAP ha sido independientemente confirmada por varios grupos, incluido el nuestro^1,2,3,4,5 . Estudios posteriores en los serotipos 1, 8 y 9 de AAV corroboraban el papel crítico de Fiscalizacion en la Asamblea de la cápsida, como proteínas de monómero de VP3 de AAV1, 8, y 9 eran incapaces de formar una cápside completamente montada en la ausencia de coexpresión de AAP².

Recientemente, a través de enfoques que incluyen el uso de cuantitativo dot blot ensayos, investigamos la capacidad de AAV1 12 monómeros VP3 de montar en la cápsida en la ausencia de expresión de la AAP y la capacidad de la AAP1 12 de promover el montaje de VP3 monómeros de serotipos heterólogos. Este estudio ha revelado que AAV4, 5 y 11 VP3 monómeros pueden montar sin AAP. Además, se encontró que ocho de los doce serotipos AAP examinamos (es decir, todos menos AAP4, 5, 11 y 12) muestran una capacidad amplia para apoyar el conjunto de cápside de cápsida de serotipo heterólogo AAV, mientras AAP4, 5, 11 y 12 muestran un substancialmente capacidad limitada en este sentido⁶. Estos cuatro serotipos son filogenéticamente distantes de los AAP serotipos^2,3. Por otra parte, el estudio ha descubierto una heterogeneidad significativa en localizaciones subcelulares de AAPs diferentes⁶. Además, el estudio ha sugerido que la asociación estrecha de AAP con cápsida montado y el nucleolo, el sello de la Asamblea de capsid AAV2, necesariamente no puede extenderse a otros serotipos incluyendo AAV5, 8 y 9, que mostrar la exclusión nucleolar de cápsida montado⁶. Así, la información obtenida del estudio de cualquier serotipo particular AAP no es ampliamente aplicable a la biología PAA todos. Tal naturaleza sorprendente de la biología de la AAP recalca la necesidad de investigar el papel y la función de cada PDA de serotipos AAV canónicos y no canónica.

La función biológica de la AAP en el ensamblaje de la cápside puede valorarse mediante la determinación de que los títulos de partícula viral AAV empaquetado completamente producción en riñón embrionario humano (HEK) 293 células, la línea celular más utilizados para la producción del vector AAV, con o sin proteína AAP expresión. Los métodos estándar para cuantificación de AAV son PCR cuantitativa (qPCR)-basado en ensayos^7,8 y cuantitativa dot blot basado en ensayos de⁹. Otros métodos para la cuantificación de partículas virales AAV como densidad óptica medida¹² de^10,de análisis enzima-ligado del inmunosorbente¹¹ no son ideales para muestras procedentes de muchos serotipos diferentes de AAV o muestras contaminados con impurezas (lisados crudos o medios de cultivo), que son a menudo las muestras utilizadas para la investigación AAV. En la actualidad, qPCR es más ampliamente utilizado para la cuantificación de la AAV; sin embargo, es necesario reconocer posibles advertencias de la prueba de la qPCR, como el ensayo pueden resultar en errores sistémicos y significativo título variaciones^13,14. Ensayos de PCR son afectados por una serie de factores de confusión potencialmente factores como la presencia de horquillas terminales covalentemente cerrados en plantillas PCR que inhiben la amplificación¹³. Incluso un individuo experimentado puede presentar potencial de factores de confusión en qPCR-basado del análisis sin saberlo¹³. Por el contrario, cuantitativa dot blot ensayos son una técnica de biología molecular clásica que no implica la amplificación del genoma y utiliza un principio mucho más sencillo con un mínimo riesgo de errores en comparación con ensayos de qPCR. El método es menos técnicamente difícil; por lo tanto, los resultados del ensayo son razonablemente reproducibles incluso por personas sin experiencia.

En este informe, describimos los detalles metodológicos de un ensayo de blot dot cuantitativa utilizamos rutinariamente para cuantificación del vector AAV y proporcionar un ejemplo de cómo aplicar el análisis para estudiar el papel de promoción de la Asamblea de Fiscalizacion en común serotipos (AAV5 y AAV9) y un previamente desacostumbrada AAP de serpiente AAV¹⁴. En la naturaleza, proteínas VP de AAV y AAP proteínas se expresan en cis de un solo gen (es decir, VP-AAP cis-complementación), mientras que en el análisis aquí descrito, proteínas VP y AAP se suministran en el transporte de dos plásmidos separados (es decir, VP-AAP Trans-complementación). Puesto que cada proteína VP o AAP de diferentes serotipos puede expresarse de cada plásmido independiente, es posible probar combinaciones de VP-AAP heterólogas para el ensamblaje de la cápside (es decir, VP-AAP Cruz-complementación). Brevemente, AAV VP3 de varios serotipos se expresa en las células de HEK 293 por la transfección de DNA de plásmido para empaquetar un genoma del vector AAV en la presencia o ausencia del serotipo cognado AAP, o en presencia de un serotipo heterólogo AAP. Después de la producción, medios de cultivo y lysates de la célula son sometidos a un análisis de dot blot para cuantificar el genoma viral dentro de la cáscara de la cápside. El primer paso de la prueba de dot blot es tratar las muestras con una nucleasa para eliminar contaminantes plásmido DNAs y genoma AAV sin envasar en las muestras. No hacerlo aumentaría las señales de fondo en particular cuando se analizan muestras no purificadas. Esto es seguido por un tratamiento con proteasas para romper la cápsida viral y liberan genomas virales nucleasa resistente a soluciones de muestra. Genomas virales, siguiente son desnaturalizados, borrados en una membrana y cruzado por hibridación con una sonda de DNA específicos del genoma viral para la cuantificación. En el análisis del ejemplo divulgado aquí, demostramos que la serpiente AAV VP3 requiere serpiente AAP para el ensamblaje de la cápside y que serpiente AAP no promueve a la Asamblea de AAV9 cápsida a diferencia de muchos de los AAPs derivados de serotipos de AAP-dependiente que también pueden promover el montaje de cápsida de serotipo heterólogo. Por último, se reporta una importante ADVERTENCIA para qPCR o ensayos de cuantificación de AAV basado en blot dot que la elección de nucleasa afecta significativamente los resultados del ensayo.

Protocolo

Nota: Recetas para las soluciones y buffers necesarios para este protocolo son proporcionados en la tabla 1. El protocolo que se describe a continuación es para que el ensayo de blot de punto de Cruz-complementación VP-AAP para el estudio de las funciones de las proteínas de la AAP en el ensamblaje de la cápside. El método para el ensayo de blot cuantitativo punto más genérico para purificada valoración del vector AAV se explica en la sección de Resultados de representante .

1. construcción de VP3, AAP y Rep de AAV2 expresando plásmidos

1. Construcción de pCMV-AAVx-VP3 (x = serotipos)
   1. PCR-amplificar todo VP3 ORF (1,6 kb) usando una ADN polimerasa de alta fidelidad y el siguiente par de cartilla: VP3 adelante, CTAA-RE1-CACC-N₂₅ (los primeros 25 nucleótidos de la ORF de VP3); VP3 inversa, TCTT-RE2-N₂₅ (los últimos 25 nucleótidos de la ORF de VP3).
      Nota: RE1 y RE2 son sitios para enzimas de restricción (REs) para la clonación. CTAA y TCTT son el terminal 5' y 3' tetranucleótidos añadidos para facilitar la digestión de la enzima de restricción cerca del final del ADN de doble hebra. CACC es una secuencia de consenso de Kozak.
   2. Clonar los productos de PCR de RE-digested entre las correspondientes RE sitios de un vector de expresión mamífero que usa el citomegalovirus humano inmediatamente temprana (CMV-IE) potenciador-promotor para la expresión de alto nivel.
      Nota: Para la clonación molecular, digerir 5 μg del ADN de plásmido de columna vertebral con una restriction enzyme(s) a una concentración de 4 U/μg de ADN por 1 h a una temperatura óptima. Para fragmentos PCR, aumentar las unidades de enzimas (por ejemplo, 10 U/μg de producto de PCR de ORF VP3 de 1,6 kb) y un tiempo de incubación más largo (p. ej., 4 h) debido a un aumento del número de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción por unidad de longitud. Información útil en las enzimas de la biología molecular y clonación procedimientos incluyendo transformación bacteriana se puede encontrar en otra parte^15,16,17.
2. Construcción de pCMV-bandera-AAPx (x = serotipos)
   1. PCR-amplificar todo AAP ORF (0,6 kb) excepto el primer aminoácido mediante una ADN polimerasa de alta fidelidad y el siguiente par de cartilla: AAP adelante, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N₂₅ (los 25 nucleótidos de los 4 nucleótidos en el AAP ORF); AAP inversa, TCTT-RE2-N₂₅ (los últimos 25 nucleótidos de la ORF de la AAP).
      Nota: GACTACAAGGACGACGATGACAAA códigos de una etiqueta de la bandera, que se ha demostrado que no hay efectos perjudiciales^4,5 pero puede omitirse si innecesarios.
   2. Clonar los productos de PCR de RE-digested entre los sitios correspondientes de un vector de expresión mamífero con el CMV-IE promotor enhancer^15,16,17.
3. Construcción de pHLP-Rep
   1. Digest 5 μg de plásmido pAAV-RC2 (7,3 kb) con 20 unidades de Xho I y Xcm y purificar el ADN utilizando un kit comercial de purificación de DNA o por extracción con fenol-cloroformo.
      Nota: Retiro de la 1,8 kb Xho-Xcm que fragmento de los resultados de plásmido de 7,3 kb pAAV-RC2 en la pérdida de expresión de la proteína de cápside VP conservando la expresión de la proteína Rep.
   2. Embotado el ADN termina con 6 unidades de polimerasa de la DNA T4, agarose gel-purificar el fragmento de ADN de 5,5 kb y uno mismo-ligar el fragmento purificado con 50 a 100 ng de ADN y 400 unidades de ligase de la DNA de T4 según recomendación^{15 del fabricante de la}.
   3. Siga el procedimiento de transformación bacteriana estándar referenciado en la paso 1.1.2 Nota.
4. Verifique que el plásmido se construye por digestión de la enzima de restricción y secuenciación^15,18.
5. Realizar plásmido minipreps o maxipreps utilizando kits disponibles en el mercado para obtener una cantidad suficiente de ADN de plásmido para los experimentos de producción de AAV aguas abajo.

2. producción de AAV en HEK 293 células por transfección de DNA de plásmido (ensayo de complementación de la Cruz)

1. Las células de HEK 293 en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) de la cultura-glucosa alta (4,5 g/L) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina y estreptomicina y 1 mM L-glutamina, en una incubadora de 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO₂).
   Nota: Títulos AAV varían significativamente dependiendo de la fuente de las células de HEK 293.
   PRECAUCIÓN: Aunque AAV puede manejarse en bioseguridad nivel 1 (BSL1) contención, contención BSL2 se recomienda para trabajos de célula de HEK 293.
2. Día -1 (24 h antes de la transfección), placa de 6 – 7 x 10⁵ HEK 293 células/pozo en 2 mL del medio completo que se describe en el paso 2.1 en una placa de 6 pozos. Esto generalmente consigue confluencia de ~ 90% al día siguiente.
3. Día 0: transfección
   1. Preparación para la transfección de DNA
      1. Asegúrese de que las células han alcanzado ~ 90% de confluencia.
      2. Calentamiento de DMEM complementado con 1% de penicilina y estreptomicina Mix 1 mM L-glutamina sin 10% FBS (es decir, medio libre de suero) en un baño de agua de 37 ° C.
      3. Deje que la solución de polietilenimina (PEI) alcance la temperatura ambiente.
   2. Preparación de mezcla de ADN de plásmido
      1. Mezclar la plásmidos en 96 μl de tampón fosfato salino (PBS) sin CaCl₂ o MgCl₂ en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril como se indica en la tabla 2. La cantidad total de ADN es de 2 μg/pocillo.
         Nota: Los volúmenes de solución de ADN de plásmido pueden tenerse en cuenta si son nominales. Se recomienda el ajuste de volumen si el volumen total de las soluciones de DNA de plásmido es ≥ 10 μl.
   3. Transfección de PEI
      1. Añadir 4 μL de solución de PEI (1 mg/mL) a la mezcla de ADN de plásmido de PBS (preparada como se indica arriba). El volumen final es de aproximadamente 100 μl (5% del volumen de medio de cultivo). Vortex brevemente los tubos e incubar la mezcla de ADN: PEI durante 15 min a temperatura ambiente.
      2. La espera para que la incubación de 15 minutos completar, sustituir el medio de cultivo con medio libre de suero precalentado que se describe en el paso 2.3.1.2.
      3. Una vez que la incubación de 15 minutos de la DNA: mezcla de PEI es completa brevemente girar los tubos con una microcentrífuga para recoger el líquido a la parte inferior de los tubos y agregar gota a gota la mezcla de ADN: PEI al medio de cultivo en cada pocillo de la placa de cultivo de HEK 293. Suavemente agite las placas y los devuelva a una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂.
      4. Mantener las células en este medio de transfección hasta la cosecha en el día 5 (no hay cambio de medio se requiere).
4. El día 1 y día 2, observar las células transfected con el plásmido pCMV-GFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido para evaluar eficiencia de transfección.
   Nota: para microscopía de fluorescencia, aquí un 10 X / 0.25 objetivo de apertura numérica en combinación con un ocular de 10 × fue utilizado, y filtro de banda de excitación de 450-490 nm y filtro de emisión de paso de banda de 515 – 565 nm fueron empleados. La condición anterior normalmente rinde más que la eficiencia de la transfección de 70%. Las células pueden presentar algunos cambios morfológicos (por ejemplo, las células se han convertido en slim) debido a la condición libre de suero.
5. Día 3 – 5, continúan las células transfected en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂de la cultura.
6. El día 5, recoger células y medio que contiene el virus en tubos cónicos de polipropileno de 15 mL mediante pipeteo arriba y abajo o raspando con un raspador celular.
7. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso.

3. dot Blot análisis para la cuantificación de AAV

1. Recuperación de partículas virales
   1. Rápidamente descongelar los congelados tubos en un baño de agua de 37 ° C. Vórtex los tubos vigorosamente durante 1 minuto maximizar la recuperación de la AAV de las células.
   2. De pellets los restos celulares por centrifugación a 3.700 x g a 4 ° C durante 10 minutos. Tomar 200 μL del sobrenadante de cada tubo y transferir a un tubo de microcentrífuga etiquetados con un tapón de rosca para el ensayo de dot blot.
      Nota: Alícuota el sobrenadante restante en microcentrífuga tubos y almacenarlos congelados a-80 ° C para su uso futuro. Aquí, tubos de microcentrífuga de polipropileno atado con tapones de rosca y una junta tórica se utilizaron. Sellado firmemente es necesaria para evitar que los derrames de AAV y fenol-cloroformo.
2. Tratamiento con la endonucleasa de marcescens del Serratia
   1. Preparar los reactivos de la mezcla A y B de la mezcla (tabla 3). Añadir 10 μl de la mezcla A y 10 μl de la mezcla B en cada tubo. Vórtex los tubos durante 5 s, brevemente girar los tubos para recoger el líquido en la parte inferior de los tubos e incubar los tubos a 37 ° C al menos durante 1 hora.
      Nota: Mezcla A contiene NaOH y optimiza el pH para el tratamiento con la endonucleasa de S. marcescens . B mezcla de suplementos de magnesio. Concentración de S. marcescens endonucleasa en la acción de la enzima comercialmente disponibles puede variar. El volumen de S. marcescens endonucleasa debe ajustarse en consecuencia para hacer 200 U/mL después de agregar la mezcla A y B de la mezcla en tubos en el paso 3.2.1.
      Nota: Un tiempo de incubación, hasta a 4 h, puede disminuir las señales de fondo.
   2. Al final de la incubación, brevemente girar los tubos con una centrífuga de mesa para recoger la condensación y solución de la parte superior y lados de los tubos.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las muestras pueden almacenarse congeladas a-20 ° C o -80 ° C.
3. Tratamiento de proteinasa K
   1. Preparar el reactivo de la mezcla C (tabla 3). Añadir 180 μl de mezcla de C en cada tubo. Vórtex los tubos durante 5 s, girar los tubos brevemente e incubar los tubos a 55 ° C por 1 h.
      Nota: El EDTA en el reactivo de mezcla C quelatos de iones magnesio libres e inactiva endonucleasa de S. marcescens .
   2. Al final de la incubación, muestras alcancen la temperatura ambiente y brevemente girar los tubos con una centrífuga de mesa para recoger la condensación y solución de la parte superior y lados de los tubos.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las muestras pueden almacenarse congeladas a-20 ° C o -80 ° C. Para continuar el protocolo, incubar los tubos a 55 ° C por 5 a 10 min a disolver cristales de SDS contenidas en el buffer completo.
4. Precipitación de extracción y etanol de fenol-cloroformo
   1. Añadir 200 μL de fenol-cloroformo a las muestras y de vortex por 1 minuto girar las muestras en una microcentrífuga en ≥16, 100 g x ≥ 5 min a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: Fenol-cloroformo debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal (EPI; es decir, guantes de nitrilo, anteojos o careta y bata con mangas largas).
   2. Transferencia de 320 μl de la capa acuosa (160 μl dos veces con una pipeta de P200) a un tubo nuevo de microcentrífuga estándar (80% del volumen de líquido acuoso).
      Nota: Es de vital importancia tomar el mismo volumen de solución acuosa entre las muestras, de lo contrario la prueba pierde exactitud cuantitativa.
   3. Preparar el reactivo de mezcla D (tabla 3). Añadir 833 μl de mezcla en cada tubo. Vórtex los tubos durante 5 s e incubar los tubos a-80 ° C ≥ 20 minutos.
      Nota: Mezcla D es una mezcla de etanol, acetato de sodio y glucógeno para la precipitación del etanol conveniente del ADN. Las muestras pueden almacenarse a-80 ° C en este paso y el protocolo puede ser reasumido más adelante.
   4. Centrifugar las muestras con una microcentrífuga en ≥16, 100 x g a 4 ° C ≥ 15 minutos retirar el sobrenadante y secar una vez sobre una toalla de papel limpia. Poner aproximadamente 500 μl de etanol al 70% en cada tubo vórtice los tubos durante 5 s y centrifugar los tubos con una microcentrífuga de sobremesa en ≥16, 100 x g a 4 ° C ≥ 5 minutos.
   5. Retirar el sobrenadante y secar una vez sobre una toalla de papel limpia. Pellets seco a 65 ° C; pellets se pueden secar completamente.
      Nota: No utilice una pipeta para extraer etanol sobrante que queda después de borrar los tubos. Pellets se pueden también secar a temperatura ambiente durante la noche. El protocolo se puede detener aquí y secados pellets de ADN pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios días con la tapa de tubo cerrada.
5. Resuspensión del DNA viral en tampón TE
   1. Disolver los pellets de ADN en 120 μl de tampón TE agitando cada tubo por 30 min a 1 h a temperatura ambiente.
6. Blot dot
   1. Elaboración de normas de DNA plásmido
      1. Diluir el AAV vector genoma ADN plásmido a 10 ng/μL en agua o tampón Tris-HCl (10 mM, pH 8.0). Tomar 25 μl de esta dilución y digestión con enzima de restricción apropiada durante 1 h para linealizar el plásmido de ADN en un volumen de reacción de 50 μl.
         Nota: Hacemos un conjunto duplicado de digestión (ver paso 3.6.4.1). La enzima adecuada debe ser aquella que corta el ADN plásmido fuera de la región de unión a prueba dot blot. Para mayor comodidad, el ADN plásmido diluido puede ser alícuotas (25 μl/tubo) y almacenado congelado a-20 ° C para su uso futuro. Digerir el ADN plásmido mientras que los tubos están sacudiendo en paso 3.5.1. No demasiado las digieren el plasmid DNA estándar.
      2. Añadir 450 μl de agua o TE para el tubo que contiene el plásmido digerido ADN estándar y mezclar bien. Transferencia de 70 μl de esta mezcla a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL con 1.330 μl de agua o TE para hacer un plásmido diluido estándar (25 pg/μL).
      3. Siga la tabla 4 para crear una serie de diluciones dobles en serie (600 μl/tubo). Mezclar bien las diluciones con un vórtex durante 5 s.
   2. Desnaturalización de los estándares y las muestras de ADN virales
      1. Añadir 600 μl de 2 x solución alcalina a cada dilución estándar. Mezclar bien todo con un vórtex para 5 a 10 s. incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
      2. Añadir 120 μl de 2 x solución alcalina a cada muestra de ADN viral. Mezclar bien todo con un vórtex para 5 a 10 s. incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   3. Configurar el aparato de dot blot
      1. Con unas tijeras, corte una membrana borrar (por ejemplo, zeta-sonda) a un tamaño apropiado para el número de muestras y patrones. Remoje la membrana con agua durante 10 minutos antes de colocarlo en un aparato de dot blot. Cubrir los pocillos no utilizados en el aparato de membrana.
         Nota: La manija la membrana con pinzas limpias. Para cubrir pozos vacíos, puede utilizarse la hoja de protección de la luz azul que viene con la membrana. No permita que la membrana se seque antes de atar las muestras y estándares. Para más detalles sobre el montaje y uso de los aparatos, consulte el manual de usuario¹⁹.
      2. Añadir agua a los pozos a los que se cargarán las muestras. Aplicar vacío y tire el agua a través de los pozos para comprobar errores y vuelva a probar cuando se. Vuelva a apretar los tornillos mientras se aplica vacío para asegurar el lacre apretado.
         Nota: Cierre incompleto puede causar fugas de la muestra entre los pozos.
      3. Una vez que el agua es totalmente tirado a través, liberar completamente el vacío (es decir, el colector de vacío debe estar abierto a la presión de aire).
   4. Carga de estándares y muestras en el aparato de dot blot
      1. 400 μL de cada plásmido diluido ADN estándar se aplican a cada pocillo y ejecutar a cuatro carriles de diluciones estándar. Utilice dos alícuotas separadas del Resumen estándar y cargar cada uno por duplicado. Aplique 200 μL/pocillo de cada muestra de ADN viral.
         Nota: Usando los restantes ~ 40 μl de muestras desnaturalizadas, las muestras diluidas pueden ser preparadas (por ejemplo, las muestras diluidas 10 veces usando 20 μl de muestra más 180 μl de solución alcalina 1 x) y borradas si es necesario.
      2. Aplique vacío suave para sacar las soluciones de ADN a través del pozo.
         Nota: Necesidades de presión de vacío ajustarse abriendo parcialmente una válvula de tres vías para que la presión del vacío se aplica a la dot blot aparato así como la atmósfera (es decir, con las armas de llave de paso colocada en un ángulo aproximado de 45 ° donde se hace un ruido de succión más fuerte).
      3. Una vez que han vaciado todos los pozos, libere el vacío mediante el ajuste de la válvula de tres vías. Añadir 400 μL de solución alcalina 1 x a cada pocillo que contiene estándares y muestras. Espere 5 minutos antes de volver a aplicar el vacío para vaciar los pozos.
      4. Vuelva a aplicar el vacío de la misma manera (ver paso 3.6.4.2).
      5. Desmontar el aparato de dot blot bajo vacío, retire la membrana y enjuague con 2 x SSC. Coloque la membrana sobre una toalla limpia de papel con el lado de ADN-limite hacia arriba para quitar el exceso 2 x SSC.
      6. UV-reticulación blotted ADN a la membrana con un crosslinker UV apropiado; la membrana está ahora lista para la hibridación.
         Nota: Las membranas húmedas pueden utilizarse para la reticulación UV. El secado, UV-reticulado membranas pueden almacenarse a temperatura ambiente. Para obtener más información puede encontrarse en la Tabla de materiales.
7. Hibridación y lavado
   1. El tampón de hibridación en un baño de agua de 65 ° C de calentamiento.
   2. Enzimáticamente etiqueta una sonda de DNA con radiactivo α -³²P dCTP y purificar mediante kits disponibles en el mercado según las recomendaciones del fabricante.
      Nota: Utilizamos una sonda de 0,5 – 2,0 kb en longitud desde una región enhancer-promotor o una secuencia de codificación de la proteína en el genoma viral. Aunque este protocolo utiliza sondas radiactivas marcadas con P de ³²para detección de señal, también se pueden utilizar sondas fluorescentes o quimioluminiscente no radiactivo (véase la sección discusión ).
   3. La membrana en una botella de hibridación con el lado de ADN-limite para arriba, enjuague la membrana con 5 mL precalentado tampón de hibridación y desechar el tampón. Luego añadir 10 mL de tampón de hibridación precalentado y coloque la botella en un horno rotante de hibridación a 65 ° C. Gire durante ≥5 min.
   4. Calor-desnaturalizar 20 μl de 10 mg/mL esquilada arenque o solución de ADN de esperma de salmón y la ³²etiqueta P sonda (≥10⁷ cpm) durante 5 min mediante la colocación de los tubos en un conjunto de bloque de calor a 100 ° C. Snap-chill les en hielo para ≥ 2 min, vuelta brevemente y no en hielo hasta su uso.
      PRECAUCIÓN: Para sondas de DNA radioactivas, deben usarse tubos de 1,5 mL con tapón de rosca y junta tórica.
   5. Agregar rápidamente el ADN de esperma de desnaturalizada y sonda radiactiva para el tampón de hibridación en la hibridación de la botella y agitar la botella para 10 s para mezclar. Coloque la botella en el horno de 65 ° C e incubar el frasco con la rotación a 65 ° C para ≥4 h.
   6. Una vez completo la hibridación, detener la rotación, sacar la botella de hibridación y luego verter la solución de sonda radiactiva en un tubo cónico de 50 mL con un tapón de sellado hermético. Guarde la sonda en un recipiente adecuado colocado en un refrigerador para materiales radiactivos.
      Nota: Usado tampón de hibridación con una sonda que se almacena a 4 ° C puede ser reutilizado al menos 5 veces colocando el tubo cónico de 50 mL con un hermético sello de tapón que contiene el tampón de hibridación en un baño de agua de 100 ° C por 5 min.
   7. Lavar la membrana con tampón de lavado a 65 ° C. Agregar 20 a 30 mL de tampón de lavado a la botella de hibridación y gire para 5 minutos repetir esto lavar 2 veces más.
      Nota: Medir la radiactividad de soluciones de lavado y grabar si es requerido por el Instituto local.
   8. Mientras se lava la membrana, coloque un fósforo imagen pantalla sobre un borrador de imagen durante 5 minutos.
   9. Después del tercer lavado, retire la botella de hibridación de la membrana, elimine el exceso de tampón sobre la membrana con toallas de papel y coloque la membrana en un porta papel plástico transparente. Compruebe las señales radioactivas en la membrana usando un contador Geiger. Exponer la pantalla proyección de imagen de fósforo borrados a la membrana durante 10 minutos hasta toda la noche dependiendo de la intensidad de la señal.
   10. Exploración de la pantalla mediante una imagen de fósforo sistema de exploración y obtener los datos de intensidad de la señal de cada punto.
8. Análisis de datos
   1. Dibujar una curva estándar utilizando hoja de cálculo y datos software de análisis (por ejemplo, Excel).
      Nota: Regresión lineal Log-log se utiliza para dibujar una curva estándar.
   2. Determinar el equivalente de nanogramo (ng-eq) para cada una de las muestras de ADN virales por interpolación. Ng-eq es la cantidad de plásmido ADN se utiliza para dibujar una curva estándar que equivale al número de moléculas de ADN virales. Cuando la longitud del ADN del plásmido es 8.000 bp, 1 eq de ng de ADN viral AAV corresponde a 2.275 x 10⁸ partículas.
      Nota: Ng-eq se puede convertir en el número de partículas virales por las siguientes ecuaciones:
      
      
      El número de partículas AAV se expresa convencionalmente como "vg" (vector genomas) o "DRP" (partículas resistente a la DNasa).
   3. Calcular las concentraciones de la AAV de las materias primas. Porque el ADN viral blotted representa 66.7% de la DNA viral en las materias primas, ng-1 eq corresponde a 1.7 x 10⁹ partículas/mL .
      Nota: Esta corrección no es necesaria si todo el ADN viral contenido en el material de partida es borrado en una membrana sin pérdida (ver figura 1).

Resultados

Un resultado representativo de lacras punto cuantitativo para cuantificación de purificada vector AAV las reservas producidas a gran escala se muestra en la figura 1. Con este ensayo de dot blot, se determinó la concentración de una población de vector de doble hebra AAV2G9-CMV-GFP. El vector se purificó por dos rondas de cloruro de cesio (CsCl) gradiente de densidad ultracentrifugación seguida de diálisis como se describió anteriormente²⁰

Discusión

En este informe se describe la utilidad de cuantitativa dot blot ensayos para estudiar AAPs de AAV y su papel en el ensamblaje de la cápside. Conocimiento obtenido de estos estudios puede proporcionar penetraciones detalladas en las diferencias innatas en el proceso de montaje de cápside AAV y el papel funcional de Fiscalizacion entre diferentes serotipos. En este sentido, el punto de Cruz-complementación de AAV VP3-AAP blot ensayo reveló que serpiente AAV VP3 muestra una dependencia estricta de la coexpresión de su cogn...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
La benzonasa	MilliporeSigma	1016970001	denominada Serratia marcescen endonucleasa en el texto principal.
La DNasa I	Roche	4716728001	denominada DNasa I Enzima A en el texto principal.
DNasa I	Invitrogen	18047019	conoce como DNasa I Enzima B en el texto principal.
DNasa I	New England Biolabs	M0303L	Referido como DNasa I Enzima C en el texto principal.
tórica adjunta de 1,5 mL Tubos de microcentrífuga Tubos de microcentrífuga	Corning	430909
1,5 mL Thermo	Fisher Scientific	05-408-129
Tubo cónico de polipropileno de 15	mL Corning	352097
Acetato de sodio de 3 m	Teknova	S0298
Tubo cónico de polipropileno de 50 mL	Corning	430291
Células AAV-293	Agilent	240073	línea celular HEK-293 optimizada para el empaquetamiento de viriones AAV.
AccuGENE 0,5 M Solución de EDTA	Lonza	51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0	Lonza	51238
AccuGENE 10% SDS	Lonza	51213
AccuGENE 1X TE Tampón	Lonza	51235
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Albúmina sérica bovina	MilliporeSigma	A3294
Levantador de células	Corning	3008
Cloroformo	MilliporeSigma	372978
Kit extractor de ADN	Wako Pure Chemical Industries	295-50201	Se utiliza para manchas de puntos cuantitativas en virus purificados. Utilizamos solo la mitad del volumen de todos los reactivos en cada paso recomendado para el Esquema de Protocolo 2 en el manual proporcionado por el fabricante.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-glucosa alta (4,5 g/L)	Lonza	12-614F
ElectroMAX DH10B	Cells Thermo Fisher Scientific	18290015
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2716
Fetal Bovine Serum	VWR	1500-500
Ficoll 400	Alfa Aesar	B22095	Denominado Polysucrose 400.
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Axiovert 40 CFL
Glucógeno	Roche	10901393001
Arenque Esperma ADN	Invitrogen	15634-017
Tubos de hibridación	Thermo Fisher Scientific	13-247-150
ImageQuant TL	GE Healthcare Ciencias de la vida	ImageQuant TL
L-glutamina 200 mM	Lonza	17-605E
Cloruro de magnesio hexahidratado	MilliporeSigma	M0250
MicroPulsador Electroporador	Bio-Rad	1652100
Mini Columnas de ADN de Giro Rápido	MilliporeSigma	11814419001
pAAV-RC2 Vector	Cell Biolabs Inc	VPK-422
Penicilina/Estreptomicina 10K/10K	Lonza	17-602E
Solución salina tamponada con fosfato	Lonza	17-516F
Fosforimaging Exposición Cassette	GE Healthcare Life Sciences	Varios
Phosphorimaging Screen	GE Healthcare Life Sciences	Varios
plásmidos Maxi Kit	QIAGEN	12162
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen
Polietilenimina	Polysciences Inc	23966-2
Polivinilpirrolidona	MilliporeSigma	P5288
Prime-It II Kit de etiquetado de cebadores aleatorios	Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleótidos del 4º nucleótido en el AAP ORF, RE1 es un sitio de enzima de restricción para la clonación): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 son los últimos 25 nucleótidos de la AAP ORF, RE2 es un sitio de enzima de restricción para la clonación): TCTT-RE2-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 los primeros 25 nucleótidos del VP3 ORF, RE1 es un sitio enzimático de restricción para la clonación): CTAA-RE1-CACC-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
VP3 Reverse (N25 son los últimos 25 nucleótidos de la AAP ORF, RE2 es un sitio de enzima de restricción para la clonación): TCTT-RE2-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Proteinasa K Solution	Invitrogen	25530-049
Enzimas de restricción New	England Biolabs	Varios
espermatozoides de salmón ADN	Invitrogen	15632011
Pipetas serológicas	Thermo Fisher Scientific	13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Cloruro de sodio	Thermo Fisher Scientific	S271-10
Citrato de sodio Tribásico Dihidratado	MilliporeSigma	C8532
T4 ADN polimerasa	New England Biolabs	M0203L
Termociclador	Eppendorf	6321000515
Placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejidos	Corning
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	BP152-5
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28955809
UltraPure Buffer-Saturado Phenol	Invitrogen	15513-047
UV Crosslinker	Spectroline	XLE-1000	Se utiliza el modo de reticulación óptima, que proporciona una dosis de energía UV de 120 mJ/cm2.
membrana Zeta-Probe	Bio-RAD	162-0165