El ovario del Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar el desarrollo del nicho de células madre. Aunque se han publicado métodos para disecar larvarios y adultos de los ovarios, disecciones de ovario pupa requieren técnicas diferentes que no han sido publicadas en detalle. Aquí describiremos un protocolo de disección, tinción y montaje pupas ovarios.
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Artículo de método
Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
A diferencia de ovarios de Drosophila adultos, pupas ovarios son relativamente difíciles de acceder y examinar debido a su pequeño tamaño, transparencia y encerrar dentro de una envoltura pupal. El reto de disección de ovarios pupas también radica en su ubicación física dentro de la pupa: los ovarios están rodeados por las células del cuerpo de la grasa dentro del abdomen pupal, y estas células de grasa debe ser removidas para permitir para la tinción de anticuerpos adecuada. Para superar estos desafíos, este protocolo utiliza pipetas de Pasteur modificado para requisitos particulares para extraer las células de la grasa corporal del abdomen pupal. Por otra parte, un cubreobjetos cámara se utiliza en lugar de un tubo de microcentrífuga durante el proceso de tinción para mejorar la visibilidad de las pupas. Sin embargo, a pesar de estas y otras ventajas de las herramientas utilizadas en el presente Protocolo, ejecución acertada de estas técnicas todavía puede implicar varios días de práctica debido al pequeño tamaño de los ovarios de la pupas. Las técnicas descritas en este protocolo se podrían aplicar a los experimentos de curso de tiempo en el que los ovarios se analizan en diversas etapas de desarrollo pupal.
Introducción
Investigación de células madre usando Drosophila ovarios ha expandido ampliamente desde la primera documentación de la célula de vástago hueco1,2,3,4. Tras el desarrollo de herramientas genéticas del seguimiento del linaje, ovario del Drosophila disecciones se han utilizado comúnmente para el estudio de linajes de células madre y señalización vías que regulan el mantenimiento de células madre, proliferación y suerte en el nicho de células madre. Conocimiento de estas vías de señalización puede dar ideas sobre posibles causa....
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Protocolo
1. oviposición
- Combinar unos diez hombres y quince mujeres Drosophila moscas del genotipo deseado en un frasco de alimento mosca rico normal con levadura. Para evitar hacinamiento el frasco, deje que acoplado las hembras a desovar durante no más de 2 – 4 h14.
- Transferencia de los adultos del frasco en un frasco nuevo golpeando el frasco apertura contra un frasco diferente con la comida de mosca. Permita que los huevos se convierten en larvas a temperatura ambiente durante 3-4 días.
2. seleccionar las larvas hembra
- Usando un pincel fino húmedo con cerdas suaves, hacer un mo....
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Resultados
Ejecución exitosa de este procedimiento debe resultar anticuerpos clara coloración que revela la estructura y organización celular de un ovario pupal de Drosophila . Inmunohistoquímica que se describe en este protocolo puede utilizarse para identificar tipos celulares comúnmente teñidos en ovarios de larvarios y adultos. Las células del tallo pupa derivado de enjambre de células18 (descritas por Fasciclin III en blanco) se muestran en la
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Discusión
El paso más crítico y difícil de este protocolo consiste en la preparación de ovarios pupas antes de la fijación. Para asegurarse de que los ovarios, pequeño y enterrados por las células de grasa corporal dentro de la pupa del abdomen, se tiñen suficientemente con los anticuerpos, es importante no sólo romper una abertura grande en el saco abdominal con pinzas, pero también extraer las células del cuerpo de grasa que obstruyen la ovarios de los anticuerpos. Ejecución exitosa de este paso requiere aplicación de sutil pres.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por los institutos nacionales de salud (to1 GM079351 a D.K.). Damos las gracias por sus consejos sobre disecciones de ovario pupa basados en su Protocolo original Dorothea Godt. También agradecemos a Amy Reilein por su ayuda y comentarios sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Pinzas, biología | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara | Thermo Fisher Scientific | ||
| Nikon | SMZ-10A | ||
| Microscopio confocal | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Software de análisis | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Placas puntuales de vidrio de depresión | Pyrex | 7220-85 | |
| Pipeta Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Bombilla de pipeta Pasteur | Varios proveedores | ||
| Mechero Bunsen | proveedores | ||
| Portaobjetos de microscopio esmerilado premium Fisherfinest | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm Nº 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Cinta adhesiva de doble cara | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Pincel fino #0, #3-#5 | Varios proveedores | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit Thomas | Scientific | F167300 | Contiene p20, p200, p1000 |
| pipetas 16% Paraformaldehído | Microscopía Electrónica Sciences | 15710 | Diluido al 4% de paraformaldehído en 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Diluido a 1x PBS |
| Suero de cabra normal | Jackson ImmunoResearch 5000121 | Diluido al 10% de suero de cabra normal en PBST con una concentración | |
| de Triton del 0,5%Anticuerpos primarios (en el protocolo: 7G10 anti-fasciclina III diluido 1:250, antifosfohistona H3 de conejo diluido 1:1000) | Varios proveedores (en el protocolo: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Diluido en PBST con una concentración de Triton del 0,5% | |
| Anticuerpos secundarios (en el protocolo: Alexa-546, suero anti-conejo conjugado con FITC) | Varios proveedores (en el protocolo: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Diluir en PBST con una concentración de Triton del 0,5% | |
| Viales para moscas | Denville Scientific | V9406 | |
| Bolas de algodón, para viales anchos | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Levadura, panaderos Activo seco | MP Biomedicals | 101400 | |
| Alimento para moscas | Producido en laboratorio | Mezcla de agua, levadura de cerveza, harina de maíz, melaza, agar, EtOH, penicilina, 4-hidrobenzoato de metilo y ácido propiónico | |
| Moscas macho y hembra Drosophila (genotipo utilizado en el protocolo: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Referencias
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P.
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Reimpresiones y permisos
