Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

Summary

Isoeléctrica capilar es una técnica basada en anticuerpos, ultrasensible, alto rendimiento, permitiendo la caracterización detallada de las proteínas y sus isoformas de muestras biológicas muy pequeñas. A continuación describe un protocolo para la detección y cuantificación de proteínas específicas y sus isoformas de manera automatizada y robotizada.

Abstract

Immunoblotting se ha convertido en una técnica de rutina en muchos laboratorios para la caracterización de proteínas de muestras biológicas. El siguiente protocolo provee una estrategia alternativa, capilar isoeléctrico centrado (cIEF), con muchas ventajas en comparación con el convencional immunoblotting. Se trata de un método basados en anticuerpos, automatizado, rápido y cuantitativo en que efectúe un procedimiento completo de Blot western dentro de un tubo capilar ultrafino. Esta técnica no requiere un gel para transferencia a una membrana, de borrones, ni películas, que son normalmente necesarias para immunoblotting convencional de rayos x. Aquí, las proteínas se separan según su carga (punto isoeléctrico, pI), usando menos un microlitro (400 nL) de lisado de proteínas total. Después de la electroforesis, las proteínas están inmovilizadas en las paredes capilares por tratamiento con luz ultravioleta, seguido por primaria y secundaria (peroxidasa de rábano (HRP) conjugada) incubación de anticuerpos, cuyo enlace se detecta con mayor quimioluminiscencia (ECL), generando una señal luminosa que puede ser capturada y registrada por una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). La imagen digital puede ser analizada y cuantificada (área de pico) utilizando el software. Este procedimiento de alto rendimiento puede manejar 96 muestras a la vez; es muy sensible, con la detección de proteínas en el rango del picogramo; y produce resultados altamente reproducibles debido a la automatización. Todos estos aspectos son extremadamente valiosos cuando la cantidad de muestras (por ejemplo, las muestras de tejido y biopsias) es un factor limitante. La técnica tiene usos más amplios, incluyendo la investigación de fármacos o anticuerpos, descubrimiento de biomarker y propósitos de diagnóstico.

Introduction

Capilar la concentración isoeléctrica (cIEF) es un inmunoanálisis automatizado, basado en el tubo capilar que resuelve proteínas sobre la base de su carga^1,2,3. Es altamente reproducible y capaz de resolver las proteínas y sus isoformas postraduccional modificado rápida y cuantitativamente. Presenta una alternativa a los métodos convencionales como el western blot. Mientras que el western blot es muy bueno para confirmar la presencia de abundantes proteínas en muestras de fácil acceso; variabilidad, consumo de tiempo y precisa cuantificación de todos los presentes desafíos, en particular al examinar muestras de tejidos biológicos. De hecho, la variabilidad es un problema inherente en el borrar occidental, ya que existen numerosos pasos involucrados, tales como carga y funcionamiento de los geles de SDS-PAGE, transferencia de proteínas sobre la membrana, incubación con diversos reactivos (por ej., primaria y secundaria anticuerpos, ECL) y el desarrollo en la película de rayos x⁴. En la actualidad, la técnica western blot está mejorando con la aplicación de grabación digital de señales quimioluminiscente (Western digital). Recientemente, un sistema automatizado de western blot se ha desarrollado, es decir, el tubo capilar occidental, que es un sistema más libre de las manos y libre de gel. El ensayo completo está automatizado después de la carga de una placa de la muestra (muestras con todos los reactivos necesarios) en el sistema^3,4. El instrumento llevará a cabo todos los pasos como la separación de las proteínas, inmovilización de proteínas en la pared capilar, incubaciones de anticuerpo, lava entre diferentes pasos y el desarrollo y cuantificación de la señal quimioluminiscente. Así, el procedimiento de cIEF presentado aquí ofrece mayor resolución y sensibilidad.

Este método es sensible, como las señales pueden ser generadas y cuantificadas de picogramos de proteínas¹. La alta sensibilidad con una reproducibilidad excelente hace esta tecnología muy útil para el análisis de muestras clínicas. Puede detectar como distinguir post traslacional modificación (por ejemplo, proteína fosforilada diferentes isoformas) de proteínas. Esta tecnología se ha utilizado con éxito para diseccionar diferentes señalización vías^4,5 en estudios clínicos con el objetivo de desarrollar nuevas terapias en cáncer³, y tiene gran potencial para el descubrimiento de biomarcadores y de la droga de proteína .

Protocol

1. la cultura, la estimulación y la lisis de la célula

Nota: Este método puede utilizarse con muchos tipos de células. Para ilustrar el método, se describe un ejemplo usando las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs).

1. Cultura HUVECs en platos de Petri de 10 cm revestido de gelatina, en medio basal de la célula endotelial con la suplementación apropiada (véase Tabla de materiales) y también que contengan 5% FCS, factor de crecimiento epidérmico (5 ng/mL), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF: 0,5 ng/mL), FGF básico (10 ng/mL), factor de crecimiento insulina-like (20 ng/mL), hidrocortisona (0.2 μg/mL) y ácido ascórbico (1 μg/mL).
2. Noche de hambre las células con la célula endotelial basal suplementado con 1% de FCS y sin suplemento de factor de crecimiento.
3. Aspirar todo medio, añadir 2 mL de medio de cultivo de células endoteliales sin factores de crecimiento (medio de hambre) en un plato (control) y luego añadir VEGF de 50 ng/mL en 2 mL de medio de cultivo de inanición en un segundo plato por 7 min.
4. Aspire el medio y lavar las células 2 veces con temperatura ambiente de 10 mL PBS.
5. Asegúrese de que los platos de Petri son sobre hielo y mantenerlos de este paso adelante.
6. Añadir 250-400 μL de hielo frío lisis buffer (bicina/caps; véase Tabla de materiales) que contienen acuosa proteasa inhibidor mezcla y combinación de inhibidor de DMSO (inhibidores de la fosfatasa; véase Tabla de materiales) para cada placa de 10 cm. Remolino de la placa para asegurar una cobertura adecuada y mantenerlo durante 10 minutos en hielo.
   Nota: La concentración final de la proteasa y la mezcla de DMSO inhibidor debe ser 1 x.
7. Raspar las células de la fuente con un raspador celular y traslado a un tubo de microcentrífuga refrigerada previamente. Pipeta para arriba y abajo 5 veces para lisar las células.
8. Someter a ultrasonidos brevemente las células a 4 ° C. El sonicador el ajuste como sigue: número de ciclos = 5, potencia = bajo, = 5 seg., apagado = 30 s. Este paso se incluye a los ácidos nucleicos y no a lyse las células.
   Nota: Baño de ultrasonidos debe ser suave para evitar la desnaturalización de las proteínas.
9. Vórtice el tubo durante 5 s (no continuamente), 2 s a la vez (3 veces) y mantener en hielo.
10. Aclarar lisado por centrifugación a 14.000 x g durante 15 min a 4 ° C, luego inmediatamente, transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga refrigerada previamente limpio.
11. Medir la concentración de proteína usando un ácido Bicinchoninic (BCA) proteína análisis kit⁴.
12. Hacer 10 μl alícuotas, snap congelan en hielo seco o nitrógeno líquido y almacenan a-80 ° C hasta su uso.

2. muestra preparación de mezcla (cálculo de 150 μL muestra Mix)

1. En primer lugar, preparar una mezcla de diluyente de muestra agregar 1 μl de la mezcla de DMSO inhibidor (stock 50 x) y 2 μl de inhibidores de la proteasa (stock x 25) a 47 μl de diluyente de muestra (véase Tabla de materiales), por lo que la concentración final de DMSO inhibidores e inhibidores de la proteasa se convierte en 1 x. A continuación, diluir los lisados de proteína utilizando la mezcla de diluyente de muestra para obtener la concentración deseada (vea el paso 2.3).
2. Preparar Anfolíticas/escalera/proteasa inhibidor/DMSO inhibidor de la mezcla mediante la adición de 3.325 μl de estándar escala (véase Tabla de materiales; stock x 60), 6 μl de inhibidor de la proteasa (x 25), 3 μl de inhibidor (x 50) de DMSO a 137.675 μl Anfolíticas mezcla preparada de antemano (véase tabla de Materiales). Vórtice el tubo por lo menos 15 s total, 5 s en un tiempo (3 - 4 veces) y mantener en hielo.
3. Mezclar las soluciones de los pasos 2.1 y 2.2 en una proporción 1:3, para que la concentración final de DMSO, inhibidores de la proteasa y la escalera estándar de pI 1 X, y las proteínas en el capilar de alcanzan la concentración final deseada (p. ej., 50 μg/mL fue utilizado para Figura 2).
   Nota: La concentración de proteínas en el capilar y el bien son los mismos.
4. Cargar 10 μl de la mezcla de la muestra en el pozo correspondiente, según el diseño de plantilla de ensayo de placa de 384 pocillos (ver paso 3 y figura 1) y la placa de hielo.
5. Diluir el primario (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) y los anticuerpos secundarios (1:300) con diluyente de anticuerpos (véase Tabla de materiales) y Pipetear 10 μl de primaria y 15 μl de anticuerpos secundarios a cada pocillo.
   Nota: en general, mayor concentración de anticuerpos son necesarios para los ensayos de cIEF en comparación con manchas blancas /negras occidentales convencionales.
6. Mezcla de Luminol y peróxido juntos XDR (proporción 1:1; véase Tabla de materiales) y pipetear 15 μl en cada pocillo.
   Nota: Mezclar estas soluciones frescas cada vez antes de usar y mantener en hielo.
7. Una vez que las muestras y los reactivos se pipetea en la placa, centrifugar la placa a 2.500 x g durante 10 min a 4 ° C para girar por el líquido y las burbujas. Si quedan burbujas, retirar manualmente utilizando una pipeta fina.
   Nota: No cargue más de 20 μl de muestra o los reactivos por pozo; de lo contrario, la pipeta del instrumento no puede ser lavada adecuadamente. Asegúrese de seguir las instrucciones del fabricante para preparar todos los reactivos.

3. diseñar una nueva plantilla de análisis con Software del sistema (figura 1)

1. Abra el software del sistema y haga clic en "nuevo" en el menú archivo.
2. Ir al panel de diseño y asignar lugares para reactivos y muestras en una placa de 384 pozos. Utilizar hasta un máximo de 96 pocillos por placa de 384 pozos.
3. Hacer una asignación de reactivo haciendo clic en cualquier lugar un pozo en el bloque. Seleccione un bloque de la fila de 12 pozos. Pozos, por ejemplo, de 1-12 o 13-24, se asignan como un bloque por defecto.
4. Ir a la barra de herramientas del panel de diseño y coloque un bloque de la fila vacía o una muestra, primaria, secundaria o bloque de fila de luminol. Cada bloque se asigna un color diferente, por lo que son fáciles de diferenciar.
   Nota: Haga clic o bien, puede verse un borde negro alrededor de la manzana donde se insertará el nuevo bloque en el panel. También se puede eliminar un bloque de la fila.
5. Ir al panel de protocolo y seleccione una ubicación de reactivo en la placa. A continuación, haga clic en una celda en la columna de muestra y seleccionar el reactivo en el menú desplegable.
6. De esta misma manera, seleccione las ubicaciones de reactivo para la primaria, secundaria y luminol para cada ciclo.
7. Haga clic en celdas, uno a la vez, en la columna de anticuerpo primaria o secundaria y cambiar los tiempos de incubación, si es necesario.
   Nota: Notas de entrada para cada ciclo también pueden ser añadidos.
8. Añadir ciclos haciendo clic en el botón 'Agregar' en la sección de protocolo. 1 ciclo, 4 ciclos o todos los ciclos (en el protocolo se puede añadir un máximo de 8 ciclos).
   Nota: Es posible copiar y pegar información del ciclo en este paso: seleccionar un ciclo, ir a editar, copiar y pegar.
9. Introduzca la información relativa a la muestra, tales como la identidad de los anticuerpos primarios y secundarios, sus números de catálogo y diluciones, etc., en el panel Plantillas. Este es un paso opcional que es útil en el análisis de la ejecución.
10. Guarde el nuevo archivo de ensayo. Antes de hacer clic en el botón 'start', comprobar rápidamente el diseño para asegurarse de que todo está correcto.

4. Protocolo para cIEF ajuste del instrumento

1. Sistema de electroforesis capilar de enfoque isoeléctrico condiciones de separación. Estos deben ser 15.000 MW y 40 min, y el tiempo de inmovilización de la UV debe ser 80 s. Sin embargo, el tiempo de inmovilización de UV puede ajustarse dentro del rango de 80-140 s y puede que deba ser optimizado para la proteína de interés.
   Nota: Un punto del tiempo de inmovilización de UV se puede establecer para cada ciclo, pero no para cada capilar.
2. Set lavado lavado de 1 a 2, 150 s cada lavado (por defecto) y la incubación del anticuerpo primario para 120 min.
3. Set lavado lavado de 2 a 2, 150 s cada lavado (por defecto) e incubación de anticuerpo secundario de 60 minutos.
4. Sistema lavado 3, que debe ser 2 lavados, para 150 s cada lavado (por defecto).
5. Tiempos de exposición cuando se detectan quimioluminiscencia; Estos deben ser 30, 60, 120, 240, 490 y 960 s. Todos los pasos (1-8) se realizará en un solo capilar.

5. ejecutar el archivo de ensayo

1. Una vez que todo esté listo, haga clic en Inicio para comenzar la carrera. El software le pedirá que retire la basura, para recargar el agua y la caja capilar, para añadir el anolito y catolito a la bandeja de recursos, para añadir tampón de lavado y finalmente a la placa de carga en la bandeja de la muestra refrigerada.
   Nota: Retire la tapa de la caja de capilar, pero no retire la tapa de la placa de ensayo. La tapa de la placa puede eliminarse automáticamente por el instrumento cuando sea necesario. Esto ayuda a evitar la evaporación del reactivo.
2. Un par de minutos después de la carrera se ha iniciado, en la pantalla del ordenador aparecerá una barra de estado del instrumento. Mensajes de estado y barras de progreso se aprecia corresponde a la etapa actual del instrumento.
   Nota: Inicialmente, el instrumento comprobará si todo está correcto antes de proceder a pipetear el anolito y catolito en la bandeja de separación, recogiendo el primer bloque de 12 tubos capilares, quitar la tapa de la placa y colocar las muestras de la muestra placa en los tubos capilares y entonces finalmente en la cámara de separación de electroforesis.
3. Haga clic en la pantalla resumen para ver dos paneles: Estado y separación. Los usuarios pueden ver el progreso de la ejecución, y películas de la separación (12 tubos capilares de cada ciclo) pueden ser almacenados cuando se ha completado el paso de electroforesis de cada ciclo. Para observar la separación de electroforesis en un tubo capilar, reproducir la película separación de eso tubo capilar haciendo clic en la opción deseada y luego el botón de play en el panel de control.
4. El archivo de ejecución puede almacenarse automáticamente en la terminación de la carrera.

6. analizar los datos (figura S1)

1. Abra el archivo run y seleccione la ficha de pantalla de análisis. En S1A figura, los datos mostrados (picos) en el gráfico de la muestra están del capilar seleccionado (es decir, 4^th capilar del ciclo 1).
2. Haga clic en editar y luego el análisis (Figura S1B). En esta etapa, los usuarios pueden cambiar el rango de pI, aplicar el pI adecuado para un experimento dado, agregar un ajuste del pico y agregar un nombre de pico.
   Nota: Cuando se utiliza un pH 5-8 Anfolíticas mezcla preparada de antemano (como es el caso aquí), la escalera estándar recomendada a utilizar es uno con fluorescencia etiquetadas péptidos con pIs de 4.9, 6.0, 6.4, 7.0 y 7.3, y cuando se utiliza un pH 3-10 premix, la escala recomendada es uno con pIs de 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 y 7.3. ²
3. Resultados se muestran en la pestaña de picos; los valores indicados para las muestras son posición, pI, máxima altura y, % área, pico ancho y señal a ruido (S/N) (Figura S1C). Elija los datos que se utilice y exportar los datos para su posterior análisis.
   Nota: Los datos sólo pueden ser exportados después de etiquetar el pico (Figura S1C).

Results

Diseño de un nuevo ensayo: Un diseño de placa de ensayo se muestra en la figura 1A. Máximo, pueden utilizarse 96 pocillos de la placa de 384 pozos en bloques de 12 pozos para cada condición (anticuerpo). Puede comenzar cada bloque de 12 pozos de A1-A12 o A13-A24. Filas de colores permiten distinguir las muestras o los reactivos del uno con el otro. En la plantilla de ensayo (figura 1B), información relevante para...

Discussion

Sensibilidad y la resolución de las proteínas son cruciales para la investigación proteómica en muestras biológicas. Hay gran valor en ser capaz de detectar proteínas que están presentes en cantidades diminutas en las células. cIEF puede ofrecer mejoras en la sensibilidad y resolución para la detección de proteínas y sus isoformas⁴.

Esta tecnología se ha utilizado con éxito en muchos proteómicos investigación informes^5,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinPremix simple
G2, pH 5– 8 gradientes de separación (anidados), pH 2 y ndash; 4 tapones	ProteinSimple	040-972	Premezcla de anfolitos
Mezcla de inhibidores de DMSO	ProteinSimple	040-510	Inhibidores de la fosfatasa; para dilución cIEF 1:50 utilizada
Mezcla de inhibidores acuosos	ProteinSimple	040-482	Inhibidor de la proteasa; para dilución cIEF 1:25 utilizada
escalera estándar pI 3	ProteinSimple	040-646	Para la dilución cIEF 1:60 utilizada
Muestra diluyente	ProteinSimple	040-649
Diluyente de anticuerpos	ProteinSimple	040-309
Lavado concentrado	ProteinSimple	041-108
Recambio de Anolito	ProteinSimple	040-337
Recambio de Catolito	ProteínaSimple	040-338
Peróxido XDR	ProteínaSimple	041-084
Luminol	ProteínaSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Separación de carga capilar (1 paquete) para	ProteinSimple	CBS700
Kit de placa/tapa	de ensayo ProteinSimple	040-663
Peroxidasa-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	Para cIEF utilizado (1: 300)
Peroxidasa-AffiniBurro puro Anti-ratón IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	Para cIEF utilizado (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Señalización de células de anticuerpo primario		9101	Para cIEF utilizado (1: 50)
Pan Erk Señalización	de células	9102	Para cIEF utilizado (1: 100)
Software de brújula	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& nbsp; C-22221	Medio basal de células
endoteliales Medio de crecimiento de células endoteliales MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Suplementación a MV2 por encima
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Factor de crecimiento similar a la insulina
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Kit de ensayo	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Geles	de proteínas Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Tampón de funcionamiento (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Tampón de transferencia (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon Membrana de PVDF	Millipore	IPVH00010
Centrífuga de tubo de microfuga
Adaptador de placa de microtitulación para centrífugas
Pipettors
Consejos
Hielo