Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

Summary

Isoeléctrica capilar es una técnica basada en anticuerpos, ultrasensible, alto rendimiento, permitiendo la caracterización detallada de las proteínas y sus isoformas de muestras biológicas muy pequeñas. A continuación describe un protocolo para la detección y cuantificación de proteínas específicas y sus isoformas de manera automatizada y robotizada.

Abstract

Immunoblotting se ha convertido en una técnica de rutina en muchos laboratorios para la caracterización de proteínas de muestras biológicas. El siguiente protocolo provee una estrategia alternativa, capilar isoeléctrico centrado (cIEF), con muchas ventajas en comparación con el convencional immunoblotting. Se trata de un método basados en anticuerpos, automatizado, rápido y cuantitativo en que efectúe un procedimiento completo de Blot western dentro de un tubo capilar ultrafino. Esta técnica no requiere un gel para transferencia a una membrana, de borrones, ni películas, que son normalmente necesarias para immunoblotting convencional de rayos x. Aquí, las proteínas se separan según su carga (punto isoeléctrico, pI), usando menos un microlitro (400 nL) de lisado de proteínas total. Después de la electroforesis, las proteínas están inmovilizadas en las paredes capilares por tratamiento con luz ultravioleta, seguido por primaria y secundaria (peroxidasa de rábano (HRP) conjugada) incubación de anticuerpos, cuyo enlace se detecta con mayor quimioluminiscencia (ECL), generando una señal luminosa que puede ser capturada y registrada por una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). La imagen digital puede ser analizada y cuantificada (área de pico) utilizando el software. Este procedimiento de alto rendimiento puede manejar 96 muestras a la vez; es muy sensible, con la detección de proteínas en el rango del picogramo; y produce resultados altamente reproducibles debido a la automatización. Todos estos aspectos son extremadamente valiosos cuando la cantidad de muestras (por ejemplo, las muestras de tejido y biopsias) es un factor limitante. La técnica tiene usos más amplios, incluyendo la investigación de fármacos o anticuerpos, descubrimiento de biomarker y propósitos de diagnóstico.

Introduction

Capilar la concentración isoeléctrica (cIEF) es un inmunoanálisis automatizado, basado en el tubo capilar que resuelve proteínas sobre la base de su carga^1,2,3. Es altamente reproducible y capaz de resolver las proteínas y sus isoformas postraduccional modificado rápida y cuantitativamente. Presenta una alternativa a los métodos convencionales como el western blot. Mientras que el western blot es muy bueno para confirmar la presencia de abundantes proteínas en muestras de fácil acceso; variabilidad, consumo de tiempo y precisa cuantificación de todos los presentes desafíos, e....

Protocol

1. la cultura, la estimulación y la lisis de la célula

Nota: Este método puede utilizarse con muchos tipos de células. Para ilustrar el método, se describe un ejemplo usando las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs).

1. Cultura HUVECs en platos de Petri de 10 cm revestido de gelatina, en medio basal de la célula endotelial con la suplementación apropiada (véase Tabla de materiales) y también que contengan 5% FCS, factor de crecimiento epidérmico (5 ng/mL), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF: 0,5 ng/mL), FGF básico (10 ng/mL), factor de crecimiento insulina-like (20 ng/mL), hidrocortisona....

Results

Diseño de un nuevo ensayo: Un diseño de placa de ensayo se muestra en la figura 1A. Máximo, pueden utilizarse 96 pocillos de la placa de 384 pozos en bloques de 12 pozos para cada condición (anticuerpo). Puede comenzar cada bloque de 12 pozos de A1-A12 o A13-A24. Filas de colores permiten distinguir las muestras o los reactivos del uno con el otro. En la plantilla de ensayo (figura 1B), información relevante para.......

Discussion

Sensibilidad y la resolución de las proteínas son cruciales para la investigación proteómica en muestras biológicas. Hay gran valor en ser capaz de detectar proteínas que están presentes en cantidades diminutas en las células. cIEF puede ofrecer mejoras en la sensibilidad y resolución para la detección de proteínas y sus isoformas⁴.

Esta tecnología se ha utilizado con éxito en muchos proteómicos investigación informes^5,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinPremix simple
G2, pH 5– 8 gradientes de separación (anidados), pH 2 y ndash; 4 tapones	ProteinSimple	040-972	Premezcla de anfolitos
Mezcla de inhibidores de DMSO	ProteinSimple	040-510	Inhibidores de la fosfatasa; para dilución cIEF 1:50 utilizada
Mezcla de inhibidores acuosos	ProteinSimple	040-482	Inhibidor de la proteasa; para dilución cIEF 1:25 utilizada
escalera estándar pI 3	ProteinSimple	040-646	Para la dilución cIEF 1:60 utilizada
Muestra diluyente	ProteinSimple	040-649
Diluyente de anticuerpos	ProteinSimple	040-309
Lavado concentrado	ProteinSimple	041-108
Recambio de Anolito	ProteinSimple	040-337
Recambio de Catolito	ProteínaSimple	040-338
Peróxido XDR	ProteínaSimple	041-084
Luminol	ProteínaSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Separación de carga capilar (1 paquete) para	ProteinSimple	CBS700
Kit de placa/tapa	de ensayo ProteinSimple	040-663
Peroxidasa-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	Para cIEF utilizado (1: 300)
Peroxidasa-AffiniBurro puro Anti-ratón IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	Para cIEF utilizado (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Señalización de células de anticuerpo primario		9101	Para cIEF utilizado (1: 50)
Pan Erk Señalización	de células	9102	Para cIEF utilizado (1: 100)
Software de brújula	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& nbsp; C-22221	Medio basal de células
endoteliales Medio de crecimiento de células endoteliales MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Suplementación a MV2 por encima
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Factor de crecimiento similar a la insulina
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Kit de ensayo	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Geles	de proteínas Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Tampón de funcionamiento (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Tampón de transferencia (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon Membrana de PVDF	Millipore	IPVH00010
Centrífuga de tubo de microfuga
Adaptador de placa de microtitulación para centrífugas
Pipettors
Consejos
Hielo