Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.
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Artículo de método
Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes
En este artículo
Resumen
Resumen
Demostrar un método de cuantificación y detección de parásitos en acuoso de glóbulos rojos (gr) mediante un simple Banco atenuada Total reflexión Fourier transforman (ATR-FTIR) Espectrómetro de infrarrojos junto con análisis de datos multivariantes ( MVDA). 3 7 p. falciparum fueron cultivados a los parásitos de etapa 10% parasitemia anillo y utilizado para glóbulos rojos del donante fresco aislado para crear una dilución en serie entre 0 – 1%. 10 μl de cada muestra se colocaron en el centro de la ventana de diamante ATR para adquirir el espectro. Los datos de la muestra fue tratados para mejorar la relación señal a ruido y eliminar el aporte de agua, y luego se aplicó la segunda derivada para resolver características espectrales. Luego se analizaron los datos utilizando dos tipos de MVDA: Análisis de componentes principales el primer (ACP) para determinar cualquier afloramiento y entonces regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R) para construir el modelo de cuantificación.
Introducción
La malaria está entre las enfermedades más devastadoras de nuestro tiempo; más de la mitad de la población vive en situación de riesgo en regiones endémicas y afecta desproporcionadamente los pobres1,2,3,4. Una gran parte del problema es la portadores asintomáticos y pacientes etapa temprana que actúan como reservorios de mosquitos vectores5, provocando picos de infección durante las temporadas húmedas y permitiendo que persisten en las comunidades. La malaria es causada por cinco parásitos Plasmodium , el má....
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Protocolo
Por favor consulte apropiado Material hojas de datos de seguridad (MSDS) y buscan una formación de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los pasos de cultivo deben realizarse en un gabinete BSL-2 utilizando una técnica aséptica, es decir hay un riesgo de exposición a la radiación UV perjudicial de descontaminación, produzcan lesiones accidentales con agujas y posible exposición biológica y la infección si la cultura del parásito entra en cualquier lesión. Además, sangre stock de bancos de sangre sólo defendido por ciertas enfermedades y el potencial para la difusión de enfermedades transmitidas por sangre es un riesgo potencial. Buscar ayuda médica inmediata en la oc....
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Resultados
Trama de cuadrados mínimos parciales (PLS-R) y su vector de regresión asociado, Figura 1a y 1b respectivamente, muestran que la señal de los parásitos son bastante diferentes de los hematíes que pueden ser utilizados para formar una regresión lineal del modelo a utilizar para la predicción de parásitos en futuros conjuntos de datos.
Se generó un modelo de PLS-R robusto, lineal con u.......
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Discusión
Modelo PLS-R es un método multivariante supervisado que encuentra una relación lineal, Y = bX + E, entre las variables predictoras X (aquí, la absorbancia en cada número) y una variable continua Y (aquí, el nivel de parasitemia). En Resumen, el modelo combina las variables en X para crear un nuevo conjunto de variables latentes (LVs) que capturan la varianza en X correlacionada con Y y calcula un vector de regresión (b) que multiplicados por los resultados de un nuevo espectro en la estimación del valor y. La fuerza del .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Financiación para los autores fue proporcionada por el Consejo de investigación australiano (futuro beca FT120100926 a BRW), nacional de salud y Consejo de investigación médica de Australia (programa beca y beca de investigación Senior a JGB; Temprana carrera becas JSR; Infraestructura para la investigación institutos de apoyo plan beca para el Instituto de Burnet), y la infraestructura operacional del gobierno victoriano estado beca para el Instituto de Burnet. Reconocemos el Sr. Finlay Shanks para apoyo instrumental.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sangre del donante | : | debe ser recolectada por un médico capacitado | |
| Sangre de reserva Cruz | Roja Australiana' | - | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | El Instituto Burnet-Laboratorio | cepa de tipo salvaje equivalente | |
| RPMI-1640 medios con L-hepes sin bicarbonato de sodio | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot en tubos de halcón de 50 mL y almacenar en el congelador |
| Bicarbonato de sodio | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Debe filtrarse antes de su uso en cultivo |
| Tubos de extracción de sangre (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Aceite de inmersión | Thermofisher | M3004 | |
| Placas de cultivo de 50 mL Puntas | Falcon | 353025 | |
| 25mL Puntas | Falcon | 357515 | |
| 10mL | Falcon | 357530 | |
| Portaobjetos de microscopio | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Tubos de centrífuga 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Controlador de pipetas automatizado | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Centrífuga Sorvall Legend X1R | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Incubadoras de CO2 de calor directo | Thermofisher | 310TS | |
| Microscopio binocular Nikon Eclipse E-100 | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | Al comprar, asegúrese de que la lente 100x sea un aceite lente de inmersión |
| Bruker Alpha Ft-IR Espectrómetro con ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Asegúrese de solicitar el accesorio "Eco-ATR" al comprar |
| software de análisis de datos multivariante | Matlab | Mathworks Inc | |
| datos multivariante | Unscrambler X | CAMO | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | Interfaz gráfica de usuario para Matlab |
Referencias
- Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).
- World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W. Chapter 105. Manual....
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Reimpresiones y permisos
