Procedimientos de fabricación y medidas de birrefringencia para diseñar Ion lantánido magnéticamente sensibles quelantes ensamblajes de fosfolípidos

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Procedimientos de fabricación y medidas de birrefringencia para diseñar Ion lantánido magnéticamente sensibles quelantes ensamblajes de fosfolípidos

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DOI:

10.3791/56812

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3 de enero de 2018

Stéphane Isabettini¹ , Mirjam E. Baumgartner¹ , Peter Fischer¹ , Erich J. Windhab¹ , Marianne Liebi² , Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

En este artículo

Resumen

Se presentan procedimientos de fabricación para el ion lantánido altamente magnéticamente sensibles quelantes conjuntos polimoleculares. La respuesta magnética se basa en el tamaño de la Asamblea, que se adapta por extrusión a través de membranas nanopore. Las Asambleas alignability magnética y los cambios estructurales inducidos por la temperatura son monitoreados por las mediciones de birrefringencia, una técnica gratuito para resonancia magnética nuclear y dispersión de neutrones de ángulo pequeño.

Resumen

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco ajustables formados de una gran variedad de mezclas de lípidos. Las aplicaciones van desde estudios estructurales de proteínas de membrana por resonancia magnética nuclear (RMN) a desarrollos nanotecnológicos incluyendo la formación de geles ópticamente activos y magnéticamente conmutables. Estas tecnologías requieren un control alto del tamaño de la Asamblea, respuesta magnética y resistencia térmica. Mezclas de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfocolina (DMPC) y sus iones lantánidos (Ln^{3 +}) quelante conjugado de fosfolípidos, 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfo-etanolamina-dietilenglicol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), montar en conjuntos altamente magnéticamente sensibles tales como DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) bicelles. Introducción de colesterol (Chol-OH) y derivados esteroides en la bicapa resulta en otro conjunto de ensamblados que ofrece propiedades fisico-químicas únicas. Para una composición de lípidos determinado, la alignability magnética es proporcional al tamaño del bicelle. La complejación de Ln^{3 +} resulta en respuestas magnéticas sin precedentes en términos de magnitud y alineación de dirección. El colapso de la termo-reversible del disco-como las estructuras en vesículas al calentarse permite adaptación de dimensiones de las asambleas por extrusión a través de filtros de membrana con tamaño de poro definido. Las bicelles magnética alignable se regeneran por refrigeración a 5 ° C, resultando en conjunto las dimensiones definidas por los precursores de la vesícula. En este documento, se explica este procedimiento de fabricación y el alignability magnético de las Asambleas se cuantifica por mediciones de birrefringencia bajo un campo de magnético 5.5 T. La señal de la birrefringencia, procedente de la bicapa de fosfolípidos, además permite la monitorización de polimoleculares cambios que ocurren en la bicapa. Esta técnica simple es complementaria a los experimentos de NMR que comúnmente se emplean para caracterizar bicelles.

Introducción

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco como de numerosas mezclas de lípidos. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ son ampliamente utilizados para la caracterización estructural de biomoléculas de membrana por espectroscopia de RMN. ⁶ ^, ⁷ sin embargo, los esfuerzos recientes tienen por objeto ampliar el campo de posibles aplicaciones. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ el sistema de bicelle más estudiado se compone de una mezcla de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfocolina (DMPC), constituyendo la parte plana de la Asamblea y 1, 2-dihexanoyl -sn- glycero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolípido que cubre el borde. ¹ ^, ² ^, ³ la geometría molecular de las composición de la bicapa de fosfolípidos determinan la arquitectura de la estructura de uno mismo-montado polimoleculares. ⁴ ^, ⁵ reemplazo de DHPC con DTPA DMPE genera sistemas de bicelle altamente magnético sensible y armonioso. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) bicelles asociado con muchos más iones lantánidos paramagnéticos (Ln^{3 +}) en la superficie de la bicapa, resultando en una mayor respuesta magnética. ¹⁰ por otra parte, reemplazando las moléculas solubles en agua de DHPC con^{3 +} permite DMPE-DTPA/Ln la formación de bicelles resistente a la dilución. ¹¹

Su energía magnética en general, obedece a la alignability magnética de conjuntos polimoleculares planar

figure-introduction-1 (1)

donde B es la fuerza del campo magnético, figure-introduction-2 el magnético n constante, el número de agregación y figure-introduction-3 la anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular de las composición de la bicapa de lípidos. Por lo tanto, la respuesta de DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles a los campos magnéticos se adapta por su tamaño (número n total) y el Δχ de anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular. Este último se obtiene fácilmente cambiando la naturaleza de los quelatos Ln^{3 +}. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ introducción colesterol (Chol-OH) u otros derivados esteroides en la bicapa ofrece la posibilidad de templar el agregado número n y la Δχ de la susceptibilidad magnética de las Asambleas. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ para una composición de lípidos determinado, asambleas más grandes contienen más lípidos capaces de contribuir a la E_mag (n número total más grande), dando lugar a especies más alignable. Por ejemplo, el tamaño de bicelles DMPC/DHPC, convencionalmente se controla a través de la optimización de la concentración de lípidos en relación o total composición. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² aunque esto es posible en DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, su transformación termo-reversible de bicelle vesículas sobre la calefacción ofrece había añadido opciones de adaptación. Mecánica: por ejemplo la extrusión a través de filtros de membrana permite la formación de las vesículas. Las bicelles magnética alignable se regeneran en refrigeración a 5 ° C y sus dimensiones son dictadas a partir de los precursores de la vesícula. ¹¹ adjunto, nos centramos en el potencial de los procedimientos de fabricación mecánica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) como sistemas de referencia. El proceso funciona de manera análoga cuando se trabaja con otros Ln^{3 +} que Tm^{3 +}. La amplia gama de posibilidades que ofrecen estas técnicas se destaca en la figura 1 y ampliamente discutido en otros lugares. ²³

figure-introduction-4
Figura 1: Descripción esquemática de los procedimientos de fabricación posible. Las estudiadas magnéticamente alignable Ln^{3 +} quelantes polimoleculares asambleas están compuestas de cualquier DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5). La película lipídica seca se hidrata con un 50 mM de tampón fosfato a un pH de 7.4 y la concentración total de lípidos es 15 mM. Una hidratación eficaz de la película de lípidos requiere ya sea congelación descongelación ciclos (FT), o calefacción y ciclos de refrigeración (H & C). H & C ciclos son necesarios para la regeneración de las muestras después de la última helada descongelación paso o regenerar muestras mantuvo congeladas durante un período prolongado de tiempo si han de usarse sin más la protuberancia. Estos pasos se discuten extensivamente por Isabettini et al. Se consiguen ²³ polimoleculares máximo alignable asambleas, ofrecer arquitecturas ensamblado diferente basadas en la composición de lípido. El tamaño de la bicelle y la alignability magnética es sintonizable por extrusión (Ext) a través de filtros de membrana nanopore. La alineación presentada factores A_f se computaron a partir de patrones de dispersión (SANS) 2D ángulo pequeño neutrón de una DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) muestra que se saca a través de 800, 400, 200 o 100 nm poros. SANS las mediciones son un medio complementario de cuantificación de la alineación de bicelle que no se tratarán más detalladamente en este documento. ¹¹ ^, ¹⁶ el_f oscila entre -1 (dispersión de neutrones paralelo o alineación perpendicular de la bicelles con respecto a la dirección del campo magnético) a 0 para dispersión isotrópica.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La estructura del bicelles ha sido extensamente estudiada por una amplia gama de técnicas de caracterización. ¹³ la alineación de bicelles expuestas a un campo magnético se ha cuantificado mediante espectroscopia RMN o ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) de experimentos. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ sin embargo, el cambio y ensanchamiento de los picos de NMR que ocurre en presencia de Ln^{3 +} son serias limitaciones al método. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ aunque SANS experimentos no sufren de esta limitación, alternativa y técnicas más accesibles son deseables para la cuantificación rutinaria de alineación magnéticamente inducida de asambleas en la solución. Medidas de birrefringencia son una alternativa viable y relativamente simple. Análogamente a los experimentos de NMR, mediciones de birrefringencia revelan información valiosa sobre los cambios de lípidos y lípidos fases que ocurren en la bicapa. Por otra parte, transformaciones geométricas que se producen en el conjunto polimoleculares con cambio de condiciones ambientales como la temperatura se controlan. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ Δn′ de birrefringencia inducida magnéticamente se ha utilizado para estudiar varios tipos de sistemas de fosfolípido. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ medidas de birrefringencia basadas en la técnica de modulación de fase en un campo magnético es un método viable para detectar orientación de bicelles. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² la posibilidad de investigar bicelles con birrefringencia en altos campos magnéticos de hasta 35 T también fue demostrada por M. Liebi et al. ¹³

Cuando la luz polarizada entre un material anisotrópico, se refracta en una onda ordinaria y extraordinaria. ¹¹ las dos ondas tienen diferentes velocidades y se cambia de puesto en fase por una δ de retraso. El grado de retardo δ es medido y convertido en una señal de birrefringencia figure-introduction-5 para cuantificar el grado de anisotropía en el material

figure-introduction-6 (2)

donde λ es la longitud de onda del láser y d es el espesor de la muestra. Los fosfolípidos son ópticamente anisotropic y su eje óptico coincide con sus ejes moleculares largo, paralelos a la cola de hidrocarburo. ¹¹ ^, ¹² ningún retraso se mide si los fosfolípidos están orientados aleatoriamente en solución. Retraso se mide cuando los fosfolípidos están alineados paralelos uno al otro. La birrefringencia inducida magnéticamente figure-introduction-7 puede tener un signo positivo o negativo dependiendo de la orientación de las moléculas en el campo magnético; Vea la figura 2. Los fosfolípidos alineados paralelos al eje x dará como resultado un negativo figure-introduction-8 , mientras que ésos alineados a lo largo del eje z como resultado positivo figure-introduction-9 . Birrefringencia no se observa cuando el eje óptico coincide con la dirección de propagación de la luz como el fosfolípido alinea paralelo al eje y.

figure-introduction-10
Figura 2: Alineación de los fosfolípidos y el signo correspondiente de la birrefringencia inducida magnéticamente figure-introduction-11 . El signo de la medida figure-introduction-12 depende de la orientación de los fosfolípidos en el campo magnético. Las líneas punteadas indican el eje óptico de la molécula. La luz está polarizada a 45° y se propaga en la dirección y. El campo magnético B es en la dirección z. Esta figura ha sido modificada de M. Liebi. ¹¹ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de una suspensión coloidal isotrópica de bicelles, la orientación inducida por el arreglo de los fosfolípidos en la bicapa se perderá, poner a cero el δ de retraso. La bicelles también debe quedar alineada con el fin de orientar los fosfolípidos ópticamente activos en sus bicapas, causando una retraso δ de la luz polarizada. En consecuencia, la birrefringencia es una herramienta sensible para cuantificar la alignability magnética de conjuntos polimoleculares. Bicelles alineado perpendicularmente al campo magnético producirá un positivo figure-introduction-13 , mientras que ésos alineados paralelos dará una negativa figure-introduction-14 . El signo depende de la alineación de la instalación y se puede verificar con una muestra de referencia.

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Protocolo

1. procedimiento fabricación de DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) y DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) conjuntos polimoleculares

Preparaciones preliminares
1. Lave toda la cristalería por lavado una vez con etanol estabilizado cloroformo (> 99% cloroformo) y seque con aire comprimido.
2. Producir 2 distintas 10 mg/mL soluciones de DMPC y DMPE-DTPA en cloroformo estabilizado con etanol (> cloroformo 99%), una solución stock de 10 mM de Chol-OH en cloroformo estabilizado con etanol (> cloroformo 99%) y una solución 10 mM de TmCl₃ en metanol.
3. Preparar un 50 mM de tampón fosfato a un pH de 7.4 mezclando 0,121 g de Sodio dihidrogenofosfato dihidrato y 0,599 g de di-sodio anhidro fosfato de hidrógeno en 100 mL de alta pureza de H₂O.
Preparación de la película seca de lípidos
1. Pesar las cantidades necesarias de Anfífilos (DMPC DMPE-DTPA y opcionalmente Chol-OH) y Ln^{3 +} las soluciones madre en snap-tazas de cristal separado 3 mL con una jeringa de vidrio de 2,5 mL.
  1. Para un volumen de muestra de 3 mL de DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (proporción molar de 4:1:1, concentración total de lípidos de 15 mM), peso de 3,6435 g de la solución madre de DMPC, 1,4731 g de la solución madre DMPE-DTPA y 0,7126 g de la solución madre TmCl₃ .
  2. Para un volumen de muestra de 3 mL de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (16:4:5:5 de fracción molar, concentración total de lípidos de 15 mM), peso de 2,9148 g de la solución madre de DMPC, 1,4731 g de la solución madre DMPE-DTPA, 1,0749 g de solución madre Chol-OH y 0,7126 g de la TmCl₃ solución.
    PRECAUCIÓN: Cloroformo y metanol son tóxicos y son volátiles a temperatura ambiente. Trabajar bajo una campana de humos y continuar rápidamente con las mediciones de masa.
2. Transferir el contenido de las tazas de complemento a un 25 mL redondo matraz de fondo. Lave cada copa del broche de presión en el matraz de fondo redondo con alrededor de 2,5 mL del disolvente correspondiente.
3. Eliminar el disolvente al vacío en un evaporador rotatorio a 40 ° C. Ajuste la presión inicial a de 30 000 Pa hasta que se elimine la mayor parte del solvente. Reducir la presión de 100 Pa y secar la muestra en rotación durante un mínimo de 2 h. obtención una película uniforme seco lípidos en las paredes de vidrio del frasco.
4. Coloque la película lipídica seco durante 1 minuto en una corriente de argón para evitar la oxidación lipídica en aire y almacenar la muestra en el congelador antes de rehidratación constante.
Hidratación de la película seca de lípidos
1. Añadir 3 mL de tampón fosfato al matraz de fondo redondo para alcanzar una concentración total de lípidos de 15 mM.
2. Llevar a cabo un ciclo hielo-deshielo de (FT) hundiendo el matraz bajo rotación en nitrógeno líquido hasta que está completamente congelado (las paradas de nitrógeno líquido hirviendo), luego calentar hasta 60 ° C de nuevo colocando la muestra durante 5 min en un baño de agua, girando el frasco continuamente a ayuda el proceso de fusión. Aplicar 30 s de Vortex antes de cada ciclo de congelamiento cuando la muestra es líquida para facilitar la hidratación de la película de lípidos.
  Nota: Ninguna película de lípidos debe ser visible en las paredes del frasco después de la segunda congelación ciclo de descongelación.
3. Repita 1.3.2 un total de cinco veces. Cerrar el frasco con una tapa para evitar la evaporación innecesaria del buffer fosfato cuando la muestra está caliente. El protocolo puede pausarse cuando la muestra es congelada.
4. Proceder a dos de calefacción y refrigeración (H & C) ciclos para estabilizar la muestra saliendo de la última etapa de congelación, o mantener congelado hasta por dos meses. Calentar la muestra a 40 o 60 ° C para DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5), respectivamente, antes de la refrigeración a 5 ° C a 1 ° C/min mantener la muestra 5 minutos en máximo y mínimo temperaturas del ciclo.
5. Ahora, ya sea determinar la señal de la birrefringencia de la muestra en un campo magnético externo (paso 2) o más, sacar la muestra para ajustar las dimensiones de bicelle y alignability magnética (paso 1.4).
  Nota: DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) las muestras se componen principalmente de bicelles con un diámetro hidrodinámico medio D_H de 70 nm según lo revelado por una distribución de números obtenidos de mediciones de la dispersión ligera dinámica (DLS) a 5 ° C. Estas muestras también contienen grandes conjuntos polimoleculares con una media D_H de 500 nm según lo revelado por una distribución de intensidad. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) las muestras son muy polidispersas en tamaño con las distribuciones de intensidad típica revelando una media D_H de 700 nm, mientras que las distribuciones número revelan una población dominada por pequeños bicelles en el rango de tamaño de 200 nm. Más detallado de las distribuciones de tamaño y crio imágenes de microscopia electrónica de transmisión de estas muestras han sido reportados por Isabettini et al. ²³
Extrusión de los conjuntos polimoleculares.
1. Montar la extrusora como se muestra en la figura 3. Utilizar guantes y pinzas con tubos de silicona para la manipulación de protección. Moje el papel de filtro (5) con unas gotas de buffer para permitir una óptima colocación del filtro de membrana (6). Asegúrese de que el papel no tiene pliegues después de colocar la junta tórica (7) en la parte superior.
  Nota: El proceso de extrusión se probó en los filtros de membrana (6) con un diámetro de poro de 800, 400, 200 y 100 nm; Vea la figura 7.
2. Ajuste el baño de agua a 40 ° C para DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) muestras o 60 ° C para DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) las muestras garantizar la formación de vesículas de extrusión.
3. Conecte el extrusor a una botella de nitrógeno a presión utilizando un tubo de PVC de alta presión (> 4 MPa) equipados con adaptadores de serto y extrudir el material líquido a través de la membrana. 1 MPa de presión se requiere para la protuberancia a través de filtros de membrana (6) con un diámetro de poros de 200 nm y superiores. 1.5-2.5 MPa son necesarios para los más pequeños filtros de membrana (6) con un diámetro de poro de 100 nm.
  Nota: Cambiar el filtro de membrana si anormalmente altas presiones (> 2,5 MPa) se necesitan para sacar la muestra (este es el primer signo de obstrucción).
4. Abrir la tapa (10) e introducir la muestra con una pipeta de vidrio de 2 mL. Luego cierre la tapa (10) y abra la válvula de presión (12) mientras sujeta el tubo de salida de muestra (2). Cierre la válvula de presión (12) después de completa el ciclo de extrusión, de ventilación y continuar con el siguiente ciclo.
  Nota: No deje la muestra en contacto mucho tiempo con el recipiente encamisado caliente (8) para evitar la pérdida excesiva de la muestra por evaporación.

30-60 s es bastante tiempo para una muestra de 3 mL se equilibren en la extrusora antes de abrir la válvula de presión (12).

Proceder a 10 ciclos de extrusión para una dimensión de poro de membrana dado como se muestra en la figura 3. La mayoría de los sistemas bicelle se saca 10 veces a través de membranas con un diámetro de poro de 200 y otros 10 veces a través de membranas con poros de diámetro de 100 nm, garantizando la comparabilidad de la muestra.

Ahora, determinar la señal de la birrefringencia de la muestra en un campo magnético externo (paso 2).

figure-protocol-1
Figura 3: extrusora de laboratorio utilizado para preparaciones bicelle y vesícula. La extrusora está montada desde la parte inferior hacia arriba: (1) soporte, (2) muestra que recoge el espacio con un tubo de plástico salida de 2,4 mm (diámetro interno) y junta tórica (3) y malla estabilizadora (4) grande y pequeña, (5) papel de filtro, filtros de membrana (6), (7) junta tórica, recipiente (8) encamisado, (9. ) cubierta con cubierta (10), tornillos de mariposa (11), conexión de entrada y la presión, válvula de presión (12) superior. Se muestra un bosquejo de la extrusora montado de la mano derecha. El nitrógeno gaseoso (N₂) es suministrada por un recipiente a presión y el recipiente encamisado (9) está conectado a un baño de agua para control de temperatura. La muestra somete a 10 ciclos de extrusión para cualquier diámetro de poro de filtro de membrana dada (ruta muestra en azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. medidas birrefringencia de DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) y DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) conjuntos polimoleculares.

Construir y conectar la instalación de birrefringencia como presentado en la figura 4 y suministrar energía a los elementos electrónicos respectivos. No coloque el PEM, la muestra y el segundo polarizador en la trayectoria del laser en este momento. Evitar la detección de luz láser dispersada detrás cubriendo superficies reflectantes, por ejemplo aluminio espejo titulares, con papel negro.
Ajustar los espejos para maximizar la intensidad del láser en el detector, que está representada por la intensidad de la corriente directa obtiene el filtro de paso bajo en la Figura 4B.
PRECAUCIÓN: Use protección apropiada al ajustar los espejos y consulte con un instructor de seguridad de láser si manipulando láser por primera vez.
Gire el primer polarizador lineal cruzado (mantenido perpendicular al haz láser incidente) para maximizar la .

figure-protocol-4
Figura 4: representación esquemática de la configuración de birrefringencia y conexiones de las señales ópticas. A) un electroimán superconductor provee un campo de magnético T 5.5. La luz de un láser diodo de 635 nm está polarizada por dos polarizadores cruzados. Un modulador Fotoelásticos PEM-90 funciona a 50 KHz con una amplitud₀ de 2,405 rad y colocado entre los dos polarizadores. La muestra se encuentra en el imán entre el PEM y el segundo polarizador. Espejos de polarización no dirigir la luz a través de los diferentes elementos y es finalmente detectado por un fotodetector. El primer y segundo armónico figure-protocol-5 y figure-protocol-6 de la señal de AC son monitoreados, permitiendo el cálculo de la señal de birrefringencia dando información sobre la alignability magnética del Ln^{3 +} quelantes conjuntos polimoleculares. La cubeta de muestra está conectada a un baño de agua externo para control de temperatura (azul). Se controla la temperatura de la muestra con una sonda de temperatura (rojo). B) la señal del fotodetector se alimenta en un segundo filtro de paso bajo orden de Sallen-Key (fuente de alimentación de 24 V CA) con una frecuencia de 360 Hz corte a través de ±12 V DC braded cable de alimentación (3). El filtro de paso bajo extrae el componente de la C.C. figure-protocol-7 y lo entrega a la interfaz de PC (4) a través de cable BNC 50 Ω. La señal del fotodetector se entrega a los dos amplificadores lock-in (que extrae el primer y segundo armónico figure-protocol-8 y figure-protocol-9 ) a través de un cable BNC 50 de Ω (1) & (2). Las intensidades armónicas son detectadas por un sensible a la fase de detección. En consecuencia, la señal PEM se utiliza como señal de referencia para los amplificadores lock-in (1f-salida del PEM en el primer amplificador lock-in y salida 2f en el segundo, conectado con BNC 50 cables Ω). Las señales de salida se entregan a la unidad de interfaz de la PC a través de cables de BNC 50 Ω. Adquisición analógica unidades PPC-AI-110 y PPC-CB-1 digitalizar la señal que se transfiere a la computadora mediante un cable RS 232 para el control. La sonda de temperatura tipo K también está conectada a la unidad de interfaz de la PC donde adquisición analógica unidades PPC-CB-3 y cFP-TC-120 digitaliza la señal antes de transferir a la computadora mediante un cable RS 232 para el control. C) la imagen de la configuración esquemática en elementos claves de B. se identifican con números correspondientes del 1 al 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Coloque el segundo polarizador lineal cruzado perpendicular al haz láser incidente, como se muestra en la Figura 4A. Minimizar la , colocando el segundo polarizador en un ángulo de 90° con respecto a la primera.
Lugar el modulador Fotoelásticos (PEM) en 0° entre los dos polarizadores lineales cruzados y perpendiculares al haz láser incidente tal como se muestra en la Figura 4A. Ajustar el PEM a una frecuencia de 50 kHz y amplitud A0 a 2,405 rad como se muestra en la figura 5A. Esto hace que la componente de CC independiente de birrefringencia y aumenta la .
Nota: El eje óptico del PEM puede ajustarse por unos pocos grados para mantener una constante en el aire antes de medir cualquier muestra.
Espere 1 hora después de encender el láser y equipos electrónicos para estabilizar la señal.

La señal es estable una vez que la eliminación automática de los amplificadores lock-in se mantiene constante.

Colocar la muestra en una cubeta de cuarzo de temperatura controlada con una longitud de ruta de acceso de 10 mm y conectarse a un baño de agua externo establecido inicialmente a 5 ° C.

Coloque un termopar de tipo grueso K de 0,5 mm (sonda de temperatura) directamente en la muestra a controlar la temperatura de la muestra. Verificar que la sonda no interfiera con la luz del láser colocando un papel blanco en la trayectoria del laser (después de la cubeta) y buscando las sombras causadas por la sonda.
Nota: Hay una diferencia de 2-3 ° C entre el registro de la temperatura de la bañera de agua y la temperatura de la muestra.

Coloque la cubeta en el agujero del imán, como se muestra en la Figura 4A. La luz láser se propaga horizontalmente a través de la muestra, es desviada por los espejos no polarizante y detectada por un fotodetector.
Nota: El láser es dirigido hacia abajo, a través de la muestra y volver por el mismo camino para tener en cuenta para efectos de Faraday (es decir, la rotación del plano de polarización de la luz causada por el campo magnético cuando bajando se cancela al regreso hacia fuera en la dirección opuesta).

Aplique un flujo de aire constante de aire comprimido a temperatura ambiente y 10000 Pa en la cubeta para evitar la condensación de agua en las paredes celulares, lo que reduciría la intensidad de la señal y aumentar el ruido. Esto es especialmente importante cuando se mide a 5 ° C.

Detectar el primer y segundo armónico figure-protocol-13

de la señal de AC con dos amplificadores lock-in. Auto fase los amplificadores lock-in con la tecla (2) se muestra en la figura 5B y ajustar la sensibilidad como se muestra en la figura 5B (1). Asegúrese de que no hay más de cuatro barras rojas en los amplificadores como se muestra en la figura 5B (3) para evitar la sobrecarga de la señal. Anotar la sensibilidad propia de ambos amplificadores lock-in en el programa Tesla_Magnet_Const_V092 como se muestra en la figura 5 (8). El programa se ofrece como información complementaria.

Rampa el campo magnético hasta 5.5 T mediante el suministro de corriente el imán a través del programa Tesla_Magnet_Const_V092 como se muestra en la figura 5 (5).

Obtener la birrefringencia figure-protocol-15

usando la ecuación 2, donde se calcula el retraso con
figure-protocol-16

(3)
donde

son funciones de Bessel de primera clase, con figure-protocol-19

. ¹¹ ^, ¹³ ^, ¹⁸ ^, ³³ ^, ³⁴ parcela el retraso en el programa Tesla_Magnet_Const_V092, como se muestra en la figura 5 (4).
Nota: El retraso del programa no debería utilizarse para calcular la señal de birrefringencia si no funcionan los dos amplificadores lock-in en la misma sensibilidad (ver paso 2.12). Las intensidades armónicas registradas figure-protocol-21

tiene que ser multiplicado por la sensibilidad de los amplificadores lock-in para obtener las dimensiones correctas. Por otra parte, la señal de birrefringencia medida bajo un campo de imán debe normalizarse al restar la señal de birrefringencia media obtenida en T. 0

Controlar señal de birrefringencia de la muestra en constante o el cambio de temperatura (1 ° C/min) mediante la regulación de la temperatura de la bañera de agua conectada a la cubeta que se muestra en la figura 4.

Registrar los datos experimentales de relleno en la descripción experimental de la figura 5 (8), proporcionando un nombre de archivo (9) y presionando el botón de "START log" (10).

figure-protocol-23
Figura 5: las ilustraciones de la propia configuración y programa imágenes. A) configuración de PEM: retraso 2,405 rad, longitud de onda 635 nm, frecuencia 50 Hz. White círculos indican qué ajustes para activarse (USR = retraso definido por el usuario, LOC = local modo de operación). B) configuraciones del amplificador Lock-in. La sensibilidad (1) debe seleccionarse antes de cada medición como se requiere en paso 2.11. No debe haber más de cuatro barras rojas en la pantalla (3) para evitar una sobrecarga de la señal. Se produce una sobrecarga cuando el led (1) rojo se enciende, haciendo imposible una medición. Presione el botón de la fase de auto (2) antes de cada medición. C) imágenes del programa Tesla_Magnet_Const_V092 como información complementaria. El programa permite la grabación de todo la señal de salida en función del tiempo y control del campo magnético. La fuerza del campo magnético y la temperatura de la muestra se trazan en (1). El primer y segundo armónico figure-protocol-24 y figure-protocol-25 de la señal AC medida por los dos amplificadores lock-in se trazan en (2). La intensidad de la corriente directa figure-protocol-26 se traza en (3). El retraso se calcula como se describe en el paso 2.13 y traza en (4). La fuerza del campo magnético se encuentra en (5). La medida directa de la temperatura registrada por el termopar tipo K se presenta en (6) y las señales de salida ( figure-protocol-27 y figure-protocol-28 ) en (7). Información adicional de la muestra puede introducirse en (8) como la sensibilidad propia de los amplificadores, nombre de la muestra, etcetera. Los datos pueden iniciar sesión y exportados a un archivo .txt en (9). Iniciar y detener la adquisición de datos con el botón de "START log" (10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

La señal de la birrefringencia de una no sacó DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) muestra fue supervisada en un campo de magnético 5.5 T durante un calentamiento y enfriamiento ciclo de 5 a 40 ° C y a una velocidad de 1 ° C/min (figura 6). Los resultados de birrefringencia confirman alineaciones magnéticas alta a 5 ° C con un valor de 1.5 x 10^-5, dos veces tan fuerte en cuanto a los sistemas de extrusión divulgados.

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Discusión

Un relato detallado de cómo las mediciones de la birrefringencia se usaron en combinación con SANS experimentos para evaluar los métodos de generación altamente magnéticamente sensibles Ln^{3 +}quelantes fosfolípidos asambleas es de Isabettini et al. ²³ los protocolos de fabricación propuesto también son aplicables para asambleas compuestas de los fosfolípidos más de DPPC y DPPE-DTPA o para aquellos que contienen derivados esteroides químicamente modificados en su bicapa.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen la Swiss National Science Foundation para la financiación de SMhardBi (proyecto número 200021_150088/1). Se realizaron los experimentos SANS en la fuente de neutrón del spallation suizo SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Suiza. Los autores agradecen con gusto el Dr. Joachim Kohlbrecher para su dirección con los experimentos SANS. La configuración de medida de birrefringencia bajo campos magnéticos altos se inspiró de la configuración existente en el laboratorio magnético de alto campo HFML, Nijmegen, Países Bajos. Agradecemos a Bruno Pfister por su ayuda en el desarrollo de la electrónica de la configuración de la birrefringencia, Jan Corsano y Daniel Kiechl para la construcción de los marcos que fina y fácil alineación del láser y Dr. Bernhard Koller para apoyo técnico continuo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-dimiristoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)	Avanti Lípidos Polares	850345P	>99%
1,2-dimiristoyl-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina-dietilenopentaacetato sal de hexammonio ácido (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Cloruro de tulio (III)	Sigma-Aldrich 439649		anhidro, polvo, 99,9% base de metales traza
Cloruro de disprosio (III)	Sigma-Aldrich	325546	anhidro, polvo, base de metales traza 99,9%
Cloruro de iterbio (III)	Sigma-Aldrich	439614	anhidro, polvo, base de metales traza 99,9%
Cloroformo	Sigma-Aldrich	319988	contiene etanol como estabilizador, reactivo ACS, ≥ 99.8%
Metanol	Sigma-Aldrich	34860	≥ 99,9%
Colesterol	Amresco	433	D2O de grado ultrapuro
	ARMAR chemicals	1410	99,8 átomo % D
Agua ultrapura	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
medidor de pH electrónico	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm filtro de membrana	VWR	515-2028
Filtro de membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm filtro de membrana	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm filtro de membrana	VWR	515-2032
Whatmann Papel de filtro	VWR	230600
Matraz de fondo redondo de 25 ml	VWR	201-1352	14/23 NS
Vaso de vidrio de 3 ml	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
Jeringa de vidrio de 2,5 ml	Hamilton
Dihidrógeno de sodio fosfato dihidratado	Merk	1.06342	Sal utilizada para hacer tampón de fosfato
di-Fosfato de hidrógeno de sodio	Merk	1.06586	Sal utilizada para hacer tampón de fosfato
Carbagas	de nitrógeno líquido	-
Gas nitrógeno presurizado	Carbagas-Botella	de	200 bar
Extrusora de lípidos 10 ml	Lipex-Totalmente		equipado con termobarril
Tubo de PVC de alta presión	GR NETUM-debe		resistir más de 4 MPa
Adaptadores Serto Sertot-Guantes
nitrilo	VWR-2
ml pipetas de vidrio	VWR	612-1702 Láser de	230 mm de largo
	Newport	LPM635-25C
DSP Amplificador de bloqueo bifásico	SRS	SRS SR830
Detector de fotodiodos	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicio, fotoconductor
5.5 T Criogénico Magnético Criogénico	/Oerlikon AG-12		bar He-enfriado. Compresor RW4000/6000, cabezal criogénico RGD 5/100 TA Filtro de
paso bajo de segundo orden	de		alimentación lineal 24 V CC, segundo orden, llave Sallen, frecuencia de corte 360 Hz, +/- 12 V, máx. 10 mA
Modulador fotoelástico	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Polarizador de calcita	Newport	10GT04	25,4 mm de diámetro
	Hellma	165-10-40	Célula con control de temperatura, 0,8 ml, longitud de paso de 10 mm
Sonda de temperatura		Thermocontrol-Tipo	K, 0,5 mm de diámetro, Thermocoax
Espejos no polarizantes	Newport	50326-1002	de 25,4 mm
	National Instruments	189284-02	Para conectar al puerto RS-232 en la parte frontal de los controladores FieldPoint compactos
BNC 50 y Omega; Cables y conectores	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	Módulo de entrada analógico de voltaje y corriente de 8 canales para FieldPoint compacto
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01 Bloque de	conectores integrado para cableado para E/S compactas de FieldPoint
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Bloque de conectores isotérmicos integrado para cablear termopares al módulo cFP-TC-120
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120 Módulo de	entrada de termopar de 8 canales para FieldPoint compacto
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Interfaz Ethernet/Serial para NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National	Instruments-Potencia
industrial suministro	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Baño de agua	Julabo	FP40-HE	Circulador refrigerado/calefactor

de diodo de Fuente Cubeta de muestras de cuarzo de Cables RS 232

Referencias

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