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Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

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DOI:

10.3791/56820

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21 de diciembre de 2017

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1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Resumen

Traducción de mRNA en las proteínas es un proceso complejo que involucra varias capas de regulación. A menudo se asume que cambios en la transcripción del mRNA reflejan cambios en la síntesis de proteínas, pero se han observado muchas excepciones. Recientemente, una técnica llamada ribosoma perfiles (o Ribo-Seq) ha surgido como un método eficaz que permite la identificación, con gran precisión, que las regiones de ARNm se traducen en proteínas y cuantificación de la traducción a nivel de todo el genoma. Aquí, presentamos un protocolo generalizado para la cuantificación del genoma de la traducción con Ribo-Seq en levadura de florecimiento. Además, combinando datos de Ribo-Seq con mediciones de abundancia de ARNm permite al mismo tiempo cuantificar la eficiencia de la traducción de miles de transcripciones del mRNA en la misma muestra y comparar cambios en estos parámetros en respuesta a experimental manipulaciones o en los diferentes Estados fisiológicos. Se describe un protocolo detallado para la generación de huellas de ribosoma mediante digestión de nucleasa, aislamiento de complejos ribosoma-huella intacta vía fraccionamiento gradiente de sacarosa y la preparación de las bibliotecas de ADN para secuenciación profunda junto con el apropiado controles de calidad necesarios para asegurar un análisis preciso de la traducción en vivo .

Introducción

traducción del mRNA es uno de los procesos fundamentales en la célula, que desempeña un papel importante en la regulación de la expresión de la proteína. Por lo tanto, traducción del mRNA es firmemente controlada en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos internos y externos 1,2. Sin embargo, los mecanismos de regulación traduccional siendo estudiados. Aquí, describimos el protocolo para la cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por ribosome profiling. El objetivo general de la técnica de generación de perfiles de ribosoma es estudiar y cuantificar la traducción de mRNAs específicos bajo condiciones celulares diferentes. Esta técnica utiliza la secuenciación de próxima generación para analizar cuantitativamente la ocupación del ribosoma a lo largo del genoma y permite el control de la tasa de proteína síntesis en vivo en el codón solo resolución 3,4. Actualmente, este método proporciona los medios más avanzados de medición de los niveles de la traducción de la proteína y ha demostrado para ser una herramienta de descubrimiento útil proporcionar información que no puede ser revelado por otras técnicas actualmente disponibles, por ejemplo a microarrays o traducción en estado matriz análisis (TSAA) 5. Como perfiles de informes sobre los cambios combinados en los niveles de transcripción y traslación salida del ribosoma, también proporciona mucha mayor sensibilidad en comparación con otros métodos.

Este enfoque se basa en profunda secuenciación de fragmentos de ARNm ribosoma protegido 3. Durante la traducción de proteínas, los ribosomas protegen ~ 28 porciones del nt de los mRNA (llamado huellas) 6. Mediante la determinación de la secuencia de los fragmentos protegidos por el ribosoma, Ribo-Seq puede mapa la posición del ribosoma sobre el ARNm traducidos e identificar qué regiones del mRNA están probables que activamente ser traducido en proteína 3,7. Además, podemos medir cuantitativamente la traducción del mRNA contando el número de huellas que se alinean a una transcripción de mRNA dado.

Para aislar los fragmentos protegidos por el ribosoma, lysates de la célula son inicialmente tratados con un inhibidor de la traducción para atascar los ribosomas seguidos por digestión de la ribonucleasa. Mientras que libres mRNA y porciones de mRNAs traducido no protegidos por los ribosomas son degradadas por la ribonucleasa, los fragmentos de ARNm ribosoma protegidos pueden ser recuperados por purificación complejos ribosoma-huella intacta. Estas huellas de mRNA son entonces convertidas en biblioteca del cDNA y analizaron por secuenciación profunda (figura 1). En paralelo a ribosome profiling, mRNA intacto es extraído de la misma muestra y ordenados. Al comparar el nivel de traducción identificado por Ribo-Seq con mediciones de abundancia del mRNA, podemos identificar los genes que son específicamente para arriba o abajo-regulados a nivel de la traducción y calcular la eficiencia de traducción de mRNA en el nivel de todo el genoma. Mientras que el protocolo descrito en este artículo es específico para la levadura, debe ser también útil para los investigadores que tratan de establecer el protocolo de Ribo-Seq en otros sistemas.

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Protocolo

1. preparación del extracto

  1. Cepas de levadura racha de existencias congeladas solo colonias en placas de YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% glucosa y agar al 2%). Incubar las placas a 30 ° C durante 2 días.
  2. Inocular la levadura de una placa de YPD (uso de una sola Colonia) en 15 mL de medio YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% de glucosa) en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y crecer durante la noche con agitación (200-250 rpm) a 30 ° C.
  3. Cultura de diluir en 500 mL de medio YPD en un matraz estéril de 2 L, por lo que el OD600 < 0.1. Crecer las células de levadura con agitación a 30 ° C durante 3-5 h hasta OD600 = 0,5 (fase de registro medio).
  4. Recoger las células por filtración a través de filtros de la membrana de 0,45 μm utilizando un montaje de filtro de cristal titular. Raspar el precipitado con una espátula, flash congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C. El tamaño esperado de los pellets congelados es ~ 0.2 - 0.5 g.
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido es extremadamente baja temperatura; usar protección adecuada.
  5. Preparar un nuevo tampón de lisis (20 mM Tris-HCl de pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM de MgCl2, cicloheximida de 100 μg/mL, 0,5 mM DTT, 1% Tritón X-100) inmediatamente antes de usar, mantener en hielo.
  6. Poner 3 bolas de acero cromado (3.2 mm) en un tubo de acero inoxidable de 1.8 mL. Enfriado previamente en nitrógeno líquido y agregar pellets congelados, cubrir con una tapa de goma de silicona. Homogeneizar la muestra por cryogrinding de 10 s a 4200 rpm; Repita 10 veces. Enfríe los tubos en nitrógeno líquido durante al menos 10 s entre cada ronda.
    Nota: Es importante mantener siempre la muestra congelada.
  7. Añadir 1 mL de tampón de lisis, mezclar por pipeteo. Transferir a un tubo nuevo de 1,5 mL.
  8. Centrifugar a 20.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Mientras trabajaba en el hielo, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Transfiera 100 μL de lisado a un nuevo tubo de 1,5 mL para aislamiento del mRNA de poly(A). Proceder de inmediato al aislamiento de RNA o flash congele el tubo en nitrógeno líquido. Medida OD260 del resto del lisado, que se utilizará para la extracción de la huella y flash congelar los tubos en nitrógeno líquido. Tienda los lisados a-80 ° C.

2. huella extracción

  1. Preparación de gradientes de sacarosa
    1. Prepare soluciones de 50%, 40%, 30%, 20% y 10% de sacarosa en tampón gradiente (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, cicloheximida de 100 μg/mL, 0,5 mM DTT).
    2. Pipetee 2,2 mL de la solución de sacarosa de 50% preparado en la parte inferior del tubo polyallomer 13,2 mL pared delgada y la congelación de la solución durante 10 minutos a-80 ° C (figura 2). Luego capa 2,2 mL de tampón de sacarosa de 40% en la parte superior del búfer de sacarosa 50% congelado y congelación durante 10 minutos a 80 ° C. Siguiendo las mismas instrucciones, capa 30%, y 20% y finalmente 10% sacarosa neutraliza encima uno del otro. Evitar burbujas de aire mientras que la estratificación. No los gradientes a-80 ° C hasta su uso. Los gradientes de sacarosa deben ser preparados al menos un día antes del experimento y guardados a-80 ° C.
  2. Digestión de la nucleasa
    1. Descongelar los gradientes de sacarosa la noche antes de los experimentos a 4 ° C.
    2. Descongelar el lisado (huella muestra de células) en el hielo. Transferir una alícuota de 50 OD260 unidades a un nuevo tubo de 1,5 mL de lisado de células y añadir tampón de lisis fresco hasta 1 mL. Tienda el restante lisado a-80 ° C. Añada 10 μL Rnasa I (100 U/μL) e incubar 1 h a temperatura ambiente con rotación suave en un rotador de la cabeza encima de tacones.
    3. (Opcional) Aclarar las muestras a 20.000 x g durante 5 min a 4 ° C y recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mL.
  3. Ultracentrifugación
    1. Suavemente la capa lisadas muestras en la parte superior de un gradiente de sacarosa 10-50%.
    2. Ultracentrífuga el polyallomer tubos a 210.000 x g (35.000 rpm) a 4 ° C por 3 h con rotor SW 41 Ti.
  4. Configuración del sistema gradiente fraccionamiento
    1. Encienda los componentes y el monitor UV a calentamiento durante al menos 30 minutos.
    2. Si utilizando un software grabador digital, inicie el software en el equipo, establecer límites de escala del gráfico -0.01 y 1.
    3. Llene la jeringa con la solución de Chase (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% de sacarosa), eliminar las posibles burbujas de aire dentro de la jeringa y cánula.
    4. Instale un tubo de ultracentrífuga con agua libre de ARNasa. Perforar el tubo con la cánula hasta que se observan dos marcas negras. Arrancar la bomba de jeringa de 1 mL/min.
    5. Cuando el agua pasa por la celda de flujo, pulsa el botón "Auto Zero" en el monitor UV para ajustar la línea de base 0. Ajustar la sensibilidad del monitor UV a "2.0 AU". Después de que se ha establecido una línea de base estable, parar la bomba de jeringa. Recuperar la solución de Chase y retire el tubo de ultracentrífuga.
  5. Aislamiento monosome
    1. Instalar y perforar el tubo de ultracentrífuga que contiene el gradiente de sacarosa. Arrancar la bomba de jeringa de 1 mL/min, recoger fracciones de 1 mL Control un valor de254 . Fracciones que representa el pico de monosome de los años 80 en un tubo de la piscina, mantenga en hielo (figura 3).
    2. Una vez que Chase solución alcanza la célula de flujo, parar la bomba de jeringa. Solución de Chase se recuperan y retire el tubo de ultracentrífuga. Repita el fraccionamiento para el resto de las muestras a partir paso 2.5.1.
      Nota: Cuando termine, limpie el sistema de fraccionamiento con al menos 30 mL de agua libre de ARNasa. Lave muy bien los tubos, jeringas y todos los componentes extraíbles con agua tibia.
    3. Filtrar las fracciones a través de Filtros centrífugos de 0.5 mL (100 kDa MWCO) a 12.000 x g durante 10 min a 4 º C y desechar el flujo a través, repita hasta que el volumen es < 100 μL. Añadir 400 μL de tampón de liberación (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, inhibidor de Rnasa U/mL 40). Mezclar por pipeteo, incubar en hielo 10 min y transferir la unidad a un tubo nuevo de colección. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y recoger el flujo a través.
  6. Purificación del fragmento de huella
    1. Transferir el flujo que contiene huella fragmentos de ARN que tubo un nuevo 1,5 mL, añadir 20 μL de SDS (a una concentración final de 1%), mezclar mediante pipeteo del 20%.
    2. Agregar 1 volumen de ácido-fenol: cloroformo (pH 4.5), vortex por 10 s.
      PRECAUCIÓN: El ácido-fenol: cloroformo es tóxico, evitar el contacto con la piel y la inhalación.
    3. Calentar a 65 ° C durante 5 minutos, poner en hielo durante 1 minuto centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo de 1,5 mL.
    4. Precipitar fragmentos de ARN de la huella mediante la adición de 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%.
Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.

3. Poly(A) extracción de ARNm

  1. Extracción de RNA total
    1. Descongelar una alícuota de 100 μL de lisado de células (muestra deARN Total ) en el hielo, añadir 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 y 20 μL de SDS (a una concentración final de 1%), mezclar mediante pipeteo del 20%.
    2. Agregar 1 volumen (400 μL) de ácido-fenol: cloroformo (pH 4.5) y vortex por 10 s.
    3. Calentar a 65 ° C durante 5 minutos, poner en hielo durante 1 minuto centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo de 1,5 mL.
    4. Realizar una segunda extracción del fenol. Agregar 1 volumen de ácido-fenol: cloroformo (pH 4.5), vórtice de calor s. 10 a 65 ° C durante 5 minutos, poner en hielo durante 1 minuto centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 1,5 mL.
    5. Precipitar el ARN. Para esto agregue volumen 1/10 de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
  2. Aislamiento del mRNA de Poly(A)
    1. Centrifugar las muestras de RNA a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet por 5 min.
    2. Disolver los pellets en 300 μL de tampón de lisis/atascamiento del kit del aislamiento del mRNA del poly(A). Proceder a la extracción de ARNm de poly(A) según protocolo poly(A) mRNA aislamiento kit del fabricante.
    3. Precipitar las muestras de mRNA mediante la adición de 1/10 volumen de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
  3. fragmentación de mRNA
    1. Centrifugar las muestras de mRNA a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Girar por 30 segundos, retire el resto de etanol con una carga de gel punta y aire seco el precipitado durante 5 minutos.
    2. Resuspender el mRNA en 18 μL de agua libre de ARNasa, añadir 2 μL de 10 x buffer de fragmentación de RNA. Incubar 5 min a 94° C. Transferencia de tubo de hielo.
    3. Precipitar al añadir volumen 1/10 de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.

4. desfosforilación

  1. Tratar la huella y fragmentada muestras de mRNA con la cinasa de T4 Polinucleótido. Para ello, centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto del etanol con un gel de carga punta. Secar el pellet por 5 min.
  2. Resuspender el precipitado en 7,75 μl de agua, añadir 1 μl de 10 x T4 Polinucleótido quinasa buffer, 1 μl de T4 kinase de Polinucleótido (10.000 U/mL) y 0.25 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL). Incubar 1 h a 37 ° C.
  3. (Opcional) Funcionamiento previo un gel de TBE urea 15% en 180 V durante 15 minutos usando buffer de x TBE 1.
  4. Añadir 10 μl de 2 X tampón TBE urea a 10 μl de cada muestra de huella y mRNA. Preparar una muestra de control que contiene 1 μl de 10 μm tamaño superior marcador de oligonucleótidos (32 nt), 1 μl de 10 μm menor tamaño marcadores oligonucleótidos (28 nt), 8 μl de agua y 10 μl de 2 x tampón TBE urea para las muestras de la huella. Preparar una muestra de control que contiene 1 μl de 10 μm RNA marcador de oligonucleótidos (63 nt), 9 μl de agua y 10 μl de 2 x tampón TBE urea para las muestras de mRNA.
  5. Incubar las muestras y controles 3 minutos a 75 ° C, girar hacia abajo, poner en hielo para 1 minuto de carga cada muestra en 2 pocillos del gel de TBE urea 15%, separados los fragmentos de ARN por electroforesis en gel en 180 V durante 1 hora.
  6. Mancha el gel durante 5 minutos con una mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído en agua), protegen de la luz.
  7. Utilizando un transiluminador de luz azul, corta la banda apropiada entre los 28 y 32 marcadores de nt para las muestras de la huella (Figura 4A) y alrededor 50-70 nt para mRNA muestras (Figura 4B) con una cuchilla de limpiar. Congelar las piezas de gel de poliacrilamida a-80 ° C durante al menos 10 minutos.
  8. Extracto de RNA del gel de poliacrilamida como sigue. Calentar las piezas de gel a 70 ° C por 2 min, triturar el gel utilizando morteros de pellets disponibles. Eluir el RNA con tampón de elución de 300 μL (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA) y agregar inhibidor de Rnasa de 1 μl (20 U/μL), incubar a 37 ° C durante 3 h.
  9. Centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y precipitado por adición de 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.

5. 3' adaptador ligadura

  1. Centrifugar las muestras de la huella y mRNA a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel. Secar el pellet por 10 minutos.
  2. Resuspender el precipitado en 4,75 μl de agua libre de nucleasa, 2 μl de 50% PEG8000, 1 μl de 10 X T4 RNA ligasa buffer, 1 μl de 3'-adaptador (100 ng/μL), 0.25 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL), 1 μl de ligasa de T4 RNA 2 truncado KQ (200.000 U/mL). Incubar durante una noche a 16 ° C.
  3. A la mañana siguiente, retirar el exceso de adaptador mediante la adición de 0,5 μl de 5'-deadenylase (10 U/μL) y 0,5 μl de exonucleasa Rec J (10 U/μL) directamente a la reacción de ligadura. Incubar durante 30 min a 30 ° C.
  4. Precipitar las muestras. Para ello, Añadir 30 μl de agua libre de nucleasa, 1 glucógeno μl (10 mg/mL), 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.

6. transcripción reversa

  1. Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel. Secar el pellet por 10 minutos.
  2. Resuspender el precipitado en 11.5 μl de agua libre de nucleasa, Añadir 0,5 μl de la cartilla de reversa de la transcripción de 8 μm (cartilla de RT) y 1 μl de mezcla de dNTP (10 mM). Incubar por 5 min a 65 ° C, colocar en hielo.
  3. Añadir 4 μL de 5 X buffer primera línea, 2 μl de 0,1 M TDT, 0.5 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL), 0.5 μl de transcriptasa reversa (200 U/μL). Incubar durante 30 min a 48 ° C, 1 min a 65 ° C, 5 minutos a 80 ° C.
  4. No precipitan y proceder de inmediato a la hidrólisis de ARN mediante la adición de 0,8 μl de 2 M NaOH, incubar 30 minutos a 98 º C. Agregar 0,8 μl 2M HCl para neutralizar la reacción.
  5. Precipitar las muestras.
Para ello, añadir 20 μl de agua libre de nucleasa, 1 glucógeno μl (10 mg/mL), 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
  • Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel. Secar el pellet por 10 minutos.
  • Resuspender el precipitado en 5 μl de agua libre de nucleasa, añadir 5 μl de 2 X tampón TBE urea. Incubar 3 minutos a 75 ° C, girar hacia abajo, poner en hielo durante 1 minuto.
  • (Opcional) Funcionamiento previo un gel de TBE urea 10% en 180 V durante 15 min con 1 buffer X TBE.
  • Cargar la muestra en 1 pozo del gel de TBE urea 10%. Separar los productos de la reacción de transcripción reversa por electroforesis en gel en 180 V durante 50 minutos. Como control, preparar una muestra que contiene 1 μl de cebador de RT de 2,5 μm, 1 μl de 2.5 μm 128 nt marcadores oligonucleótidos, 3 μl de agua, y 5 μl de 2 X TBE urea-buffer de la muestra y correr en un carril separado del gel.
  • Mancha el gel durante 5 minutos con una mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído en agua), protegen de la luz. Utilizando un transiluminador de luz azul, corta la banda alrededor de 128 nt y superior (figura 5) con una cuchilla de limpieza. Congelar las piezas de gel de poliacrilamida a-80 ° C durante al menos 10 minutos.
  • Calentar las piezas de gel a 70 ° C por 2min, triturar el gel utilizando morteros de pellets disponibles. Eluir el ADN con 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 e incubar a 37 ° C durante 3 h.
  • Centrifugar la muestra a 12.000 x g, 5 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y precipitado por adición de 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.

    • 7. circularización

    1. Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet por 10 minutos.
    2. Resuspender el precipitado en 16.75 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 2 μl de 10 x buffer ligasa de monocatenario DNA (ssDNA), 1 μl de 50 mM MnCl2, 0.25 μl de ssDNA ligasa (100 U/μL). Incubar durante 1 h a 60 ° C, 10 minutos a 80 ° C. No precipitan y almacenar el producto de reacción de la ligadura de ssDNA a-20 ° C.

    8. PCR amplificación de biblioteca

    1. Mientras trabajo en el hielo, mezcla lo siguiente en un tubo PCR: 146 μl de agua libre de nucleasa, 2 μl de cebador Forward de 20 μm, 2 μl de 20 μm indexadas revertir la cartilla, 40 μl de 5 x buffer de plymerase de ADN de alta fidelidad, 4 μL de dNTPs (10 mM), 4 μL del producto de reacción de la ligadura de ssDNA y 2 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Elegir un primer indexadas revertir diferentes para cada muestra que va ser multiplexado para secuenciación. Transferir una alícuota de 50 μl de la mezcla PCR en 4 nuevos tubos PCR.
    2. Realizar la amplificación por PCR con número variable de ciclos (8, 10, 12, 14) con la siguiente configuración:
      1 min a desnaturalización inicial de 98 ° C
      ciclos de 8 a 14:
      15 s a 94 ° C
      5 s a 55 ° C
      10 s a 65 ° C
      2 min a 65 ° C extensión final
    3. Precipitar el producto PCR mediante la adición de 1/10 volumen de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
    4. Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet.
    5. Resuspender el precipitado en 8 μl de agua libre de nucleasa, añadir 2 μl de no desnaturalizar 5 x buffer de muestras de ácidos nucleicos. Cargar la muestra en 1 bien de gel 8% TBE no desnaturalizantes. Separar los productos de ADN por electroforesis en gel de 150 V durante 35 minutos. Como control, preparar una muestra que contiene 0,5 μl de escalera de ADN de 10 bp (1 μg/μl), 7.5 de μl de agua y 2 μl de no desnaturalizar 5 x buffer de muestras de ácido nucleico y ejecutar en un carril separado del gel.
    6. Mancha el gel durante 5 minutos con una mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído en agua), protegen de la luz. Utilizando un transiluminador de luz azul, corta la banda alrededor de 150 bp para las muestras de la huella y alrededor 180 bp para muestras de mRNA (figura 6) con una cuchilla de limpieza. Guarde las piezas de gel a-80 ° C durante al menos 10 minutos.
    7. Calentar las piezas de gel a 70 ° C por 2 min, triturar el gel utilizando morteros de pellets disponibles. Eluir el ADN con 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 e incubar a 37 ° C durante 3 h.
    8. Centrifugar la muestra a 12.000 x g, 5 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y precipitado por adición de 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
    9. Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet. Finalmente, suspender las bibliotecas en 20 μl de agua libre de nucleasas y proceder a la cuantificación, control de calidad y secuencia.

    9. Biblioteca cuantificación y secuenciación de alto rendimiento

    1. Antes de enviar las muestras para la secuencia, determinar el rendimiento y la calidad de la polimerización en cadena-amplificados de la bibliotecas. Perfiles representativos de huella y las bibliotecas de la secuencia de ARNm se muestran en la figura 7. El tamaño esperado de la biblioteca de la polimerización en cadena-amplificada es bp 148-152 para las muestras de la huella y 170-190 bp para muestras de mRNA.
    2. Si varias muestras con códigos de barras diferentes se agruparon para la secuencia, realizar cuantificación precisa de las bibliotecas usando un análisis de cuantificación de biblioteca de secuencia de la qPCR.
    3. Las bibliotecas en proporciones equimolares de la piscina. Calcular el volumen total de la piscina como 3 μl x número total de muestras a ser agrupados. Determinar el volumen de cada biblioteca que debe añadirse para que las bibliotecas se mezclan en las proporciones equimolares a alcanzar la concentración final de 10 nM de la piscina. Agregar el volumen calculado de cada biblioteca en un nuevo tubo de 1.5 mL, mezclar mediante pipeteo. Añadir agua para conseguir el volumen total calculado. Almacenar bibliotecas combinadas a-20 ° C.
    4. Enviar una alícuota de la biblioteca agrupada para ser secuenciados utilizando 50 secuenciación del solo-fin bp ejecuta en una plataforma de secuenciación Illumina. Nos rutinariamente múltiplex 12 muestras en una sola secuencia ejecutar, qué rendimientos ~ 200 millones Lee por carril de secuenciación.
      Nota: El número de lecturas de la huella recogida por cada muestra depende de la cantidad de material de entrada y el nivel de contaminación de rRNA.

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    Resultados

    Tuberías detalladas para el análisis Bioinformático de ribosome profiling datos han sido descritos 8,9. Además, varios grupos de investigación han desarrollado herramientas bioinformáticas para el análisis de expresión génica diferencial y tratamiento de los datos de la secuencia, que son específicos para ribosome profiling método 10,11,12

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    Discusión

    El enfoque de Ribo-Seq ha emergido como una tecnología de gran alcance para el análisis de mRNA traducción en vivo en el nivel 3de todo el genoma. Estudios con este enfoque, que permite el control de traducción con codón solo resolución, ha contribuido a nuestra comprensión de la regulación traduccional. A pesar de sus ventajas, Ribo-Seq tiene varias limitaciones. Fragmentos de ARN ribosómico (ARNr) son siempre Co purificados durante el aislamiento de huellas protegido ribosoma disminuyen...

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    Divulgaciones

    Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

    Agradecimientos

    Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de becas en salud AG040191 y AG054566 a VML. Esta investigación se llevó a cabo mientras VML recibió una beca de investigación lejos de la American Federation for Aging Research.

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    0,45 μ Filtros de membranaM MilliporeHVLP04700
    0,5 M EDTAInvitrogenAM9261
    0,5 mL filtros centrífugos (100 kDa MWCO)MilliporeUFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7,0InvitrogenAM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4 grados; C)Invitrogen15567-027
    10X Tampón TBEInvitrogenAM9863
    10% TBE-urea gelInvitrogenEC6875BOX
    15% TBE-ureagel InvitrogenEC6885BOX
    2 M MgCl2RPIM24500-10.0
    2X TBE-urea tampón de muestraInvitrogenLC6876
    3M NaOAc, pH 5.5InvitrogenAM9740
    5' Deadenylasa (10 U/μ L)EpicentroDA11101K
    5X Tampón de carga de muestras de ácido nucleicoBio-Rad161-0767
    8% TBE gelInvitrogenEC6215BOX
    Ácido-Fenol:Cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)InvitrogenAM9722
    Transiluminador de luz azulClare Chemical ResearchDR-46B
    Perlas de cromo-acero, 3,2 mmProductos BioSpec11079132c
    Criomolinillo ProductoBiospec3110BX
    CicloheximidaRPIC81040-5.0
    Sistema de adquisición de datosDATAQ InstrumentsDI-245
    Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (10 mM)NEBN0447L
    GlycogenInvitrogenAM9510
    Sistema de fraccionamiento en gradienteBrandelBR-184X
    ADN polimerasa de alta fidelidad (2.000 U/mL)NEBM0530SSuministrado con 5X Phusion HF
    Buffer Kit de cuantificación de biblioteca de secuenciación de última generaciónKapa BiosystemsKK4824
    Tinción de gel de ácido nucleicoUltracentrífuga InvitrogenS11494
    Optima XE-90Beckman CoulterA94471
    Kit de aislamiento de ARNm Poly(A)Invitrogen61011
    Rec J exonucleasa (10 U/μ L)EpicentroRJ411250
    transcriptasa inversa (200 U/μ L)Invitrogen18080093suministrado con tampón de primera cadena 5X y tampón de fragmentación de ARN DTT de 0,1 M
    NEBE6186A
    RNasa I (100 U/μ L)InvitrogenAM2295
    Inhibidor de la RNasa (20 U/μ L)InvitrogenAM2696
    Tapas de caucho de siliconaBioSpec Products2008
    ssDNA ligasa (100 U/μ L)EpicentroCL9021KSuministrado con tampón CircLigase II 10X y microviales de acero inoxidable de 50 mM 2
    , 1,8 mLProductos BioSpec2007
    SacarosaRPIS24060-5000.0
    SW-41 Rotor TiBeckman Coulter331362
    bomba de jeringaNew Era Sistemas de bombeoNE-300
    Polinucleótido quinasa T4 (10.000 U/mL)NEBM0201SSuministrado con 10X T4 tampón de polinucleótido
    quinasa T4 ARN ligasa 2 truncado KQ (200.000 U/mL)NEBM0373SSuministrado con tampón de ARN ligasa T4 10X y 50% PEG8000
    TermocicladorBio-Rad1851148
    Tubos de polialómero de pared delgada, 13,2 mLBeckman Coulter331372
    Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
    Monitor UVBio-Rad7318160
    Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741Open BiosystemsYSC1048

    Referencias

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