Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Resumen

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Resumen

Traducción de mRNA en las proteínas es un proceso complejo que involucra varias capas de regulación. A menudo se asume que cambios en la transcripción del mRNA reflejan cambios en la síntesis de proteínas, pero se han observado muchas excepciones. Recientemente, una técnica llamada ribosoma perfiles (o Ribo-Seq) ha surgido como un método eficaz que permite la identificación, con gran precisión, que las regiones de ARNm se traducen en proteínas y cuantificación de la traducción a nivel de todo el genoma. Aquí, presentamos un protocolo generalizado para la cuantificación del genoma de la traducción con Ribo-Seq en levadura de florecimiento. Además, combinando datos de Ribo-Seq con mediciones de abundancia de ARNm permite al mismo tiempo cuantificar la eficiencia de la traducción de miles de transcripciones del mRNA en la misma muestra y comparar cambios en estos parámetros en respuesta a experimental manipulaciones o en los diferentes Estados fisiológicos. Se describe un protocolo detallado para la generación de huellas de ribosoma mediante digestión de nucleasa, aislamiento de complejos ribosoma-huella intacta vía fraccionamiento gradiente de sacarosa y la preparación de las bibliotecas de ADN para secuenciación profunda junto con el apropiado controles de calidad necesarios para asegurar un análisis preciso de la traducción en vivo .

Introducción

traducción del mRNA es uno de los procesos fundamentales en la célula, que desempeña un papel importante en la regulación de la expresión de la proteína. Por lo tanto, traducción del mRNA es firmemente controlada en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos internos y externos ^1,2. Sin embargo, los mecanismos de regulación traduccional siendo estudiados. Aquí, describimos el protocolo para la cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por ribosome profiling. El objetivo general de la técnica de generación de perfiles de ribosoma es estudiar y cuantificar la traducción de mRNAs esp....

Protocolo

1. preparación del extracto

1. Cepas de levadura racha de existencias congeladas solo colonias en placas de YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% glucosa y agar al 2%). Incubar las placas a 30 ° C durante 2 días.
2. Inocular la levadura de una placa de YPD (uso de una sola Colonia) en 15 mL de medio YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% de glucosa) en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y crecer durante la noche con agitación (200-250 rpm) a 30 ° C.
3. Cultura de diluir en 500 mL de medio YPD en un matraz estéril de 2 L, por lo que el OD₆₀₀ < 0.1. Crecer las células de levadura con agitación a 30 ° C durante 3-5 h ....

Resultados

Tuberías detalladas para el análisis Bioinformático de ribosome profiling datos han sido descritos ^8,9. Además, varios grupos de investigación han desarrollado herramientas bioinformáticas para el análisis de expresión génica diferencial y tratamiento de los datos de la secuencia, que son específicos para ribosome profiling método ^10,11,12

Discusión

El enfoque de Ribo-Seq ha emergido como una tecnología de gran alcance para el análisis de mRNA traducción en vivo en el nivel ³de todo el genoma. Estudios con este enfoque, que permite el control de traducción con codón solo resolución, ha contribuido a nuestra comprensión de la regulación traduccional. A pesar de sus ventajas, Ribo-Seq tiene varias limitaciones. Fragmentos de ARN ribosómico (ARNr) son siempre Co purificados durante el aislamiento de huellas protegido ribosoma disminuyen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,45 μ Filtros de membrana	M Millipore	HVLP04700
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9261
0,5 mL filtros centrífugos (100 kDa MWCO)	Millipore	UFC510024
1 M Tris-HCl, pH 7,0	Invitrogen	AM9850G
1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4 grados; C)	Invitrogen	15567-027
10X Tampón TBE	Invitrogen	AM9863
10% TBE-urea gel	Invitrogen	EC6875BOX
15% TBE-urea	gel Invitrogen	EC6885BOX
2 M MgCl2	RPI	M24500-10.0
2X TBE-urea tampón de muestra	Invitrogen	LC6876
3M NaOAc, pH 5.5	Invitrogen	AM9740
5' Deadenylasa (10 U/μ L)	Epicentro	DA11101K
5X Tampón de carga de muestras de ácido nucleico	Bio-Rad	161-0767
8% TBE gel	Invitrogen	EC6215BOX
Ácido-Fenol:Cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)	Invitrogen	AM9722
Transiluminador de luz azul	Clare Chemical Research	DR-46B
Perlas de cromo-acero, 3,2 mm	Productos BioSpec	11079132c
Criomolinillo Producto	Biospec	3110BX
Cicloheximida	RPI	C81040-5.0
Sistema de adquisición de datos	DATAQ Instruments	DI-245
Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (10 mM)	NEB	N0447L
Glycogen	Invitrogen	AM9510
Sistema de fraccionamiento en gradiente	Brandel	BR-184X
ADN polimerasa de alta fidelidad (2.000 U/mL)	NEB	M0530S	Suministrado con 5X Phusion HF
Buffer Kit de cuantificación de biblioteca de secuenciación de última generación	Kapa Biosystems	KK4824
Tinción de gel de ácido nucleico	Ultracentrífuga Invitrogen	S11494
Optima XE-90	Beckman Coulter	A94471
Kit de aislamiento de ARNm Poly(A)	Invitrogen	61011
Rec J exonucleasa (10 U/μ L)	Epicentro	RJ411250
transcriptasa inversa (200 U/μ L)	Invitrogen	18080093	suministrado con tampón de primera cadena 5X y tampón de fragmentación de ARN DTT de 0,1 M
	NEB	E6186A
RNasa I (100 U/μ L)	Invitrogen	AM2295
Inhibidor de la RNasa (20 U/μ L)	Invitrogen	AM2696
Tapas de caucho de silicona	BioSpec Products	2008
ssDNA ligasa (100 U/μ L)	Epicentro	CL9021K	Suministrado con tampón CircLigase II 10X y microviales de acero inoxidable de 50 mM 2
, 1,8 mL	Productos BioSpec	2007
Sacarosa	RPI	S24060-5000.0
SW-41 Rotor Ti	Beckman Coulter	331362
bomba de jeringa	New Era Sistemas de bombeo	NE-300
Polinucleótido quinasa T4 (10.000 U/mL)	NEB	M0201S	Suministrado con 10X T4 tampón de polinucleótido
quinasa T4 ARN ligasa 2 truncado KQ (200.000 U/mL)	NEB	M0373S	Suministrado con tampón de ARN ligasa T4 10X y 50% PEG8000
Termociclador	Bio-Rad	1851148
Tubos de polialómero de pared delgada, 13,2 mL	Beckman Coulter	331372
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Monitor UV	Bio-Rad	7318160
Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741	Open Biosystems	YSC1048